李令雪，柳英杰，田欣悅，李程程，謝菊華

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)2014級15班，6班，19班，15班，遼寧 沈陽 110034；2.組織胚胎學教研室）

單一延長應激暴露對Wistar大鼠心臟結構與功能的影響

李令雪1，柳英杰1，田欣悅1，李程程1，謝菊華2*

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)2014級15班，6班，19班，15班，遼寧 沈陽 110034；2.組織胚胎學教研室）

目的：觀察單一延長應激（single prolonged stress，SPS）暴露對Wistar大鼠心臟結構和功能的影響。方法：將20只Wistar大鼠隨機分為正常對照組和模型組。模型組根據國際公認的SPS程序建立創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）大鼠模型，正常對照組不給予任何處置。比較2組大鼠左室質量指數；應用HE染色觀察大鼠心肌形態(tài)結構改變；應用Masson三色染色觀察大鼠心肌膠原纖維沉積；同時應用ELISA檢測并比較2組大鼠血清心肌損傷標志物肌鈣蛋白（cardiac troponin-I，cTn-I）水平。結果：2組心臟左室質量指數比較差異無統計學意義（P＞0.05）；HE染色及Masson染色示正常組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊、致密，心肌間質幾乎無膠原纖維分布；而模型組心肌細胞形態(tài)結構及排列基本正常，但有少部分細胞間排列稀疏、間隙不清，心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變，且心肌間質可見較多藍染的膠原纖維沉積。ELISA結果示模型組大鼠血清cTn-I水平較正常對照組有所增加（P＜0.05）。結論：SPS暴露可致大鼠心肌微細結構改變及心功能指標cTn-I水平增加，這可能是PTSD易伴發(fā)或增加心臟疾病風險的重要機制。

創(chuàng)傷后應激障礙；單一延長應激；心臟；肌鈣蛋白；微細結構

創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指親身經歷或目睹災難性事件后出現的異常精神障礙［1］，主要表現為反復創(chuàng)傷性體驗重現、警覺性高、持續(xù)性回避及記憶情緒異常等臨床癥狀。研究發(fā)現PTSD常伴發(fā)各種心血管疾病，或合并有多種心血管疾病易感因素［2-4］。為進一步了解PTSD對心臟的影響，本研究采用國際公認的單一延長應激（single prolonged stress，SPS）建立PTSD模型，應用HE染色、Masson染色觀察大鼠心肌微細結構改變，并采用ELISA方法檢測大鼠心肌損傷標志物肌鈣蛋白（cardiac troponin-I，cTn-I）水平，以期從結構和功能兩個方面揭示PTSD增加心血管疾病風險的可能機制，同時為PTSD致心肌損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取20只健康成年Wistar大鼠，雄性，體重180～200 g，由遼寧省實驗動物資源中心遼寧長生生物技術有限公司提供，常規(guī)喂養(yǎng)。隨機分為正常對照組和SPS模型組，各10只。正常對照組不做任何處理，模型組采用2005年日本文部省召開的國際PTSD科學會議確定的SPS建立PTSD模型［5-6］：將大鼠頭朝瓶嘴水平禁錮于塑料瓶中2 h；隨后立即強迫游泳20 min，水溫（24±2）℃；恢復15 min后乙醚麻醉至其意識喪失。隨后分籠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后取材進行后續(xù)實驗。

1.2 左室質量指數測定 將大鼠常規(guī)稱重，麻醉成功后快速打開胸腔、取出心臟，置入4℃預冷的生理鹽水中反復沖洗，用眼科剪剪去多余組織如血管、脂肪等外，濾紙吸干心臟，稱取整個心臟重量，隨后快速剪去左右心房與右心室，保留室間隔、左心室，稱取重量即左室重量。左室質量指數即左室重量占大鼠整個心臟重量的比值，作為反映心室肥大指標。比較2組左室質量指數。

1.3 常規(guī)HE染色觀察心肌形態(tài)結構變化 2組大鼠稱取左室重量后剪取左心室游離壁1 cm左右，置入4%多聚甲醛中固定。固定24 h后常規(guī)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片待用。常規(guī)脫蠟、水化后，切片入蘇木素液10 min；鹽酸酒精分化數秒；自來水返藍20 min；伊紅染色10 min；梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片，顯微鏡下觀察各組心肌形態(tài)結構變化。

1.4 Masson三色染色觀察心肌纖維化改變 常規(guī)石蠟切片脫蠟、水化。按照Masson三色染色試劑盒（購自北京雷根生物技術有限責任公司）說明書進行后續(xù)操作：（1）切片入Bouin液，室溫過夜；流水沖洗至切片上黃色染色消失；（2）切片入天青石藍染色液、Mayer蘇木素染色液各3 min，稍水洗后予酸性乙醇分化數秒；流水沖洗10 min；（3）切片入麗春紅品紅染色液10 min，稍水洗后置入磷鉬酸溶液中10 min；（4）隨后直接在組織塊上滴加苯胺藍染色液，5 min后入弱酸溶液處理2 min；（5）隨后梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片、顯微鏡下觀察。其中細胞核藍褐色，肌原纖維、胞質、纖維素、紅細胞等呈紅色，膠原纖維呈藍色，觀察2組心肌切片上膠原沉積情況。

1.5 ELISA檢測血清cTn-I水平 2組大鼠心尖取血后置于促凝管中，離心取上清、-80℃保存待用。按照ELISA試劑盒（購于R&D Systems）說明書進行后續(xù)操作：（1）準備好標準品及待測樣品各50μl。（2）加入等體積生物素標記的抗體，蓋上膜板，輕輕震蕩混勻，37℃孵育1 h。（3）甩去反應孔內液體，加入洗滌液，震蕩30 s，甩去洗滌液，用濾紙拍干。重復操作3次。（4）每孔加入親和鏈酶素-HRP，37 ℃孵育30 min。（4）按上述洗板后，加入50μl終止液。（5）立即在450 nm波長處測定各反應孔吸光度（OD）值，并換算出待測樣品濃度。

1.6 統計學方法 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料采用s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組心臟左室質量指數比較 正常對照組大鼠左室質量指數為（0.695±0.02），模型組大鼠左室質量指數為（0.661±0.03），差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 HE染色觀察結果 正常組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，排列整齊、致密，肌纖維無斷裂，橫紋、閏盤及細胞核染色清晰，見圖1A。模型組多數心肌細胞形態(tài)結構及排列基本正常，橫紋、閏盤尚清晰，但有少部分細胞間排列稀疏、間隙不清，心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變，見圖1B。

圖1 2組大鼠心肌細胞HE染色結果（×400）

2.3 Masson三色染色觀察結果 正常大鼠心肌間質幾乎無膠原纖維分布，心肌細胞形態(tài)結構基本一致，見圖2A；模型組大鼠心肌細胞形態(tài)結構大致正常，但心肌間質成分略有增加，部分心肌細胞心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變，心肌間質可見較多藍染的膠原纖維沉積，見圖2B。

圖2 2組大鼠心肌細胞Masson三色染色結果（×400）

2.4 ELISA檢測血清cTn-I水平 模型組血清cTn-I水平為（0.057±0.030）ng/ml，正常對照組血清cTn-I水平（0.046±0.055）ng/ml，差異有統計學意義（t=3.65，P＜0.05）。

3 討論

PTSD是一種與災難性創(chuàng)傷事件密切相關的精神障礙。近年來，隨著全球局部地區(qū)戰(zhàn)爭的爆發(fā)、自然災難頻發(fā)及致死性疾病檢出率增加，PTSD發(fā)生率也隨之增加。據最新流行病學調查發(fā)現，經歷四川雅安地震的435例貧困山區(qū)兒童青少年1 年后符合PTSD診斷者高達 43.9%［7］；而經歷汶川地震5年后重災區(qū)婦女PTSD陽性率仍高達10.96%［8-9］。這些研究數據表明PTSD嚴重影響災后人們生活的恢復及重建，值得給予高度重視與廣泛關注。

臨床上PTSD患者主要有對創(chuàng)傷事件的病理性重現、對創(chuàng)傷相關線索的持續(xù)回避、認知與情緒改變、高度警覺與高反應性等四大癥狀。與此同時，PTSD患者還常常伴有心血管系統方面的改變。Buckle等［10］研究發(fā)現，PTSD患者靜息心率比正常受試者加快；Cohen等［11］研究發(fā)現PTSD患者心率變異性出現改變，其中低頻成分增多，高頻成分減少，這提示PTSD患者靜息狀態(tài)下交感神經活動增加。此外，據國外一項長達10年的前瞻性研究報道，PTSD癥狀較為嚴重的患者其冠心病發(fā)生率也相對較高，并且在嚴格控制冠心病誘發(fā)因素的同時，PTSD患者心血管系統疾病發(fā)生率也顯著高于無PTSD的患者［2］，由此PTSD被認為可以促進冠心病的發(fā)展，是冠心病的重要危險因素。

一項對汶川地震災區(qū)執(zhí)行救災任務患有應激障礙的官兵調查報告顯示，參加一線救助的PTSD官兵肌酸激酶、肌酸激酶同工酶均較正常對照組顯著增加，提示PTSD患者心肌細胞可能有不同程度的損傷［12］。本研究利用SPS建立PTSD大鼠模型，并檢測模型大鼠與正常對照組大鼠在心肌微細結構和功能上的差異。SPS是目前PTSD研究中應用較為廣泛的動物模型，主要通過禁錮、強迫游泳、乙醚麻醉三種應激模擬出PTSD患者的神經內分泌學變化。本研究結果表明，SPS暴露對大鼠左室質量指數無明顯改變（P＞0.05），但HE及Masson三色染色結果發(fā)現，盡管模型組多數心肌細胞形態(tài)結構及排列基本正常，但仍有少部分細胞間排列稀疏、間隙不清，心肌纖維斷裂、融合呈波浪狀改變，且心肌間質可見較多藍染的膠原纖維沉積。這些結果提示SPS暴露可引起大鼠心肌細微結構變化，而這種結構改變可能是PTSD引起心血管系統改變或增加心血管疾病風險的重要結構基礎。同時ELISA檢測結果表明模型組大鼠心肌損傷標志物cTn-I水平較正常對照組增加（P＜0.05），提示SPS作為一種復合性應激源在造成心肌微細結構變化同時也可對心臟功能造成某種程度的改變。而可能正是這些改變使PTSD成為了心臟疾病的高危因素，促進了冠心病等疾病的發(fā)生發(fā)展。但SPS究竟通過何種信號轉導途徑致使PTSD大鼠心臟結構和功能發(fā)生改變及增加心臟疾病風險尚待進一步研究闡明。

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Effect on Cardiac Morphological Structureand Function in Ratsafter Exposureto SingleProlonged Stress

LILingxue1，LIUYingjie1，TIANXinyue1，LIChengcheng1，XIEJuhua2*
（1.Grade 2014， Class 15，6，19，15， Shenyang Medical College，Shenyang 110034， China； 2.Department of Histology and Embryology）

Objective：To observe the effect on cardiac morphological structure and function in rats after exposure to single prolonged stress（SPS）.Methods：Totally 20 Wistar rats were randomly divided into control group and model group.In the model group，the model of post-traumatic stress disorder（PTSD） was induced by SPS.Left ventricular mass index was compared.HE staining was performed to detect the changes of morphological structure of myocardium，and Masson staining also was used to observe the deposition of collagenous fiber in myocardium.And the level of cardiac troponin-I（cTn-I） was examined by ELISA.Results：Left ventricular mass index had no statistically significant difference between the two groups （P＞0.05）.Results of HE and Masson staining showed that the morphological structure of myocardium in the model group was almost normal，but a few cells arranged loosely with unclear bands，and there were myocardial fiber fracture and blue collagens fibers deposited in some of myocardial interstitial.Meanwhile， the level of cTn-I increased in the model group compared with that in the control group （P＜0.05）.Conclusion：SPScar make the morphological structure of myocardium changed and increase the level of cTn-I，which maybe the important mechanism why PTSDincrease the risk of cardiac disease.

post-traumatic stress disorder； single prolonged stress ； heart；cardiac troponin； morphological structure

R749.5

A

1008-2344（2017）05-0455-03

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.05.022

沈陽醫(yī)學院大學生科研立項（No.20160808）；沈陽醫(yī)學院科技基金項目（No.20163047）

謝菊華（1983—），女（漢），博士研究生，講師，研究方向：應激對心腦血管的影響及分子機制.E-mail：xjh814@126.com

2017-04-17

（文敏編輯）