張海毅

（威海職業(yè)（技術）學院，山東威海 264210）

洗滌條件對重組TATm-survivin(T34A)包涵體純度的影響

張海毅

（威海職業(yè)（技術）學院，山東威海 264210）

目的：確定重組TATm-survivin(T34A)包涵體的洗滌條件。方法：將補料分批發(fā)酵得到的重組大腸桿菌破碎，得到TATm-survivin(T34A)粗制包涵體，探索pH、化學物質、尿素濃度、洗滌次數(shù)對包涵體洗滌的影響。結果：得到重組TATmsurvivin(T34A)包涵體的最佳洗滌條件為洗滌液成分為pH10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），內含100μmol/L巰基乙醇、0.5%Triton X-100、0.5mol/L尿素、1mol/L氯化鈉和2.5mmol/L EDTA；洗滌次數(shù)為4次。結論：利用優(yōu)化的洗滌條件進行洗滌后，包涵體的純度達到85%左右，整體的回收率達到80%以上。

重組TATm-survivin(T34A)；包涵體；洗滌條件

重組抗癌藥物TATm-survivin(T34A)經大腸桿菌表達純化后，能夠進入細胞內部發(fā)揮作用，誘導腫瘤細胞的凋亡，具有進一步研發(fā)的價值和良好的產業(yè)化前景[1-2]。然而，在搖瓶到生物反應器的放大過程中發(fā)現(xiàn)，搖瓶優(yōu)化的包涵體純化復性方法已經不適用于發(fā)酵罐中得到的包涵體，按照原純化方法得到的重組蛋白純度明顯下降，大大影響了重組蛋白的質量。

TATm-survivin(T34A)重組大腸桿菌發(fā)酵后，表達的TATm-survivin(T34A)以不溶物聚集物即包涵體的形式存在，需要在體外對TATm-survivin(T34A)包涵體進行復性。包涵體的處理過程包括包涵體收集、純化和復性。為得到較為純化的包涵體蛋白，需要對包涵體進行洗滌。洗滌同時還可以去除大腸桿菌外膜蛋白OmpT（37kDa），后者在4～8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性，在包涵體的溶解和復性過程中可導致重組蛋白質的降解[3]。研究表明，包涵體的純度越高，越有利于后續(xù)的純化和復性[4]，所以包涵體的洗滌非常重要，不可忽視。針對上述重組抗癌藥物TATm-survivin(T34A)放大過程中出現(xiàn)的問題，發(fā)現(xiàn)補料分批培養(yǎng)得到的粗制包涵體，與比搖瓶中雜蛋白多，增加了包涵體洗滌的難度，因此有必要摸索包涵體洗滌的最佳條件，為后續(xù)包涵體的純化復性提供高純度的精制包涵體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

TATm-survivin(T34A)重組大腸桿菌細胞：補料分批發(fā)酵后得到的菌體，具體發(fā)酵條件參考[5]。

1.2 實驗方法

1.2.1 包涵體的制備

將補料分批發(fā)酵后得到的細胞培養(yǎng)液于8 000r/min、4℃下離心10min收集菌體。稱取3g濕菌體懸浮于20mL細胞破碎液（20mmol/L Tris-HCl，pH=7.5）中，超聲破碎150次（400W，開3s，停3s），于8 000r/min、4℃下離心10min，得到的沉淀為粗包涵體。將粗包涵體重懸于不同包涵體洗滌液中洗滌，于8 000r/min、4℃下離心10min，重復此步收集沉淀為精制包涵體。

1.2.2 包涵體的洗滌

將粗包涵體重懸于不同包涵體洗滌液中洗滌，于8 000r/min、4℃下離心10min，重復此步收集沉淀為精制包涵體。

1.2.3 包涵體的溶解

將精制包涵體溶解于10mL 8mol/L尿素溶液（20mmol/L Tris-HCl，pH8.5，內含 100μmol/L巰基乙醇）中，振蕩混合。于8 000r/min、4℃下離心15min，去掉少量不溶物，上清即為溶解的包涵體，于4℃保存。

1.2.4 包涵體純度的測定

SDS-PAGE的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，以考馬斯亮藍R-250染色顯示蛋白條帶，進行掃描定量。

1.2.5 蛋白濃度的測定

蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍染色法（Bradford）[6]，BSA為標準品。

2 結果與討論

本研究以1mol/L氯化鈉和2.5mmol/L EDTA溶液作為基礎洗滌液。選擇這兩種物質作為基礎成分，一方面這兩種物質在洗滌過程中不會溶解目標蛋白，另一方面高鹽洗滌可以去掉雜蛋白污染物，同時又提高了溶液的離子強度，增加了去垢能力，EDTA則可以用來抑制金屬蛋白酶。在此基礎上對包涵體洗滌液pH、化學物質、尿素濃度及洗滌次數(shù)進行了優(yōu)化。

2.1 洗滌緩沖液pH值對包涵體洗滌效果的影響

配制不同pH的緩沖液，即磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（20mmol/L，pH=7.0）、Tris-HCl緩沖液（20mmol/L，pH=8.0）、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L，pH=9.0，pH10.0）。洗滌緩沖液pH值對包涵體洗滌效果的影響結果見圖1和圖2。從圖中可以很明顯地看出，隨著洗滌液pH的升高，更多的雜蛋白被去除，包涵體的純度增加，上清液中也有少許目標蛋白損失。當洗滌液pH值為10.0時，包涵體的純度最高（59.6%），目標蛋白有87%被保留?？梢?，極端pH可以起到增溶雜蛋白的作用，有利于包涵體的洗滌。

圖1 pH對包涵體洗滌的影響

圖2 pH對包涵體洗滌收率和純度的影響

2.2 化學物質對包涵體洗滌效果的影響

配制pH=10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），分別添加100μmol/L巰基乙醇、0.5%Triton X-100、0.001% SDS進行洗滌，結果如圖3所示。從圖3可以看出，與對照相比，這3種物質對包涵體的洗滌效果均有促進作用。其中，添加巰基乙醇洗滌后，包涵體純度達到65.8%，添加Triton X-100和SDS后，包涵體純度分別為62.8和63.2%。巰基乙醇作為一種還原劑，常常用來打開包涵體中含有的一些鏈間二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵；非離子型去垢劑Triton X-100用來去除不溶的膜碎片和膜蛋白；陰離子去污劑SDS可以破壞蛋白的疏水鍵，去除通過疏水作用與包涵體結合的雜質。殘留的SDS在隨后的分離純化中不易徹底去除，而且在洗滌效果上與Triton X-100相當，因此在洗滌液中不添加SDS，只添加巰基乙醇和Triton X-100。

圖3 化學物質對包涵體洗滌收率和純度的影響

2.3 尿素濃度對包涵體洗滌效果的影響

低濃度的變性劑（如尿素）常常被用于包涵體的洗滌。為了進一步提高包涵體的純度，不同濃度的尿素被添加到洗滌液中。配制pH=10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），內含100μmol/L巰基乙醇和 0.5%Triton X-100，分別添加 0.5、1、1.5、2mol/L尿素進行洗滌，結果如圖4所示。從圖4可以看出，隨著尿素濃度的增加，包涵體的純度沒有明顯提高，當尿素濃度從1.5mol/L增加到2mol/L時，目標蛋白收率由98%降到89%，表明包涵體中部分目標蛋白被溶解。因此，選擇添加尿素濃度為0.5mol/L。經過一系列的優(yōu)化后，最終的包涵體洗滌液組分為pH=10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（20mmol/L），內含100μmol/L巰基乙醇、0.5%Triton X-100、0.5mol/L尿素、1mol/L氯化鈉和2.5mmol/L EDTA。

圖4 尿素濃度對包涵體洗滌收率和純度的影響

2.4 洗滌次數(shù)對包涵體洗滌效果的影響

采用上述優(yōu)化后的洗滌液配方洗滌包涵體，并考察了洗滌次數(shù)對包涵體純度和收率的影響，結果如圖5、圖6所示。從圖中可以看出，當洗滌次數(shù)從1次增加到3次時，包涵體的純度并沒有明顯增加，繼續(xù)增加洗滌次數(shù)，包涵體的純度有了明顯的提高；洗滌4次和洗滌5次相比，包涵體純度變化不大（從83.9%增加到85.6%），而目標蛋白的損失增加（94%降低到83%）。由此確定最佳洗滌次數(shù)為4次。

圖5 洗滌次數(shù)對包涵體洗滌的影響

圖6 洗滌次數(shù)對包涵體洗滌收率和純度的影響

3 結論

經過優(yōu)化的洗滌液配方4次洗滌后，包涵體的純度達到85%左右，整體的回收率達到80%以上。將洗滌后的精制包涵體溶解于8mol/L尿素中，溶解后的最大蛋白濃度約為4mg/mL，目標蛋白的回收率大于95%。

[1]鄭文云,馬興元,魏東芝,等.重組HIV-TATm-Survivin(T34A)蛋白制備及其促癌細胞凋亡活性研究[J].生物工程學報,2006,22(2):285-292.

[2]Ma X,Zheng W,Wei DZ,et al.Construction,expression,and purification of HIV-TAT-survivin (T34A) mutant:a pro-apoptosis protein in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2006,47(1):36-44.

[3]方敏,黃華樑.包涵體蛋白體外復性的研究進展[J].生物工程學報,2001,17(6):608-612.

[4]王增,馬會勤,張文,等.包涵體蛋白的分離和色譜法體外復性純化研究進展[J].中國生物工程雜志,2009,29(7):102-107.

[5]Haiyi Zhang,Yu Zheng,Qinghai Liu,et al.Development of a fed-batch process for the production of anticancer drug TATm-survivin(T34A)in Escherichia coli[J].Biochemical Engineering Journal,2009,43(2):163-168.

[6]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

Effect of washing conditions on the purity of recombinant TATm-survivin(T34A)inclusion bodies

Zhang Hai-yi
(Weihai Vocational College，Shandong Weihai 264210)

objective:To determine the washing condition of recombinant TATm-survivin(T34A) inclusion bodies(Ibs).Methods:RecombinantEscherichia colicells obtained from the fed-batch fermentation were disrupted.The crude inclusion bodies were harvested.Different washing conditions were tested to explore the effect on Ibs wash,which included pH,chemical substances,urea concentrations and washing times.Results:The optimal washing condition was determined.The Ibs purgation buffer (20mmol/L glycine-sodium hydroxide buffer of pH 10.0) contained 100μmol/L mercaptoethanol,0.5%Triton X-100,0.5mol/L urea,1mol/L sodium chloride and 2.5mmol/L EDTA.The washing time was optimized to be four.Conclusions:After Ibs wash with the optimal condition,the Ibs purity is calculated to about 85% with a yield of above 80%.

Recombinant TATm-survivin(T34A);Inclusion bodies;Washing conditions

Q81 文獻標志碼：A

2096-0387（2017）06-0018-04

張海毅（1980—），女，山東威海人，博士，講師，研究方向：蛋白質的表達與純化。