鄒曉婷，李 爽，梁珊珊，王春玲，趙蘊(yùn)偉

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

咳嗽變異性哮喘的差異蛋白膜聯(lián)蛋白-1的表達(dá)及分析

鄒曉婷，李 爽，梁珊珊，王春玲，趙蘊(yùn)偉*

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

目的：研究咳嗽變異性哮喘患者與健康對照者肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中有意義的差異蛋白點(diǎn)。方法：選取2016年3月至2016年9月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的32例咳嗽變異性哮喘患者為研究對象，作為觀察組；選取同期32例健康志愿者為對照組。去除2組研究對象的BALF中的高豐度蛋白，給2組BALF標(biāo)本分別建立雙向凝膠電泳圖譜，運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)得到BALF的蛋白質(zhì)指紋圖譜，篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，再應(yīng)用生物信息學(xué)方法選定其中的一種候選蛋白。結(jié)果：凝膠電泳圖譜顯示，觀察組BALF與對照組相比，共有23個蛋白斑點(diǎn)顯著異常，經(jīng)過與質(zhì)譜分析的指紋圖譜進(jìn)行匹配分析，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫，初步鑒定出12個蛋白質(zhì)，其中上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有：巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）、程序性細(xì)胞死亡基因4（PDCD4）、克拉拉細(xì)胞蛋白16（Clara cell protein 16，CC-16）、甲狀腺素運(yùn)載蛋白（transthyretin）、免疫球蛋白結(jié)合因子（immunoglobulin binding factor，IgBF）、半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（cystatin S）；下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有：溶菌酶（lysozyme）、蛋白激酶PakZ、GTPase Cdc42、膜聯(lián)蛋白-1（annexin-1）、熱休克蛋白Mot-2、乳鐵蛋白（lactoferrin）。對下調(diào)蛋白膜聯(lián)蛋白-1進(jìn)行濃度測定，觀察組的膜聯(lián)蛋白-1濃度顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：用質(zhì)譜分析鑒定了23個超過3倍差異的蛋白質(zhì)，其中，共有12個蛋白質(zhì)被鑒定，生物信息學(xué)進(jìn)一步分析顯示膜聯(lián)蛋白-1能被當(dāng)成候選蛋白進(jìn)行更深層次的研究。膜聯(lián)蛋白-1在哮喘BALF中的表達(dá)顯著下降，其與哮喘的發(fā)病機(jī)制密不可分，故能將膜聯(lián)蛋白-1作為哮喘發(fā)病的潛在蛋白標(biāo)記物。

咳嗽變異性哮喘；雙向凝膠電泳技術(shù)；質(zhì)譜技術(shù)；生物信息學(xué)；膜聯(lián)蛋白-1

咳嗽變異性哮喘又稱隱匿型哮喘，以慢性持續(xù)性干咳為唯一或主要臨床表現(xiàn)，作為支氣管哮喘的一種特殊類型，其發(fā)病機(jī)制尚不明確［1］。哮喘的病理生理改變已被歸因于生物學(xué)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，這些變化主要與轉(zhuǎn)錄途徑、炎癥介質(zhì)、趨化因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖相關(guān)［2］。這種多病因疾病的特征涉及許多分子和生物化學(xué)途徑的遺傳變異的相互作用，以及它們與環(huán)境因素的相互作用［3］。哮喘表型的復(fù)雜性，連同遺傳異質(zhì)性和環(huán)境的影響，使得很難揭示這種常見疾病的機(jī)制［4］?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的開展旨在明確疾病的早期診斷，從而對其進(jìn)行預(yù)防性治療，并為多因素疾病研究新型藥物確定新的分子靶點(diǎn)。本研究正是用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來尋找哮喘蛋白標(biāo)志物，對哮喘患者肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，為深入了解這種疾病的復(fù)雜的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月至2016年9月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的32例咳嗽變異性哮喘患者為研究對象，作為觀察組；選取同期32例健康志愿者為對照組。觀察組男19例，女13例，年齡22～58歲，平均年齡（40±5）歲；對照組男15例，女17例，年齡20～60歲，平均年齡（40±6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）咳嗽持續(xù)或反復(fù)發(fā)作＞1個月，常在夜間和（或）清晨發(fā)作，運(yùn)動后加重，痰少，臨床無感染征象，抗生素治療無效；（2）支氣管激發(fā)試驗陽性；（3）有個人過敏史或家族過敏史；（4）支氣管舒張劑治療有效。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）在急性發(fā)作期的患者；（2）凝血功能較差的患者；（3）有妊娠、惡性腫瘤及嚴(yán)重的心肝腎疾病的患者；（4）合并自身免疫性疾病患者。所有研究對象均閱讀并簽署《經(jīng)電子支氣管鏡操作知情同意書》和《試驗研究知情同意書》，本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 研究對象在禁食8 h以后，清晨給予2%利多卡因局部吸入麻醉，2 h后行電子支氣管鏡，將少量生理鹽水經(jīng)纖維支氣管鏡注入被選定的肺部區(qū)域，行肺泡灌洗后，即時吸出，收集所有的BALF液離心30 min，保留上清液，均用2.0 ml試劑管分裝，標(biāo)記后于-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BALF中高豐度蛋白的去除 將觀察組的BALF樣本進(jìn)行等量混合裝入收集管中，同時將對照組的樣本進(jìn)行等量混合裝入另一個收集管中，分別取標(biāo)本50μl，以結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）10倍稀釋，先除去分離柱上的蓋子，以紙吸去貯存緩沖液，然后除去分離柱底部的尖咀，放入2.0 ml收集管，加入結(jié)合緩沖液，讓其靠重力流過柱體，將柱子放入一個新的2.0 ml的收集管中，加入稀釋后的樣本，讓其靠重力流過柱體，再以600μl結(jié)合緩沖液清洗柱體，最后以600μl結(jié)合緩沖液清洗柱體，收集以上的洗脫組分，即為去除高豐度蛋白后的樣本。

1.2.3 雙向凝膠電泳及凝膠圖像的分析 將去除高豐度蛋白后的BALF樣本充分地進(jìn)行水化后，選取pH值為3～10的17 cm非線性膠條作為樣品，進(jìn)行第一向等電聚焦，等待其處于平衡之后，再用雙向凝膠電泳進(jìn)行第二向的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳［5］，進(jìn)行二維電泳的分離，用硝酸銀對其進(jìn)行銀染，將染色后的雙向電泳凝膠用掃描儀透射掃描，選擇需要進(jìn)行掃描的區(qū)域，將這些凝膠圖像逐一進(jìn)行點(diǎn)檢測，將它們的背景進(jìn)行削減與匹配，建立平衡凝膠，蛋白點(diǎn)豐度的比較在組間進(jìn)行，如果測到的蛋白點(diǎn)豐度高于或者是低于正常值的3倍，就把這類蛋白視作是差異蛋白。

1.2.4 質(zhì)譜檢測與數(shù)據(jù)庫檢索 將以上重復(fù)性比較好、形態(tài)相對完整的差異蛋白膠點(diǎn)進(jìn)行萃取，萃取之后再用質(zhì)譜儀開始質(zhì)譜檢測與分析，最終得到一個肽質(zhì)量的指紋圖譜，將強(qiáng)度在10個單位以上、有10個以上離子信號的譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出相關(guān)的多肽和蛋白。

1.2.5 應(yīng)用生物信息學(xué)方法選定候選蛋白膜聯(lián)蛋白-1 應(yīng)用String等相關(guān)操作工具對選出的鑒定蛋白進(jìn)行分析，包括下列流程：（1）對其所參與的相應(yīng)生物學(xué)過程進(jìn)行分析；（2）對其進(jìn)行疏水性分析、跨膜區(qū)預(yù)測、信號肽預(yù)測等相關(guān)分析，對基因編碼蛋白的性質(zhì)作出判斷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s）表示，采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

進(jìn)行凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分析后的BLAF，共有23個蛋白斑點(diǎn)顯著異常，并初步鑒定出12個蛋白質(zhì)，包括6個表達(dá)上調(diào)的差異蛋白（巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）、程序性細(xì)胞死亡基因4（PDCD4）、克拉拉細(xì)胞蛋白16（CC-16）、甲狀腺素運(yùn)載蛋白（transthyretin）、免疫球蛋白結(jié)合因子（immunoglobulin binding factor，IgBF）、半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（cystatin S）；）及6個表達(dá)下調(diào)的差異蛋白［溶菌酶（lysozyme）、蛋白激酶PakZ、GTPase Cdc42、膜聯(lián)蛋白-1（Annexin-1）、熱休克蛋白Mot-2、乳鐵蛋白（lacto-ferrin）］，哮喘組與健康對照組BALF中12個差異蛋白點(diǎn)的電泳及質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1，哮喘組的膜聯(lián)蛋白-1濃度顯著低于正常對照組（P＜ 0.05），見表2。

表1 哮喘組與健康對照組間差異蛋白點(diǎn)的電泳及質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表2 哮喘組與對照組BALF中膜聯(lián)蛋白-1表達(dá)量的比較

3 討論

上個世紀(jì)以來，在國際上，將挑選哮喘候選基因一直視為重點(diǎn)，使得哮喘的分子遺傳學(xué)研究得到廣泛的關(guān)注，越來越多的臨床試驗得到開展。從致病因素角度看，蛋白質(zhì)的表達(dá)比基因序列更具有主導(dǎo)地位，跟蛋白表達(dá)有關(guān)的疾病占所有疾病的98%，是基因序列有關(guān)疾病的49倍。因此，探究疾病本質(zhì)方面，發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的蛋白質(zhì)要比發(fā)現(xiàn)變異基因更有意義，本試驗正是在蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，研究哮喘患者與健康人的BALF中差異蛋白的表達(dá)，共鑒定出12種蛋白質(zhì)，包括6個上調(diào)蛋白：MIF、PDCD4、CC-16、甲狀腺素運(yùn)載蛋白、IgBF、cystatin S；6個下調(diào)蛋白：溶菌酶、蛋白激酶PakZ、GTPase Cdc 42、膜聯(lián)蛋白-1、熱休克蛋白Mot-2、乳鐵蛋白，對上調(diào)蛋白膜聯(lián)蛋白-1進(jìn)行蛋白濃度測定，哮喘組的膜聯(lián)蛋白-1表達(dá)含量顯著低于正常對照組（P＜ 0.05）。

哮喘是一種以多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子為主的非特異性炎癥性疾?。?］，膜聯(lián)蛋白（Annexis）是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族，而膜聯(lián)蛋白-1是其中最先被發(fā)現(xiàn)的成員，它對細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)活動都起到了調(diào)節(jié)作用。近年來，有關(guān)膜聯(lián)蛋白-1的研究正在逐漸開展，其中炎癥和腫瘤是研究較多的。相關(guān)研究表明，膜聯(lián)蛋白-1具有很強(qiáng)的抗炎作用［7］，其抗炎活性的發(fā)揮主要是能夠干擾粒細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞的聚集、遷移及其在炎癥部位的活性。在炎癥因子的作用下，中性粒細(xì)胞與受感染部位的毛細(xì)血管后微靜脈中的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合時，中性粒細(xì)胞內(nèi)明膠酶顆粒被釋放，從而刺激大量的膜聯(lián)蛋白-1聚集到細(xì)胞表面，以鈣離子依賴的方式固定在細(xì)胞的漿膜上。漿膜上的這些膜聯(lián)蛋白-1可以與白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)發(fā)生相互黏附作用，從而下調(diào)白細(xì)胞在損傷或感染部位的聚集。膜聯(lián)蛋白-1抑制了炎癥的起始步驟，還可以抑制許多炎性反應(yīng)復(fù)合物如PLA2的形成。PLA2是炎性介質(zhì)合成和釋放的關(guān)鍵酶，是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的中心，它被激活后，作用于膜磷脂產(chǎn)生花生四烯酸，進(jìn)而產(chǎn)生前列腺素E2和腫瘤壞死因子α，釋放炎性介質(zhì)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。膜聯(lián)蛋白-1還有很強(qiáng)的炎癥消散作用，能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡和增加巨噬細(xì)胞的吞噬作用。除此之外，膜聯(lián)蛋白-1還可以使中性粒細(xì)胞對內(nèi)皮的黏附作用減弱，跨內(nèi)皮遷移的功能也相對降低［8］，膜聯(lián)蛋白-1能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10［9］，讓磷脂酶A2的活性受到抑制，從而使炎性因子的合成減少［10］。

綜上所述，膜聯(lián)蛋白-1在咳嗽變異性哮喘患者表達(dá)下調(diào)，其抗炎作用與炎癥消散作用都大大減弱，炎癥難以控制，故哮喘易反復(fù)發(fā)作。膜聯(lián)蛋白-1在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用，因此，膜聯(lián)蛋白-1的水平可反映哮喘氣道炎癥的活動情況及疾病嚴(yán)重程度，可以為支氣管哮喘的臨床診斷及獲取新的治療靶點(diǎn)研究提供參考依據(jù)，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

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Analysisof Differential Expression of Annexin-1 Protein in Patientswith Cough Variant Asthma

ZOUXiaoting， LIShuang， LIANGShanshan， WANGChunling， ZHAOYunwei*
（The First Affiliated Hospital of Jiamusi University， Jiamusi154002， China）

Objective：To investigate the differential expression of proteins in broncho alveolar lavage fluid（BALF）between cough variant asthma patients and healthy controls using two-dimensional gel electrophoresis（2-DE）and mass spectrometry（MS）.Methods：From Mar 2016 to Sep 2016，32 cases of patients with cough variant asthma were selected as the observation group and 32 healthy volunteers were selected as the control group.BALFwere collected from these people and then high-abundance proteins were removed.Then，2-DE and MSwere performed to identify the differentially expressed proteins.Finally，the candidate protein was selected by using bioinformatics method.Results：The results of 2-DE showed that there were 23 differential protein spots between the two groups，among which 12 proteins were identified by MSanalysis combined with database.The up-regulated proteins were macrophage migration inhibitory factor（MIF），programmed cell death 4 gene（PDCD4），Clara cell protein 16（CC-16），transthyretin（TTR），immunoglobulin binding factor（IgBF），and cystatin S.And the down-regulated proteins were lysozyme，PakZ，GTPase Cdc42，annexin-1，heat-shock-protein Mot-2，and lactoferrin.The concentration of annexin-1 protein was determined，which was significantly lower in the observation group than that in the control group（P＜0.05）.Conclusions：Twentythree proteins showing more than 3-fold difference are identified and 12 proteins are furtherly identified by MS.Bioinformatics analysis suggests that annexin-1 could be identified as candidate protein for further study.The expression of annexin-1 decreases significantly in BALF of cough variant asthma patients，which suggests that annexin-1 may be involved in the pathogenesis of asthma，so annexin-1 could be used asa potential marker for asthma.

cough variant asthma；two-dimensional gel electrophoresis；massspectrometry；bioinformaticsmethod；annexin-1

R562.2

A

1008-2344（2017）05-0388-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.05.003

黑龍江省科學(xué)技術(shù)研究面上項目（No.JMSUJCM 2016-041）；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目（No.YM 2016-018）

趙蘊(yùn)偉（1967—），女（漢），主任醫(yī)師，教授，研究方向：支氣管哮喘防病機(jī)制.E-mail：1054237726@qq.com

2017-02-09

（吳迪編輯）