陳付涼，涂遠(yuǎn)航，徐長江，嚴(yán)家春

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·論著·

慢性乙型肝炎患者肝組織中CD8 CD28表達(dá)與肝竇病變的關(guān)系

陳付涼1，涂遠(yuǎn)航2，徐長江1，嚴(yán)家春1

目的：探討慢性乙型肝炎(CHB)肝組織中CD8，CD28在肝細(xì)胞中表達(dá)與肝竇病變的關(guān)系。方法：隨機(jī)選擇解放軍第123醫(yī)院肝病中心慢性乙型肝炎患者肝穿刺組織60例，穿刺肝組織采取免疫組化CD8，CD28雙染色法，光鏡觀察其表達(dá)與肝竇病變的關(guān)系。結(jié)果：CD8，CD28陽性表達(dá)與肝竇狹窄、肝竇阻塞、肝竇擴(kuò)張、肝竇毛細(xì)血管化密切相關(guān)。提示，肝竇病變較輕時以細(xì)胞毒性(殺傷性)T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28+分子的表達(dá)占優(yōu)勢；調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28-分子少表達(dá)。隨著肝組織炎癥病變加重，炎癥壞死區(qū)T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28+分子的表達(dá)增強(qiáng)。而當(dāng)肝組織肝竇毛細(xì)血管化較重，壞死修復(fù)并形成纖維間隔帶或纖維瘢痕時則以抑制性(調(diào)節(jié)性)T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28-分子表達(dá)為主。CD8，CD28分子在肝竇狹窄、阻塞、擴(kuò)張、毛細(xì)血管化重度時表達(dá)均最高(P<0.01)。表明T淋巴細(xì)胞CD8，CD28分子的表達(dá)參與慢性乙型肝炎肝竇病變的病理轉(zhuǎn)化。結(jié)論：慢性乙型肝炎肝組織中T淋巴細(xì)胞CD8，CD28分子的表達(dá)變化在肝竇病變的演變中擔(dān)當(dāng)一關(guān)鍵角色。

乙型肝炎，慢性； 肝組織； CD8； CD28； 肝竇

國內(nèi)外學(xué)者對T淋巴細(xì)胞與肝炎的關(guān)系研究甚多，但多局限于外周血淋巴細(xì)胞的表達(dá)來間接反映肝組織的病變。筆者通過對60例CHB患者及10例正常對照組肝組織血管平滑肌肌動蛋白(a-SMA)免疫組織化學(xué)染色，CD8，CD28雙染色，同時光學(xué)顯微鏡觀察肝細(xì)胞肝竇的細(xì)微變化。提示慢性乙型肝炎(CHB)肝細(xì)胞CD8，CD28表達(dá)變化與肝竇病變密切相關(guān)。顯示免疫反應(yīng)不足或過強(qiáng)都會對肝竇及竇周隙造成不同的病理損壞。其表現(xiàn)有肝竇狹窄、擴(kuò)張、阻塞、毛細(xì)血管化等一系列病變(后稱肝竇病變)。本研究旨在觀察肝組織中T淋巴細(xì)胞CD8，CD28分子表達(dá)與肝竇病變的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選擇2011年7月-2015年7月解放軍第123醫(yī)院肝病中心CHB患者60例，男43例，女17例，年齡17～58歲，平均年齡35歲。B超引導(dǎo)下肝臟組織穿刺，獲取的肝組織長度在1.5～2 cm之間。G1，G2的患者稱為CHB輕度，G3，G4分別為CHB中度和重度患者[1]。60例CHB患者病理檢查結(jié)果中，按炎癥程度不同分為G1，G2，G3，G4。其中(G1)13例，(G2)15例，(G3)15例，(G4)17例。另選取正常肝組織10例(正常組)，排除HBAg陽性。所有病例診斷均符合2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂“病毒性肝炎防治方案”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，排除HAV，HCV，HDV和HVE感染，排除近3個月應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、干擾素、胸腺素等影響免疫功能藥物的患者，排除應(yīng)用核昔類似物者，排除酒精性、藥物性、感染中毒性肝損害的患者。

1.2 方法

1.2.1 試劑 免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。兔抗人CD8(CTL/TS)單克隆抗體購自無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司。小鼠抗大鼠CD28 FITC熒光單克隆抗體購自上海雷浩信息科技有限公司。免疫組化雙標(biāo)記試劑盒為美國Zymed公司產(chǎn)品，免疫組化染色的過氧化酶標(biāo)記選用蓮霉卵白素試劑盒為美國Maxin Biotech Inc產(chǎn)品。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理 獲得60例CHB患者肝組織經(jīng)4%甲醛固定、脫水、包埋，4 μm連續(xù)切片，分別做蘇木素-伊紅染色，血管平滑肌肌動蛋白(a-SMA)免疫組化染色和CD8,CD28雙染色，光鏡觀察。

1.2.3 免疫組化染色方法 標(biāo)本石蠟切片使用二甲苯及梯度酒精脫蠟至水洗。每張切片使用50 μL過氧化物酶阻斷溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min。使用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)，分別滴加兔抗人-CD8抗體和鼠抗-CD28抗體(1：1:50)。4℃冰箱過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育25 min，每張切片加入NBT顯色、AEC顯色、DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.2.4 肝細(xì)胞CD8 CD28分子陽性表達(dá)的判定方法[2]觀察CD8,CD28在肝組織中單個核細(xì)胞的染色深淺及分布范圍。不顯色為陰性(-)。染成藍(lán)黑色(CD8+)或紅色(CD28+)呈散在分布為陽性(+)，染色細(xì)胞數(shù)每個高倍視野(400倍)單個核細(xì)胞≤20。單個高倍視野陽性部位細(xì)胞數(shù)>20，呈彌漫性或片狀分布為強(qiáng)陽性(++)。每張切片隨機(jī)選5個高倍鏡視野，計算其陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.5 肝竇病變的評定標(biāo)準(zhǔn)[3-4](1)肝竇狹窄：正常的肝竇間隙被腫脹的肝細(xì)胞所填塞，該病變≤1/2肝小葉者視為較輕(+)，大于1/2肝小葉者視為較重(++)。(2)肝竇阻塞：凡肝竇內(nèi)見有形物質(zhì)(紅細(xì)胞、炎細(xì)胞、淡紅染均勻物質(zhì))阻塞者，其輕重判斷同(1)。(3)肝竇擴(kuò)張：橫徑大于等于1倍正常肝竇橫徑者為較輕(+)，大于1倍以上者為較重(++)。(4)肝竇毛細(xì)血管化：肝竇擴(kuò)張并構(gòu)成毛細(xì)血管樣腔隙且a-SMA染色陽性者，限于灶性壞死周邊或小葉內(nèi)單一表現(xiàn)型為較輕(+)，眾多表現(xiàn)型或單一表現(xiàn)型但有環(huán)繞肝細(xì)胞團(tuán)傾向為較重(++)。若伴內(nèi)皮細(xì)胞固縮或纖維斷裂則稱損傷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察發(fā)現(xiàn)CHB輕者無肝竇擴(kuò)張和毛細(xì)血管化，CHB患者肝組織病變程度與肝竇病變的關(guān)系見表1。表1資料顯示肝組織病變程度與肝竇病變呈正相關(guān)，肝組織炎癥病變重，其肝竇病變亦重,這與徐長江等研究結(jié)果相同[5]，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CD8，CD28分子表達(dá)與CHB肝竇病變的關(guān)系見表2～表5。提示肝竇狹窄、阻塞、擴(kuò)張、毛細(xì)血管化重度其T淋巴細(xì)胞CD8，CD28分子表達(dá)最高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。肝竇和竇周隙是HBV病毒侵入肝實質(zhì)時首先侵入的部位，并在該部位引發(fā)免疫反應(yīng)，即T淋巴細(xì)胞攻擊侵入的病毒，在保護(hù)機(jī)體的同時，如果免疫功能過強(qiáng)會對肝組織造成一定的病理性損傷。本研究提示在肝組織病變初期，肝竇狹窄、阻塞、擴(kuò)張較輕時以細(xì)胞毒性(殺傷性)T淋巴細(xì)胞CD8+,CD28+分子的表達(dá)占優(yōu)勢；調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28-分子少表達(dá)。但與正常對照組相比均增高(表2-表4)。隨著肝組織炎癥病變加重，炎癥壞死區(qū)T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28+分子的表達(dá)增強(qiáng)(如圖1)。而當(dāng)肝組織肝竇毛細(xì)血管化較重，壞死修復(fù)并形成纖維間隔帶或纖維瘢痕時則以抑制性(調(diào)節(jié)性)T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28-分子表達(dá)為主。即CD8陽性細(xì)胞分布范圍擴(kuò)大，CD28陰性或者只單個點狀陽性表達(dá)(如圖2)。本研究還提示CD8，CD28分子表達(dá)多分布在肝組織炎癥壞死區(qū)的肝竇病變區(qū)域，且以細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28+表達(dá)為主。隨著肝組織變性壞死加重，T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28+分子表達(dá)增強(qiáng)，范圍擴(kuò)大(如圖3)。而在肝組織變性壞死修復(fù)中，特別是當(dāng)纖維瘢痕形成時，CD8+，CD28-分子表達(dá)增強(qiáng)(如圖4)。表明T淋巴細(xì)胞CD8，CD28分子參與CHB病理演變?nèi)^程。故CD8，CD28分子表達(dá)與肝竇的病變與破壞相繼存在，其表達(dá)變化與正常對照組及無肝竇病變肝組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 不同肝組織病變與肝竇病變關(guān)系

表2 肝竇阻塞與T淋巴細(xì)胞CD8 CD28分子表達(dá)關(guān)系

圖1 炎癥壞死區(qū)T淋巴細(xì)胞CD8+，CD28+分子的表 圖2 即CD8陽性細(xì)胞分布范圍擴(kuò)大

圖3 壞死重CD8+，CD28+分子強(qiáng)表達(dá) 圖4 肝組織纖維瘢痕形成CD8+，CD28-分子表達(dá)。

表3 肝竇狹窄與T淋巴細(xì)胞CD8 CD28分子表達(dá)關(guān)系

表4 肝竇擴(kuò)張與T淋巴細(xì)胞CD8 CD28分子表達(dá)關(guān)系

表5 肝竇毛細(xì)血管化與T淋巴細(xì)胞CD8 CD28分子表達(dá)關(guān)系

3 討論

乙型肝炎發(fā)病是嗜肝病毒(HBV)侵入，機(jī)體免疫系統(tǒng)(特別是細(xì)胞免疫)對抗病毒引起肝組織及全身損傷的一個過程，故機(jī)體免疫過強(qiáng)或者不足均會導(dǎo)致肝臟損傷。

根據(jù)CD28分子表達(dá)與否，CD8T細(xì)胞分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+,CD28+)和抑制性T細(xì)胞(CD8+,CD28-)，兩者分別是淋巴細(xì)胞中重要的殺傷效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)細(xì)胞。CD8+,CD28+細(xì)胞的丟失和CD8+,CD28-的積聚是T細(xì)胞功能下降的標(biāo)志。如何能使乙肝病毒的復(fù)制對肝組織的損害和機(jī)體的效應(yīng)細(xì)胞的對抗之間維持一種穩(wěn)態(tài)，既可以維持保護(hù)性免疫，又不會對肝組織造成嚴(yán)重性損傷，這是值得深刻研究的問題。之前學(xué)者通過檢測乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞表達(dá)來反應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)和肝組織的損傷情況，但這在一定程度上存在局限性。筆者通過對肝組織直接檢測，光鏡觀察不同病變肝組織與肝竇病變的關(guān)系，同時T淋巴細(xì)胞CD8,CD28分子雙染色，比較肝組織T淋巴細(xì)胞的表達(dá)與肝血竇的病變之間的關(guān)系，從而了解T淋巴細(xì)胞表達(dá)與肝組織損傷之間存在的聯(lián)系。

肝血竇是兩肝板之間特殊的腔隙，是一種特殊的肝臟毛細(xì)血管。肝竇亦是乙肝病毒(HBV)經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝組織首先侵犯并復(fù)制的部位。本組資料提示肝竇狹窄、阻塞較輕時，其CD8+CD28+分子表達(dá)情況多散在分布，每高倍鏡視野單個核細(xì)胞染色陽性在20個以內(nèi)。隨著肝血竇狹窄、阻塞、擴(kuò)張病變加重時，則淋巴細(xì)胞(免疫性T淋巴細(xì)胞)反應(yīng)越強(qiáng)，呈彌漫性或大片狀分布。這與機(jī)體免疫力增強(qiáng)相對應(yīng)。但同時肝組織損傷亦較重。但當(dāng)肝竇損傷達(dá)到一定程度，肝竇毛細(xì)血管化較重，肝組織損傷修復(fù)并形成纖維間隔帶或纖維瘢痕時，則免疫性T細(xì)胞(CD8+,CD28+)陽性表達(dá)，多呈點狀分布，每高倍鏡視野小于20個單個核細(xì)胞陽性。此時抑制性T淋巴細(xì)胞(CD8+,CD28-)表達(dá)增強(qiáng)，這與機(jī)體免疫力開始下降相對應(yīng)。與之前學(xué)者研究結(jié)果基本一致[5-7]。調(diào)節(jié)抑制過強(qiáng)免疫，可能是機(jī)體處于免疫耐受的階段，此時期肝臟血管破壞較重，藥物無法通過肝血管循環(huán)到達(dá)肝臟病變部位，故采取肝內(nèi)介入療法可能是有效的方法。本研究還提示，嗜肝病毒(HBV)侵入機(jī)體，機(jī)體免疫系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)HBV復(fù)制與宿主應(yīng)答之間的平衡來限制過度的肝臟病理損傷。故檢測肝組織中CD8,CD28分子的表達(dá)，觀察肝組織中肝血竇的病變，對判斷患者的免疫狀態(tài)和肝組織的損傷程度大有助益。

乙型肝炎病毒復(fù)制和免疫系統(tǒng)對抗其侵害之間的平衡的破壞是引起機(jī)體損傷的一個重要原因。如何使兩者之間維持著動態(tài)平衡，避免免疫反應(yīng)過激、過強(qiáng)，造成大面積肝組織壞死，是亟待解決的問題。

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Relationship between expression of intrahepatic CD8 and CD28 in patients with chronic hepatitis B and hepatic sinusoids' pathological changes

CHENFu-liang,TUYuan-hang,XUChang-jiang,etal.

(TheNo. 123HospitalofthePLA,Bengbu,Anhui233015,China)

Objective：To observe the relationship between expression of intrahepatic CD8 and CD28 in patients with chronic hepatitis B(CHB) and hepatic sinusoids' pathological changes.Methods：60 CHB patients admitted to our hospital were selected,who underwent liver biopsy with ultrasound guidance.Immunohistochemical method was used to examine the expression of CD8 and CD28 in hepatic tissues.The relationship between expression of CD8 and CD28 and hepatic sinusoids' pathological changes was observed and analyzed.Results:The expression of CD8 and CD28 was closely related to the contriction, emphraxis, dillation and sinusoidal capillarization in hepatic sinus. The results suggested that the expression of CD8+, CD28+T cells predominated over CD8+, CD28-T(cytotoxic T lympocyte) at liver lesions' early stage. The worse of the liver lesion was, the higher the expression of CD8+, CD28+T cells in liver inflammation necrotic area became.When liver sinusoidal capillarization happened,necrosis repair,fibrous tissue septum and fibrous scar formation were mainly expressed as CD8+,CD28-inhibitory regulatory T cells. Logistic regression analysis indicated that CD8+,CD28+T cells' expression was highest when the contriction, emphraxis, dilation and sinusoidal capillarization in hepatic sinus was severe(P<0.01).The above showed that the expression of CD8+,CD28+T cells took part in hepatic sinus lesions' pathological changes.Conclusion:The expression of intrahepatic CD8+,CD28+T cells in patients with CHB played a key role in the pathological changes of hepatic sinusoids.

Hepatitis B, chronic; Hepatic tissues; CD8; CD28; Hepatic sinusoids

解放軍第123醫(yī)院 1.病理科；2.肝病中心，安徽 蚌埠 233015

陳付涼(1986-)，男，技師，大學(xué)。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.01.005

R 512.62

A

1008-7044(2017)01-0013-04

2016-08-22)