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        豬乙型腦炎(HW1株)細(xì)胞滅活疫苗免疫抗體水平分析

        2017-12-28 17:10:42周丹娜段正贏李文浩郭銳楊克禮袁芳艷劉澤文劉威陳文杰孟麗田永祥
        湖北畜牧獸醫(yī) 2017年12期
        關(guān)鍵詞:免疫細(xì)胞

        周丹娜+段正贏+李文浩+郭銳+楊克禮+袁芳艷+劉澤文+劉威+陳文杰+孟麗+田永祥

        摘要:為評(píng)估豬乙型腦炎(HW1株)細(xì)胞滅活疫苗的免疫原性,用商品化的乙型腦炎鼠腦疫苗、乙型腦炎弱毒疫苗(SA14-14-2株)以及自制乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗(HW1株)分別免疫仔豬,通過抗體水平監(jiān)測(cè)試驗(yàn)、中和抗體試驗(yàn)、小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)分別檢測(cè)了其特異性抗體消長(zhǎng)情況、中和抗體效價(jià)產(chǎn)生情況及疫苗對(duì)小鼠的攻毒保護(hù)率。結(jié)果顯示,3種疫苗均能產(chǎn)生中和抗體,乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗免疫組中和抗體水平要高于鼠腦疫苗和弱毒疫苗免疫組,乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗和弱毒疫苗免疫組對(duì)小鼠的攻毒保護(hù)率高于鼠腦疫苗免疫組,但兩者之間差異不顯著。抗體消長(zhǎng)情況顯示,至8周觀測(cè)期結(jié)束,鼠腦疫苗免疫組的抗體陽性率為80%,乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗和弱毒疫苗免疫組抗體陽性率為100%。結(jié)果表明豬乙型腦炎(HW1株)細(xì)胞滅活疫苗的免疫原性優(yōu)于鼠腦滅活疫苗和弱毒疫苗。

        關(guān)鍵詞:豬乙型腦炎病毒;滅活疫苗;細(xì)胞;免疫

        中圖分類號(hào):S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1007-273X(2017)12-0005-02

        日本腦炎病毒(Japanese encephalitis vrus, JEV)是一種危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病原,可引起人類腦炎,平均死亡率高達(dá)20%,而幸存者中約有57%~68%留有不同程度的后遺癥[1]。全球每年感染JEV人數(shù)超過1 000萬人,亞洲每年乙型腦炎(JE)病例有5萬多人,而我國(guó)是JE發(fā)病最多的國(guó)家,占全世界當(dāng)年總發(fā)病人數(shù)的80%以上,因此JE是我國(guó)公共衛(wèi)生的重要問題之一[1]。據(jù)調(diào)查我國(guó)豬群JE陽性率為18.12%~46.68%,不同地域流行存在差異[2]。JEV對(duì)豬的致死率不高,主要引起繁殖障礙性疫病,但豬是JEV的主要增殖宿主和傳染源。我國(guó)豬的飼養(yǎng)數(shù)量大、更新快,JEV容易通過豬-蚊-豬的循環(huán)擴(kuò)大病毒的傳播,預(yù)防和控制豬的感染和滅蚊是防止人患JE的重要措施。我國(guó)豬用乙型腦炎疫苗現(xiàn)有SA14-14-2株減毒活疫苗和HW1株鼠腦滅活疫苗。豬感染JEV后會(huì)出現(xiàn)較高的毒血癥,雖然已有報(bào)道SA14-14-2株穩(wěn)定性較好,但主要毒力蛋白上依然有回復(fù)突變可能[3],且SA14-14-2可在三帶喙庫(kù)蚊體內(nèi)繁殖[4],該毒株對(duì)乙型腦炎的流行與傳播的影響尚不清楚。而鼠腦滅活疫苗抗原成分較為復(fù)雜,副反應(yīng)較大。因此,研究更為安全、穩(wěn)定的JE疫苗是防治該病的主要方向。本研究選擇免疫保護(hù)性較好的乙型腦炎HW1株,用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來代替鼠腦增殖,制備了一批滅活疫苗,并對(duì)比了商品化的乙型腦炎鼠腦疫苗、弱毒疫苗(SA14-14-2株)以及自制乙型腦炎細(xì)胞滅活苗(HW1株)的免疫效果。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        乙型腦炎病毒HW1株、BHK21均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存;20只15 kg左右的仔豬購(gòu)自武漢某豬場(chǎng)。

        1.2 主要試劑

        DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、青、鏈霉素購(gòu)自GIBCO公司;水包油相佐劑SDA-25購(gòu)自賽德奧生物科技(北京)有限公司;豬乙型腦炎油乳劑滅活疫苗購(gòu)自武漢中博生物股份有限公司;豬乙型腦炎減毒活疫苗、豬乙型腦炎抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 病毒增殖 采用細(xì)胞懸浮技術(shù)培養(yǎng)BHK21細(xì)胞至其密度為3×107個(gè)/mL。用DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒至TCID50=107/mL,將病毒液與細(xì)胞懸液按1∶10的體積混合,經(jīng)48 h懸浮培養(yǎng)后收獲培養(yǎng)液,反復(fù)凍融2次后,離心取上清,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 病毒TCID50的測(cè)定 準(zhǔn)備長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板,將待檢病JEV毒液用DMEM培養(yǎng)基做10倍梯度稀釋至10-5~10-10,每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔,每孔100 μL,并設(shè)立陰性對(duì)照孔。觀察記錄細(xì)胞病變情況,計(jì)算各稀釋度病變細(xì)胞孔的百分率。按Reed-Muench法計(jì)算待測(cè)病毒的TCID50。

        1.3.3 乙型腦炎滅活疫苗的制備 將制苗用病毒液按體積加入0.2%甲醛溶液,37 ℃滅活48 h。將滅菌處理的SDA-25佐劑與病毒液按體積比1∶3乳化30 min,乳化結(jié)束前加入1%硫柳汞,定量分裝,加蓋密封,2~8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.4 仔豬免疫試驗(yàn) 將20只JEV抗體為陰性仔豬隨機(jī)分為4組,每組5只。分別接種乙型腦炎鼠腦疫苗、弱毒疫苗(SA14-14-2株)、自制乙型腦炎細(xì)胞滅活疫苗(HW1株)以及PBS。商品化疫苗按疫苗說明書進(jìn)行免疫,自制疫苗每只肌注2 mL,首免14 d后同等劑量加強(qiáng)免疫一次。所有仔豬于首免后的1、2、3、4、5、6、7、8周無菌采血,分離血清,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.5 免疫抗體水平檢測(cè) 使用乙腦抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清抗體,并使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。不同免疫組陽性峰值血清進(jìn)行血清中和效價(jià)的檢測(cè),具體方法為:將JEV病毒稀釋為200 TCID50,待檢血清補(bǔ)體滅活后倍比稀釋至2-2~2-8,將病毒與不同稀釋度的待檢血清等量混合,置于37 ℃作用60 min。每個(gè)稀釋度接種6個(gè)孔,觀察并記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù),按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)保護(hù)量(PD50),然后計(jì)算待檢血清的中和效價(jià)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 病毒毒價(jià)測(cè)定

        在BHK21懸浮細(xì)胞上進(jìn)行HW1株的增殖,連續(xù)傳5次,其TCID50分別為106.9/mL、107.1/mL、107.5/mL、107.4/mL和107.3/mL,毒價(jià)穩(wěn)定,可用于配制疫苗。

        2.2 仔豬血清乙型腦炎抗體檢測(cè)及抗體消長(zhǎng)情況

        乙型腦炎弱毒疫苗免疫組在免疫1周以后抗體轉(zhuǎn)陽,鼠腦滅活疫苗和細(xì)胞滅活疫苗免疫組均在免疫后第2周抗體轉(zhuǎn)陽。鼠腦滅活疫苗在隨后的抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果與未免疫組差異不顯著。弱毒疫苗組和細(xì)胞滅活疫苗組分別在第2周和第3周出現(xiàn)抗體峰值,隨后逐周下降,但直至第8周抗體水平仍然呈陽性(圖1)。endprint

        2.3 血清中和試驗(yàn)

        血清中和試驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示,鼠腦滅活疫苗組、弱毒疫苗組和細(xì)胞滅活疫苗組的平均中和效價(jià)分別為1∶4、1∶22和1∶107。細(xì)胞滅活疫苗組高于陰性對(duì)照組、鼠腦滅活疫苗組和弱毒疫苗組,且差異均極顯著(P<0.01)。

        3 小結(jié)與討論

        目前我國(guó)豬乙型腦炎病主要采用弱毒活疫苗(SA14-14-2株)來進(jìn)行預(yù)防控制,圍繞該毒株也進(jìn)行了不少類型疫苗的研制與探索[5,6],但該疫苗毒株源于人用疫苗毒株,且能在中間宿主蚊子體內(nèi)增殖,雖然尚無該毒株反強(qiáng)的報(bào)道,但廣泛地應(yīng)用在豬乙型腦炎病的防控中是存在一定風(fēng)險(xiǎn)的。

        本研究對(duì)比了乙型腦炎鼠腦滅活疫苗(HW1株)、弱毒疫苗(SA14-14-2株)和自制細(xì)胞滅活疫苗(HW1株)對(duì)仔豬的免疫效果。從IgG抗體水平檢測(cè)以及血清中和試驗(yàn)的結(jié)果來看,自制細(xì)胞滅活疫苗的免疫效果要優(yōu)于鼠腦滅活疫苗(HW1株)和弱毒疫苗(SA14-14-2株),且免疫保護(hù)期與弱毒疫苗相當(dāng)??紤]到弱毒疫苗除激活體液免疫產(chǎn)生中和抗體外,還能引起機(jī)體的細(xì)胞免疫,下一步將開展動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn),進(jìn)一步評(píng)價(jià)豬乙型腦炎(HW1株)細(xì)胞滅活疫苗免疫效果。

        參考文獻(xiàn):

        [1] RUPINFERJEET K,MANISH R,SUDHANSHU V. Immunogenicity in mice of cationic microparticle-adsorbed plasmid DNA encoding Japanese encephalitis virus envelope protein[J].Vaccine, 2004,22(8):2776-2782.

        [2] 范 煜,曹瑞兵,陳溥言.2014年我國(guó)不同生態(tài)地區(qū)豬乙型腦炎野毒感染的流行病學(xué)調(diào)查[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].廣州:中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì),2014.

        [3] 許樂燕,徐聞青,徐帆洪,等.乙型腦炎病毒SA-(14)-14-2減毒疫苗株的生物學(xué)和基因穩(wěn)定性[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2008(10):833-837.

        [4] 馮 云,張海林,俞永新,等.三帶喙庫(kù)蚊胸腔接種乙型腦炎減毒活疫苗病毒的感染動(dòng)態(tài)及致病力觀察[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2007(3):278-281.

        [5] 李自力,陳煥春,徐高原,等.表達(dá)乙腦病毒PrM基因重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007,38(1):53-58.

        [6] 王曉杜,趙凡凡,代 兵,等.豬日本乙型腦炎病毒DNA復(fù)制子載體的構(gòu)建及外源基因表達(dá)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,46(1):111-118.endprint

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