蔣魁, 徐力文, 蘇友祿, 馬紅玲, 劉廣鋒, 郭志勛, 高芳, 馮娟

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兩株珍珠龍躉病原性哈維弧菌()的分離與鑒定

蔣魁, 徐力文, 蘇友祿, 馬紅玲, 劉廣鋒, 郭志勛, 高芳, 馮娟*

中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510300

自海南陵水和廣東深圳養(yǎng)殖場(chǎng)患病珍珠龍躉(pearl gentian)分離到2株優(yōu)勢(shì)菌(X12XC30和X13SZ03), 經(jīng)回歸感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)2株菌是珍珠龍躉的病原菌, 對(duì)珍珠龍躉的半致死濃度(LD50)分別是6.58×106CFU·g-1和9.83×105CFU·g-1。對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)、顏色和生長(zhǎng)條件等常規(guī)生理生化實(shí)驗(yàn), 并進(jìn)行,和等管家基因的序列分析綜合鑒定。結(jié)果顯示: 2株病原菌均為短桿狀革蘭氏陰性菌, TCBS生長(zhǎng)為黃色, 對(duì)O/129(150 ug·片-1)敏感, 生理生化指標(biāo)與哈維弧菌標(biāo)準(zhǔn)株一致;和序列在Genbank上檢索與哈維弧菌的同源性最高, 根據(jù)管家基因的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 自然地與哈維弧菌分支聚類(lèi)為一支, 確定這2株菌均為哈維弧菌。藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2株哈維弧菌均耐呋喃唑酮, 而對(duì)諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素等藥物敏感。哈維弧菌具有較高的致死率, 在珍珠龍躉養(yǎng)殖業(yè)中存在潛在的威脅。

哈維弧菌; 珍珠龍躉; 鑒定

1 前言

海水養(yǎng)殖業(yè)中, 細(xì)菌病是影響廣泛的重要因素[1], 哈維弧菌()作為海水養(yǎng)殖業(yè)重要的致病菌[2–3], 可感染多種魚(yú)、蝦、蟹等并造成大量的死亡[4–7], 例如, 哈維弧菌感染牙鲆()[8–9]、斑節(jié)對(duì)蝦()[10–11]、凡納濱對(duì)蝦()[12]、尖吻鱸()[13]、刺尾魚(yú)()[14]和紅鰭東方鲀()[15]等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物, 并導(dǎo)致其死亡的主要原因, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病原性哈維弧菌分布的養(yǎng)殖海域, 當(dāng)細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一個(gè)閾值, 則會(huì)觸發(fā)群體感應(yīng)效應(yīng), 產(chǎn)生毒性變異, 對(duì)海洋生物造成細(xì)菌性侵染毒害, 擾亂海域生態(tài)環(huán)境。

珍珠龍躉(pearl gentian), 又稱(chēng)珍珠斑或龍虎斑, 是由鞍帶石斑魚(yú)(♂)和棕點(diǎn)石斑魚(yú)(♀)雜交培育的新種。珍珠龍躉結(jié)合了棕點(diǎn)石斑魚(yú)抗病力強(qiáng)和鞍帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)快的優(yōu)點(diǎn), 顯現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)[16]。2013年全中國(guó)石斑魚(yú)產(chǎn)量約為18.44萬(wàn)噸, 其中廣東、福建、海南養(yǎng)殖量就高達(dá)8.24萬(wàn)噸, 近兩年在天津、青島等地也都實(shí)現(xiàn)了珍珠龍躉的大規(guī)模養(yǎng)殖。目前, 珍珠龍躉的研究主要是育種和養(yǎng)殖技術(shù)[17–18], 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 養(yǎng)殖過(guò)程中疾病的問(wèn)題逐漸凸現(xiàn), 大量的魚(yú)在養(yǎng)殖過(guò)程中染病死亡[19–20], 但關(guān)于珍珠龍躉細(xì)菌性疾病的相關(guān)報(bào)道很少。

2012年9月中下旬, 海南陵水縣新村灣周邊池塘養(yǎng)殖的珍珠龍躉, 魚(yú)體出現(xiàn)爛身, 死亡, 體長(zhǎng)15—17 cm, 體重125—140 g, 鹽度32—34 PPT, 水溫29—32 ℃, 每天死亡率0.5%—1.0%, 分離病原菌X12XC30。2013年10月上中旬, 廣東深圳大鵬某水泥池養(yǎng)殖的珍珠龍躉, 體長(zhǎng)13—15 cm, 體重90—120 g, 鹽度28—30, 水溫27—29 ℃,每天死亡率0.6%—1.4%, 分離病原菌X13SZ03。患病魚(yú)表現(xiàn)的主要癥狀相似: 體側(cè)脫鱗, 尾柄潰瘍, 以口腔上下顎潰瘍明顯, 部分魚(yú)眼膜發(fā)白, 鰓輕度貧血狀, 部分魚(yú)有少量瓣體蟲(chóng)寄生。腎臟腫大軟化, 脾臟腫大, 肝臟邊緣有壞死狀淺色斑塊, 胃和腸道無(wú)食物, 積有少量淺色膿液狀物。從肝、腎和腦分離到優(yōu)勢(shì)菌落。

本研究分離來(lái)自不同地區(qū)珍珠龍躉的疑似病原菌X12XC30和X13SZ03, 并從兩株菌的形態(tài)、生理生化特征、生物學(xué)分類(lèi)以及致病性進(jìn)行研究, 以期為防治珍珠龍躉養(yǎng)殖中弧菌病的爆發(fā)提供生物學(xué)科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 病原菌的分離

本實(shí)驗(yàn)室于2012年和2013年分別在海南陵水與廣東深圳養(yǎng)殖場(chǎng)的患病珍珠龍躉分離的2株病原菌(表1)。

2.2 回歸感染實(shí)驗(yàn)

自海南三亞一養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)得珍珠龍躉幼魚(yú), 體長(zhǎng)(10±0.5) cm, 體重(11.8±1) g, 在5 m3的水泥池中暫養(yǎng)一周。每株菌設(shè)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組, 每組3個(gè)平行, 每個(gè)平行10尾魚(yú), 分別飼養(yǎng)于1 m3的水泥池中。將待檢菌株接種于2216E斜面培養(yǎng)12—16 h, 用無(wú)菌生理鹽水(0.9% NaCl)洗脫, 制成菌懸液, 10倍稀釋五個(gè)濃度梯度(菌懸液涂布法計(jì)數(shù)), 實(shí)驗(yàn)組每尾魚(yú)腹腔注射0.2 ml菌懸液, 對(duì)照組注射等量生理鹽水。每天正常喂養(yǎng), 觀(guān)察記錄實(shí)驗(yàn)魚(yú)的死亡情況, 直到實(shí)驗(yàn)魚(yú)穩(wěn)定3天以上不出現(xiàn)死亡為止, 取實(shí)驗(yàn)組瀕死魚(yú)肝臟、腎臟劃線(xiàn)分離細(xì)菌。

采用寇氏法計(jì)算LD50, 公式如下:

lg LD50=-(Σ-0.5)

式中:死亡率為100%組的對(duì)數(shù)劑量

對(duì)數(shù)組距

表1 菌株來(lái)源及編號(hào)

Tab.1 Sources of strains and serial number

Σ各組死亡率之和

2.3 菌株形態(tài)及生理生化特征分析

對(duì)菌株X12XC30和X13SZ03及感染后分離株進(jìn)行革蘭氏染色, 用油鏡觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)及染色情況。將純化后的菌株接種到2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng), 根據(jù)常規(guī)生理生化鑒定測(cè)定方法[21], 同時(shí)做API(32E)系統(tǒng)鑒定。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

將兩株病原菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中, 28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)12—16 h。取2 mL菌懸液, 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取DNA為PCR模板, 保存于–20 ℃?zhèn)溆谩＿x取1和三個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物, 送上海生工合成(見(jiàn)表2)。2×Premix Taq購(gòu)自Takara公司。DL 2000 Maker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

PCR擴(kuò)增體系如下:

2×Premix Taq 25uL

Primer-F 2uL

Primer-R 2uL

DNA 2uL

ddH2O up to 50uL

PCR擴(kuò)增條件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 50—60 ℃ 40 s, 72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min。

取5 uL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳, 陽(yáng)性產(chǎn)物送英濰捷基公司測(cè)序, 得到基因序列, 利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 分析結(jié)果[22]。

2.5 菌株對(duì)藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)

據(jù)NCCL實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn), 采用紙片擴(kuò)散K-B法檢測(cè)菌株X12XC30和X13SZ03對(duì)藥物的敏感性, 取100 μL菌懸液(濃度約為108CFU·mL-1)涂布于MHA培養(yǎng)基上, 10 min后貼藥敏紙片, 藥敏紙片為12種常見(jiàn)的抗生素(均于杭州天和微生物試劑有限公司購(gòu)得): 頭孢克肟、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、復(fù)方新諾明、利福平、呋喃唑酮、阿莫西林、紅霉素和恩諾沙星。于28 ℃下培養(yǎng)24 h后, 觀(guān)察并測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷菌株對(duì)藥物的敏感性[23–25]。

3 結(jié)果

3.1 菌株X12XC30和X13SZ03致病性

回歸感染顯示, X12XC30和X13SZ03對(duì)珍珠龍躉具有強(qiáng)致病性, 引起宿主死亡。其表現(xiàn)病征為腎臟腫大軟化, 脾臟腫大, 胃和腸道無(wú)食物, 肝門(mén)有出血等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡結(jié)果, 計(jì)算得到LD50分別是6.58×106CFU·g-1和9.83×105CFU·g-1(見(jiàn)表3)。對(duì)感染后的珍珠龍躉魚(yú)肝臟、腎臟組織重分離細(xì)菌、純化, 菌株分別標(biāo)記為X12XC30-1和X13SZ03-1。

3.2 生理生化檢測(cè)

經(jīng)生理生化以及染色鑒定, 革蘭氏染色為紅色, 呈短桿狀的陰性菌(圖1)。TCBS生長(zhǎng)為黃色, 對(duì)O/129(150 ug·片-1)敏感; 在28 ℃和35 ℃均能生長(zhǎng), 需要NaCl; 利用葡萄糖, 對(duì)氧化酶與過(guò)氧化氫酶均呈陽(yáng)性, 實(shí)驗(yàn)菌株在利用甘露醇、肌醇及淀粉等項(xiàng)目中與哈維弧菌標(biāo)準(zhǔn)株有差異(見(jiàn)表4)。對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版)[26], 參照有關(guān)文獻(xiàn)[27–28], 確定兩株病原菌歸屬于弧菌屬。

表2 引物信息

Tab.2 Information of the primers

表3 菌株X12XC30和X13SZ03對(duì)珍珠龍躉的回歸感染結(jié)果

Tab.3 Pathogenicity of Strains X12XC30 and X13SZ03 to pearl gentian

注: “C”為0.9%生理鹽水對(duì)照組。

圖1 X12XC30革蘭氏染色結(jié)果

3.3 分子生物學(xué)鑒定

分別將和串聯(lián)基因與弧菌屬參考菌株, 利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 進(jìn)行同源性分析(圖2, 3, 4, 5)。結(jié)果顯示兩株病原菌X12XC30和X13SZ03的基因與哈維弧菌自然聚類(lèi);和等管家基因均自然聚類(lèi)于哈維弧菌分支, 結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果, 可確定這兩株病原菌為哈維弧菌。

表4 菌株X12XC30和X13SZ03的主要生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

Tab.4 Main phenotypic traits of X12XC30 and X13SZ03 strains

續(xù)表

注: “＋”表示結(jié)果為陽(yáng)性; “－”表示結(jié)果為陰性; “ND”表示沒(méi)有可提供的數(shù)據(jù); “d”表示有差異。

圖2 基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 基于rctB基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖4 基于toxR基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 rctB-toxR串聯(lián)序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3.4 菌株耐藥性檢測(cè)

致病菌X12XC30與X13SZ03對(duì)12種抗菌藥物敏感性的檢測(cè)結(jié)果, 顯示2株哈維弧菌均耐呋喃唑酮; 對(duì)諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素等藥物敏感。而對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、阿莫西林、利福平、復(fù)方新諾明、紅霉素和頭孢克肟等藥物的敏感性存在明顯差異(見(jiàn)表5)。

4 討論

經(jīng)人工感染實(shí)驗(yàn), 分離到X12XC30和X13SZ03對(duì)應(yīng)菌株X12XC30-1和X13SZ03-1, 對(duì)這四株菌進(jìn)行形態(tài)以及常規(guī)生理生化鑒定, 結(jié)果顯示為革蘭氏陰性短桿菌, TCBS上呈黃色, O/129(150 ug·片-1)敏感。生理生化鑒定結(jié)果與哈維弧菌特征極為相近, 與其他研究者的鑒定結(jié)果, 部分鑒定項(xiàng)存在差異[29–30], 如實(shí)驗(yàn)菌株在利用甘露醇、肌醇及淀粉等項(xiàng)目中與哈維弧菌標(biāo)準(zhǔn)株有差異, 不能完全確定這兩株菌是否為哈維弧菌。另外, 對(duì)X12XC30和X13SZ03進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定, 1[31],和管家基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示兩株菌與哈維弧菌聚類(lèi)到一支。根據(jù)曾德乾等[22]研究結(jié)果, 將兩個(gè)基因序列串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 能夠快速有效的鑒別哈維弧菌, X12XC30和X13SZ03的基因串聯(lián)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 均自然地聚類(lèi)到哈維弧菌分支。綜合生理生化與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果, 可確定這兩株菌為哈維弧菌。

表5 致病菌X12XC30與X13SZ03對(duì)不同抗菌藥物的敏感性

注: R為耐藥; I為中度敏感; S為高度敏感

沈錦玉等[32]從浙江患病大黃魚(yú)分離的哈維弧菌病原株GYC1108-1回歸感染大黃魚(yú)實(shí)驗(yàn), 該菌LD50為1.1×108CFU·g-1, 對(duì)原宿主致病性較強(qiáng)。梅冰等[33]從海南三亞患病的斜帶石斑魚(yú)分離的哈維弧菌, 人工感染后得到的LD50為1.05×104CFU·g-1, 表明哈維弧菌有強(qiáng)致病性。本文中, 從患病珍珠龍躉分離到病原菌X12XC30和X13SZ03, 經(jīng)過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)確認(rèn), 均具有強(qiáng)致病性, 其LD50分別為6.58×106CFU·g-1和9.83×105CFU·g-1。感染后的珍珠龍躉體表有潰瘍, 取瀕死實(shí)驗(yàn)魚(yú)解剖發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟不同程度腫大, 與分離菌株的患病魚(yú)癥狀表現(xiàn)一致, 證明這兩株菌具備重復(fù)感染的能力, 且具有強(qiáng)毒性。證實(shí)哈維弧菌在海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)中, 是一個(gè)重要的細(xì)菌性病原, 具有強(qiáng)致病性, 能造成海水魚(yú)的死亡。

本文選取的12種抗菌藥物包括國(guó)標(biāo)漁藥, 及以前可用或禁用的藥物, 可用于借鑒分析養(yǎng)殖中抗菌藥物的使用, 抗菌藥物風(fēng)險(xiǎn)及耐藥性污染的評(píng)估工作[34]。2株哈維弧菌均耐呋喃唑酮; 而對(duì)諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素等藥物敏感。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 哈維弧菌泛濫, 毒害水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物, 可使用原粉諾氟沙星等藥物拌飼料投喂, 緩解、去除哈維弧菌病害, 保護(hù)養(yǎng)殖動(dòng)物。哈維弧菌所處環(huán)境的差異, 使得其對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、阿莫西林、利福平、復(fù)方新諾明、紅霉素和頭孢克肟等藥物的敏感性存在明顯的差異。有研究發(fā)現(xiàn), 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境分離的哈維弧菌對(duì)頭孢菌素類(lèi)的頭孢噻吩(KF)等和新型β-內(nèi)酰胺單酰胺環(huán)類(lèi)的氨曲南(AZT)等多種抗生素耐藥[35]; 而自然海域分離的哈維弧菌耐藥譜為DOX/AMP/PEN/GEN/CIP/NOR/AK、DOX/AMP/PEN/ GEN/CIP[36]。環(huán)境影響細(xì)菌的耐藥性, 而抗生素的過(guò)度使用, 導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生更多的耐性, 污染養(yǎng)殖及自然海域, 擾亂海域的生態(tài)系統(tǒng)平衡。

X12XC30和X13SZ03分別分離自海南和廣東, 其表現(xiàn)出相似的毒性與癥狀, LD50無(wú)明顯差異, 可能與珍珠龍躉的幼苗來(lái)源有關(guān), 廣東珍珠龍躉魚(yú)苗從海南購(gòu)買(mǎi)的魚(yú)苗攜帶有哈維弧菌, 通常情況下是正常菌群, 而當(dāng)外界環(huán)境改變導(dǎo)致哈維弧菌大量繁殖, 產(chǎn)生毒性, 致使珍珠龍躉死亡, 說(shuō)明哈維弧菌具有廣泛的毒性作用[37–38]。通過(guò)對(duì)珍珠龍躉患病魚(yú)分離的哈維弧菌的致病性、生物學(xué)鑒定分析及藥敏實(shí)驗(yàn), 為我國(guó)魚(yú)類(lèi)弧菌病的防治及流行病學(xué)提供生物學(xué)基礎(chǔ), 為水產(chǎn)細(xì)菌性病害的用藥提供理論基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of two pathogeneticstrains from pearl gentian

JIANG kui, XU liwen, SU youlu, MA hongling, LIU guangfeng, GUO zhixun, GAO fang, FENG juan*

South China Sea Fisheries Research Institute, China Academy of Fishery Science; Key Laboratory for Exploitation and Utilization of Marine Fisheries Resource in South China Sea, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510300, China

In this study, two bacterial strains (X12XC30 and X13SZ03) were isolated from pearl gentian cultured in Guangdong and Hainan province. The analysis of regression experimental infection test confirmed they were brachychronic pathogenicasthe LD50of X12XC30 and X13SZ03 to pearl gentian was 6.58×106CFU·g-1and 9.83×105CFU·g-1, respectively. The results showed that the two strains wereGram-negative and short rod in shape, exhibited yellow in TCBS and were susceptible toO/129 (150ug·tablet-1) with their phenotypic and molecular characteristics studied, which were similar tomorphologically, physiologically and biochemically. Their,andgenes were highly similar to those ofretrieved from Genbank. In the phylogenetic trees based onandsequences, the two strains all merged within a branch, and they were identified as. The susceptibility test showed that two strains ofwere resistant to furazolidone, while were sensitive to norfloxacin, enrofloxacin, ciprofloxacin and chloramphenicol.is highly pathogenic to pearl gentian and has a potential threat in breeding and culturing

; pearl gentian; identification

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.06.003

S941.42

A

1008-8873(2017)06-016-09

2016-10-18;

2016-12-29

海南省科技興海項(xiàng)目(2015XH03), 廣東省級(jí)魚(yú)病防治專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015), 廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金(A201501B14)

蔣魁(1990—), 男, 碩士研究生, 主要從事海水魚(yú)類(lèi)弧菌病害研究, E-mail: jiangkui0514@163.com

馮娟(1973—), 女, 博士, 研究員, 從事魚(yú)類(lèi)疾病的防治研究, E-mail: jannyfeng@163.com