劉宇 ，尹珺伊 ，江波濤 ，史同瑞 ，徐偉生 ，楊文忠 ，李陽(yáng) ，陳楠楠 ，秦平偉 ，侯美如 ，王巖 ，朱戰(zhàn)波

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省三頭驢農(nóng)業(yè)科技有限公司；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

一株驢源干酪乳桿菌分離、鑒定及生物學(xué)特性研究

劉宇1，2，尹珺伊1，江波濤1，2，史同瑞1，徐偉生2，楊文忠2，李陽(yáng)1，陳楠楠1，秦平偉1，侯美如1，王巖1，朱戰(zhàn)波3

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省三頭驢農(nóng)業(yè)科技有限公司；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

為了分離出可用于研發(fā)驢用微生態(tài)制劑的乳酸桿菌，采集健康驢新鮮糞樣4份，通過(guò)分離培養(yǎng)、形態(tài)特征、培養(yǎng)特性篩選出革蘭氏陽(yáng)性，厭氧，無(wú)芽孢桿菌1株。通過(guò)生理生化鑒定和PCR鑒定，確定該分離菌株為干酪乳桿菌，編號(hào)為L(zhǎng)V1。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，干酪乳桿菌LV1安全，無(wú)致病性，適宜生長(zhǎng)溫度范圍為30～40℃，培養(yǎng)液初始pH3～8條件下均能生長(zhǎng)。研究為研發(fā)驢用乳酸桿菌微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。

牛驢；干酪乳酸桿菌；生物學(xué)特性

驢是草食家畜，飼草為主要日糧[1]，飼喂量不足或飼喂質(zhì)量較差的飼草將影響驢消化系統(tǒng)功能、機(jī)體健康和生產(chǎn)性能，制約驢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[2]。

乳酸桿菌（Lactic acid bacteria，LAB）是動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群和常在菌群，可發(fā)酵產(chǎn)生大量有機(jī)酸、消化酶、維生素、抑菌物質(zhì)等代謝產(chǎn)物[3，4]，調(diào)節(jié)菌群平衡，增強(qiáng)免疫力[5]。通過(guò)乳酸桿菌的發(fā)酵作用，將富含粗纖維的農(nóng)作物秸稈，轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)質(zhì)的驢用生物發(fā)酵粗飼料，替代飼草粗飼料，在提高驢生產(chǎn)性能同時(shí)緩解飼草缺乏壓力，促進(jìn)生物質(zhì)資源利用[6]。

研究擬從健康驢腸道內(nèi)分離乳酸桿菌，研究其生物學(xué)特性，為研發(fā)驢用微生態(tài)制劑和驢用生態(tài)飼料，促進(jìn)驢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

前往黑龍江省三頭驢農(nóng)業(yè)科技有限公司種驢繁育基地，無(wú)菌采集健康驢新鮮糞便4份，冷藏并迅速送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯和MRS瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，用于乳酸桿菌分離培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，細(xì)菌DNA提取試劑盒、6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將無(wú)菌采集的健康驢新鮮糞樣置于盛有50 mL滅菌生理鹽水含玻璃珠的錐形瓶中。將錐形瓶置于搖床，180 r·min-1振蕩 5 min，然后進(jìn)行 10倍系列稀釋?zhuān)?0-1至10-9，共9個(gè)稀釋度。

1.2.2 菌株分離、染色和鏡檢

分別取適宜稀釋度的糞樣混懸液0.1 mL涂布于MRS平板，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24～48 h。挑取各種不同菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀(guān)察菌體形態(tài)。

1.2.3 菌株的純化

挑取MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上的疑似菌落進(jìn)行純化，純化好的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀(guān)察，并描述各菌株的菌落形態(tài)特征。

1.2.4 乳酸桿菌生化鑒定

依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]和《乳酸細(xì)菌的分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[8]中乳酸桿菌屬和種的生理生化鑒定指標(biāo)，首先通過(guò)厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)，初步確定乳酸桿菌屬。再通過(guò)糖醇類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)，包括葡萄糖、纖維二糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、松三糖、核糖、木糖、蔗糖、葡萄糖酸鹽、甘露醇、山梨醇、七葉苷、水楊素等，以確定乳酸桿菌種。

1.2.5 乳酸桿菌PCR鑒定

提取菌株LV1基因組DNA，采用干酪乳桿菌16S rDNA 鑒定引物[9]，上游引物 P1：5’-TGGTCGGC AGAGTAACTGTTGTCG-3’，下游引物 P2：5’-CCAC CTTCCTCCGGTTTGTCA-3’，擴(kuò)增片段大小為727 bp，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）：PCR Premix 12.5 μL，P1、P2 各 0.5 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火復(fù)性40 s，72℃延伸2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像分析儀觀(guān)察結(jié)果。

1.2.6 生物學(xué)特性研究

1.2.6.1 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

取菌株LV1 24～48 h培養(yǎng)液，以1%接種量（約2.0×106CFU·mL-1）接種MRS肉湯，置37℃厭氧培養(yǎng)，每隔2 h取樣，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌株培養(yǎng)液的OD值。以無(wú)菌MRS肉湯作空白對(duì)照，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD620值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

取菌株LV1 24～48 h培養(yǎng)液，以1%接種量（約2.0×106CFU·mL-1） 接種 MRS 肉湯，分別置 20、25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下厭氧培養(yǎng) 18 h，以無(wú)菌MRS肉湯作空白對(duì)照，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定各培養(yǎng)溫度下菌株培養(yǎng)液的OD值。以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，OD620值為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)圖，比較菌株生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6.3 培養(yǎng)液pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

取菌株LV1 24～48 h培養(yǎng)液，以1%接種量（約2.0×106CFU·mL-1）接種 MRS 肉湯，pH 值分別調(diào)整為2、3、4、5、6、7、8、9，置 37 ℃厭氧培養(yǎng) 18 h，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)定各pH條件下菌株培養(yǎng)液的OD值。以無(wú)菌MRS作空白對(duì)照，以pH為橫坐標(biāo)，OD620值為縱坐標(biāo)，繪制曲線(xiàn)圖，比較菌株生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6.4 安全性試驗(yàn)

將80只小白鼠隨機(jī)分為高劑量組（3×1011CFU·kg-1bw）、中劑量組（2×1011CFU·kg-1bw）、低劑量組（1×1011CFU·kg-1bw）和生理鹽水對(duì)照組，每組20只，雌雄各半。在灌服試驗(yàn)菌前8 h至灌服后4 h禁食，但不禁水。取純化菌接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃厭氧培養(yǎng) 24～48 h，4 000 r·min-1離心 15 min，棄上清，用生理鹽水調(diào)整菌數(shù)，各組均一次性灌服。灌服后每天觀(guān)察，并記錄小白鼠臨床表現(xiàn)，死亡鼠剖檢，觀(guān)察14 d后處死存活小鼠，剖檢，出現(xiàn)異常變化的器官制作組織切片。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

通過(guò)厭氧分離純化，得到革蘭氏陽(yáng)性、短桿狀、兩端鈍圓、成鏈，無(wú)芽孢桿菌1株，菌株編號(hào)為L(zhǎng)V1，菌落特性為圓形、中等大小、邊緣整齊、表面光滑、乳白色菌落，菌落直徑1.0～2.0 mm。

2.2 生化鑒定結(jié)果

2.2.1 乳酸桿菌屬的生化鑒定結(jié)果

厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)等均為陰性，初步確定分離株LV1為乳酸桿菌屬。

2.2.2 乳酸桿菌種的生化鑒定結(jié)果

研究共應(yīng)用了15種糖醇微量生化反應(yīng)管。其中，葡萄糖、纖維二塘、乳糖、麥芽糖、松三糖、核糖、蔗糖、葡萄糖酸鹽、山梨醇、七葉苷、水楊素等均為陽(yáng)性，阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、甘露醇等均為陰性，符合干酪乳桿菌生化特征，確定分離株LV1為干酪乳桿菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

凝膠成像結(jié)果表明，分離株LV1在727 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，確定LV1為干酪乳桿菌，與生化鑒定結(jié)果相符，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of target gene

2.4 生物學(xué)特性結(jié)果

2.4.1 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)

菌株LV1在 0～4 h為生長(zhǎng)延遲期，4～12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD620 為 1.041，12～24 h 為穩(wěn)定期，24 h以后進(jìn)入衰亡期。。

2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株LV1在培養(yǎng)溫度為25～45℃均能生長(zhǎng)，其中適宜生長(zhǎng)溫度為30～40℃，最適生長(zhǎng)溫度為35～37℃，具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株LV1生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of temperature on the growth of strain LV1

2.4.3 培養(yǎng)液pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株LV1在培養(yǎng)液初始pH3～8條件下均能生長(zhǎng)，其中適宜pH為5～7，最適pH為6～7，具體結(jié)果見(jiàn)圖 3。

圖3 培養(yǎng)液pH對(duì)菌株LV1生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of pH on the growth of strain LV1

2.4.4 安全性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的精神、食欲、行為、糞便等均未見(jiàn)異常，試驗(yàn)鼠未出現(xiàn)死亡。觀(guān)察14 d后處死存活小鼠，剖檢內(nèi)臟器官均未見(jiàn)異常變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干酪乳桿菌LV1安全。

3 討論

諸多動(dòng)物源乳酸桿菌已被分離，益生作用得到廣泛證實(shí)[10-12]，而驢源乳酸桿菌的分離及生物學(xué)特性研究尚未見(jiàn)報(bào)道，研究首次從健康驢新鮮糞便中分離到干酪乳桿菌1株，編號(hào)為L(zhǎng)V1，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為研發(fā)驢用乳酸桿菌微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。

驢源干酪乳桿菌LV1，安全，無(wú)致病性，可用于飼用微生態(tài)制劑的研發(fā)。適宜生長(zhǎng)溫度和pH范圍廣，在25～30℃的低溫發(fā)酵環(huán)境中均可生長(zhǎng)，適用于寒地低溫環(huán)境發(fā)酵。此外，該菌株具有耐酸特性，在pH3.0條件下仍可生長(zhǎng)。上述良好的生物學(xué)特性表明，干酪乳桿菌LV1在研發(fā)驢用乳酸桿菌微生態(tài)制劑方面具有廣闊前景。

目前，在驢微生態(tài)研發(fā)領(lǐng)域仍缺乏系統(tǒng)、科學(xué)的研究[13-14]。研究從驢腸道微生態(tài)、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、生物質(zhì)資源利用角度出發(fā)，分離、鑒定了驢源腸道乳酸桿菌，研究其生物學(xué)特性，為下一步研究驢用生態(tài)制劑產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。推動(dòng)驢傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式向高效、綠色、無(wú)公害、環(huán)保的生態(tài)養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變，促進(jìn)我國(guó)驢養(yǎng)殖業(yè)的健康、循環(huán)、可持續(xù)發(fā)展。

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Isolation，Identification，Biological Characteristics Study of a Strain of Lactobacillus casei from Donkeys

Liu Yu1，2，Yin Junyi1，Jiang Botao1，2，Shi Tongrui1，Xu Weisheng2，Yang Wenzhong2，Li Yang1，Chen Nannan1，Qin Pingwei1，Hou Meiru1，Wang Yan1，Zhu Zhanbo3
（1.Veterinary Science Research Institute of HeiLongJiang Province，Qiqihar 161006；2.Heilongjiang Three Donkeys Agricultural Science and Technology Co.，Ltd；3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang BaYi Agricultural University）

To isolate lactobacillus that could be used to develop micro-ecological preparations for donkeys，four fresh faeces of healthy donkeys were collected.A gram-positive，anaerobic and no spore strain was selected by isolation culture，morphological characteristics and cultivation characteristics.The strain was identified as Lactobacillus casei by biochemical identification and PCR identification，and it was numbered“LV1”.Strain LV1 was safe and non-pathogenic，suitable growth temperature was from 30 ℃ to 40 ℃.It could grow under conditions of pH3~8.It established foundation for developing lactobacilli micro-ecological preparations of donkey.

donkey；Lactobacillus casei；biological characteristics

S852.69

A

1002-2090（2017）06-0016-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.005

2017-08-25

黑龍江省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（GC13B404）。

劉宇（1982-），男，博士研究生，現(xiàn)主要從事獸醫(yī)微生態(tài)學(xué)方面的研究工作。

史同瑞，男，研究員，E-mail：systr@sina.com；江波濤，男，研究員，E-mail：jbt999@126.com。