亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        豬胞內(nèi)勞森氏菌lscN基因的克隆及序列分析

        2017-12-28 20:09:38張敏尹會(huì)方屠晶
        湖北畜牧獸醫(yī) 2017年12期

        張敏+尹會(huì)方+屠晶

        摘要:胞內(nèi)勞森氏菌是豬增生性腸炎的病原,試驗(yàn)設(shè)計(jì)4條引物,采用半巢式PCR從目的DNA中擴(kuò)增出1 317 bp的胞內(nèi)勞森氏菌lscN基因,并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明,lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%,是勞森氏菌三型分泌系統(tǒng)組件的編碼基因。

        關(guān)鍵詞:胞內(nèi)勞森氏菌;三型分泌系統(tǒng);PCR

        中圖分類號:Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1007-273X(2017)12-0010-02

        豬增生性腸炎(Porcine proliferative enteropathy,PPE)是由勞森氏菌(Lawsonia intracellularis,Li)感染引起的豬接觸性腸道傳染病[1]。該病主要發(fā)生在6~20周齡斷奶豬,育成豬也可感染,引起頑固性腹瀉,嚴(yán)重降低飼料轉(zhuǎn)化率,導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)受到經(jīng)濟(jì)損失[2]。三型分泌系統(tǒng)(Type Three Secretion System,TTSS)是一種跨細(xì)菌內(nèi)外膜、細(xì)胞外空間和宿主細(xì)胞膜的蛋白運(yùn)輸裝置,在革蘭氏陰性菌中廣泛存在,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在TTSS的致病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等[3]。英國學(xué)者David G.E. Smith 在2009年運(yùn)用染色體步移技術(shù)在Li分離株中鑒定到編碼TTSS的基因區(qū)域,其中l(wèi)scN是為效應(yīng)蛋白跨膜提供能量的ATP酶[4],因此,本試驗(yàn)對lscN進(jìn)行克隆及序列分析,為后續(xù)LscN蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 主要試劑 PCR LA Mix、PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、T4 DNA ligase、pMD18-T simple載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、GoldenView、瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司;Tris、EDTA-Na2、NaCl、LB培養(yǎng)基由龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系提供。

        1.1.2 引物 從GenBank中下載lscN(LI_RS02940)的序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物由上海華津生物科技有限公司合成,引物序列見表1。

        1.2 方法

        1.2.1 PCR擴(kuò)增 采用巢式PCR擴(kuò)增目的片段。第一重PCR反應(yīng)體系為:2×PCR LA Mix 12.5 μL,引物1、2各1 μL (10 pmol/L),模板DNA 1 μL,加滅菌超純水至25 μL;PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性4 min,95 ℃變性40 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。第二重PCR反應(yīng)體系為:2×PCR LA Mix 12.5 μL,引物3、4各1 μL (10 pmol/L),第一重PCR產(chǎn)物1 μL(100倍稀釋),加滅菌超純水至25 μL;PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性4 min,95 ℃變性40 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。同時(shí)設(shè)立空白對照。取第二重PCR產(chǎn)物5 μL加入上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后,用凝膠成像儀觀察并記錄結(jié)果。

        1.2.2 PCR產(chǎn)物回收 將余下的20 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下將目的條帶從瓊脂糖凝膠中切下,放入干凈的離心管中稱重。向膠塊中加入3倍體積Buffer G,50 ℃水浴10 min,其間溫和地上下顛倒數(shù)次。然后加入1倍體積異丙醇,上下顛倒混勻。向已裝入收集管中的吸附柱中加入200 μL Buffer S,12 000 r/min離心2 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。將前面得到的溶液加入到吸附柱中,室溫放置2 min,12 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。吸附柱中加入500 μL Buffer G,12 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入650 μL Buffer W,12 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中,空離2 min。將吸附柱放入1.5 mL離心管中,在吸附膜中央加入10 μL Buffer B,室溫靜置1~2 min,12 000 r/min離心1 min,回收得到目的片段。

        1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆T載體 取回收目的片段7 μL,pMD18-T載體0.5 μL,T4 DNA ligase 1.5 μL,T4 DNA ligase buffer 1 μL,4 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物5 μL,DH5α 50 μL加入1.5 mL離心管,冰浴30 min,然后42 ℃水浴90 s,接著再冰浴2 min,加入1 mL SOC,搖床振蕩培養(yǎng)45 min,吸取200 μL培養(yǎng)液涂布100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板,37 ℃培養(yǎng)過夜,然后挑菌,PCR鑒定。

        1.2.4 基因測序與序列分析 將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),送上海華津生物科技有限公司測序。對測序獲得的序列進(jìn)行同源性比較分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 目的片段擴(kuò)增結(jié)果

        采用巢式PCR擴(kuò)增目的片段。第一重PCR擴(kuò)增得到1 517 bp產(chǎn)物,第二重PCR擴(kuò)增得到1 317 bp產(chǎn)物(圖1),結(jié)果與預(yù)期相符。

        2.2 目的片段克隆T載體結(jié)果

        目的片段連接T載體后,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)過夜,細(xì)菌生長情況見圖2。

        挑取8個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接100 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基,PCR鑒定結(jié)果見圖3。1~3、5~8號菌均為陽性克隆。

        2.3 目的片段測序結(jié)果與序列分析

        采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具,將lscN與GenBank中的序列進(jìn)行比較,結(jié)果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%(圖4)。endprint

        3 小結(jié)與討論

        增生性腸炎以回腸炎和結(jié)腸隱窩未成熟細(xì)胞腺瘤樣增生為特征,引起飼料轉(zhuǎn)化率低下,豬只生長遲緩,很大程度上影響生豬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。勞森氏菌是增生性腸炎的致病菌,該菌專性細(xì)胞內(nèi)生長,微需氧,生長要求苛刻。因此,許多分子生物學(xué)技術(shù)難于應(yīng)用其上,相關(guān)研究十分有限,目前研究主要集中于運(yùn)用各種測序技術(shù)尋找在勞森氏菌致病性中發(fā)揮作用的基因或蛋白。英國學(xué)者David G.E. Smith 在2009年運(yùn)用染色體步移技術(shù)在其分離株LR189/5/83中鑒定到編碼三型分泌系統(tǒng)的基因區(qū)域,發(fā)現(xiàn)與耶爾森氏菌yscN、yscO、yscQ高度同源的基因lscN、lscO、lscQ,然而卻未見后續(xù)報(bào)道。

        TTSS與許多革蘭氏陰性菌毒力因子分泌有關(guān),現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在TTSS的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等。大腸桿菌通過TTSS改變宿主離子通道,傳遞效應(yīng)蛋白Tir、EspF、Map、EspG1、EspG2到宿主細(xì)胞中發(fā)揮毒力作用;沙門氏菌和志賀氏菌通過TTSS入侵宿主,影響宿主膜泡運(yùn)輸[5]。耶爾森氏菌YscN蛋白為ATPase,在識別底物和啟動(dòng)酶反應(yīng)中起作用,為伴侶蛋白綁定效應(yīng)蛋白提供能量[6]。YscO在大腸桿菌上的同源物EscO有穩(wěn)定EscN結(jié)構(gòu),刺激ATPase活化的作用[7],YscO并不發(fā)揮這樣的作用,而是識別與其綁定配體的保守基團(tuán)[8]。YscQ是TTSS注射小體內(nèi)環(huán)組件,由yscQ翻譯的兩個(gè)蛋白組成,可容納YscN。因此推測Li的LscN、LscO、LscQ有相似作用,故本試驗(yàn)對lscN克隆測序,為后續(xù)蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

        目前,歐美報(bào)道的豬勞森氏菌分離株有PHE/MN1-00(美國)、NWumn05(美國)、VPB4(美國)、GB106(美國)、DBumn06(美國)、D15540(丹麥)、PHE-BR(巴西)、963/3(英國)、916/91(英國)、LR189/5/83(英國)等。GenBank中報(bào)道全基因組序列的僅有PHE/MN1-00和N343兩株。采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具,將擴(kuò)增到的lscN與GenBank中的序列進(jìn)行比較,結(jié)果lscN與GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性為99%,說明該基因保守性較高。

        參考文獻(xiàn):

        [1] 俞道進(jìn).豬增生性腸炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2001,22(3):24-27.

        [2] 梁正維.增生性腸炎的嚴(yán)重威脅[J].國外畜牧學(xué):豬與禽,2000(5):54-55.

        [3] DIEPOLD A,WAGNER S. Assembly of the bacterial type III secretion machinery[J].FEMS Microbiology Reviews,2014,38(4):802-822.

        [4] ALBERDI M P,WATSON E,MCALLISTER G E M,et al. Expression by Lawsonia intracellularis of type III secretion system components during infection[J].Veterinary Microbiology,2009,139(3):298-303.

        [5] HODGES K,HECHT G.Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response[J].The Journal of Physiology,2012,590(3):433-440.

        [6] BLAYLOCK B,RIORDAN K E,MISSIAKAS D M,et al. Characterization of the Yersinia enterocolitica type III secretion ATPase YscN and its regulator,YscL[J].Journal of Bacteriology,2006,188(10):3525-3534.

        [7] ROMO-CASTILLO M,ANDRADE A,ESPINOSA N,et al. EscO,a functional and structural analog of the flagellar FliJ protein,is a positive regulator of EscN ATPase activity of the enteropathogenic Escherichia coli injectisome[J].Journal of Bacteriology,2014,196(12): 2227-2241.

        [8] MUKERJEA R,GHOSH P.Functionally essential interaction between Yersinia YscO and the T3S4 domain of YscP[J].Journal of bacteriology,2013,195(20):4631-4638.endprint

        国产自拍伦理在线观看| 亚洲AV无码日韩综合欧亚| 亚洲男人堂色偷偷一区| 精品人妻免费看一区二区三区| 国内精品国产三级国产avx| 国产丝袜美腿在线视频| 青青草极品视频在线播放| 中文字幕久久精品一区二区| 扒开美女内裤舔出白水| 色窝窝亚洲av网在线观看| 亚洲成a∨人片在线观看不卡 | 午夜精品久久久久久久99热| 久久人妻内射无码一区三区| 亚洲精品无码国模| 亚洲中文欧美日韩在线人| 亚洲专区在线观看第三页| 在线观看高清视频一区二区三区| 最新日本人妻中文字幕| 国产高潮视频在线观看| 亚洲爆乳少妇无码激情| 国产国拍亚洲精品午夜不卡17| 亚洲国产精一区二区三区性色| 久久91精品国产一区二区| 国产精品日日做人人爱| 亚瑟国产精品久久| 天天躁日日躁狠狠躁av中文 | 亚洲熟妇av日韩熟妇av| 国产午夜激情视频在线看| 内射白浆一区二区在线观看| 97人人超碰国产精品最新| 亚洲免费黄色| 特级毛片a级毛片在线播放www| 国产一区二区三区在线影院| 日本伦理精品一区二区三区 | 99在线精品免费视频九九视| 中字幕久久久人妻熟女| 欧美成人高清手机在线视频 | 麻花传媒68xxx在线观看| 国产av综合影院| 色综合久久加勒比高清88| 国产日产免费在线视频|