許可 韓彬 柏楊 周黎明

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

論著

miR-451a調(diào)控BAP31誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡

許可 韓彬 柏楊 周黎明△

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

目的：探討miR-451a及靶蛋白BAP31在結(jié)直腸癌中的作用。方法體外培養(yǎng)HCT116、SW620、SW480、DLD細(xì)胞，以Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-451a和BAP31的相對(duì)表達(dá)量；通過(guò)建立miR-451a不同表達(dá)情況的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116模型，應(yīng)用抑制消減雜交方法建立抑制消減文庫(kù)，從中篩選miR-451a的調(diào)控蛋白，并通過(guò)螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-451a的直接調(diào)控靶基因；采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)以及Hoechst染色法評(píng)價(jià)miR-451a調(diào)控的靶蛋白BAP31對(duì)結(jié)直腸細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果在抑制雜交消減文庫(kù)中得到了miR-451a可能調(diào)控的相關(guān)基因，其中在正向文庫(kù)中得到BAP31、EEF1A1和CDC20等7個(gè)基因，在反向文庫(kù)中得到DKK1和PSME1等4個(gè)基因。在HCT116、HT29、SW480、SW620和DLD結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-451a的相對(duì)表達(dá)量是正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中的0.32、0.44、0.53、0.43和0.73倍，BAP31在DLD、HT29、SW620和HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)量是正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中的1.85、2.84、2.37和3.71倍。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，miR-451a可作用于與BAP31開(kāi)放閱讀框上游177的位點(diǎn)，通過(guò)miR-451a作用使海腎熒光素酶的活性降低80.3%。在HCT116細(xì)胞和SW620細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-451a后72h抑制率分別為39.50%和39.50%；沉默BAP31后72 h抑制率分別為45.32%和53.56%。過(guò)表達(dá)miR-451a 48 h后HCT116凋亡增加13.57%，SW620細(xì)胞凋亡率增加13.2%；沉默BAP31 48 h后HCT116細(xì)胞凋亡增加5.62%，SW620細(xì)胞凋亡率增加8.68%。結(jié)論miR-451a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中能夠直接通過(guò)調(diào)控BAP31誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡從而抑制細(xì)胞的增殖。

結(jié)直腸癌；miR-451a；BAP31；凋亡

結(jié)直腸癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO報(bào)道截止2012年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率以2%的速度迅速上升，全球新診斷結(jié)直腸癌患病人數(shù)為136萬(wàn)例，占發(fā)病率第3位，而死亡人數(shù)也達(dá)69.4萬(wàn)例，占腫瘤患者死亡率的第二位[1]。而隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，中國(guó)城市結(jié)腸癌的發(fā)病率更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)際水平成為第四大常見(jiàn)惡性腫瘤，僅次于肺癌、胃癌和肝癌，僅2012年新發(fā)病例約40萬(wàn)人[2]。因此，結(jié)直腸癌是各國(guó)重點(diǎn)防治的惡性腫瘤之一。

MiR-451a定位于人類(lèi)染色體17q11.2，于2005年被Altuvia等人首次在人腦垂體RNA中發(fā)現(xiàn)并命名[3]。大量研究表明，miR-451a表達(dá)量在眾多腫瘤，如：慢性髓細(xì)胞白血病、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌、頭頸部鱗癌、胃癌中均明顯下調(diào)[4-8]，而且可以上調(diào)多藥耐藥基因的表達(dá)從而增加卵巢癌的化療耐藥性[9]。若過(guò)表達(dá)miR-451a則能顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的侵襲能力[10,11]，可見(jiàn)miR-451a在胃腸腫瘤中可能作為一個(gè)抑癌因子參與了消化道腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的調(diào)控。

B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31(B cell receptor associated protein 31，BAP31)是由738個(gè)核苷酸編碼246個(gè)氨基酸殘基，分子量為28 KD，屬于B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白家族，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，能與轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子進(jìn)行信號(hào)傳遞[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)，BAP31在宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、食道癌、肝癌、結(jié)直腸癌和肺癌組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)[14]，然而意義卻并不明確。本研究擬通過(guò)抑制消減雜交的方法，研究miR-451a可能調(diào)控的下游基因，并以文庫(kù)中篩選得到的下游基因BAP31為研究對(duì)象，探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

過(guò)表達(dá)miR-451a慢病毒Lv-miR-451a和空白對(duì)照慢病毒Lv-miR-451a-NC由中國(guó)漢恒公司構(gòu)建。pGM-T載體購(gòu)于北京天根生物公司，轉(zhuǎn)化用感受態(tài)大腸桿菌JM109菌株為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，感受態(tài)細(xì)胞制備由本實(shí)驗(yàn)室自己制備。雙熒光素酶報(bào)告載體pSicheck2.0購(gòu)于北京碧藍(lán)橙生物科技公司的。設(shè)計(jì)miR-451a過(guò)表達(dá)引物，擴(kuò)增miR-451a的前體序列，插入載體pcDNA-3.0載體中。設(shè)計(jì)BAP31沉默的引物和亂序引物Scramble插入載體psilencer-3.0+，引物稀釋成10 mM，并在DNA雜交液中，插入載體pcDNA-3.0載體中，引物如下表。根據(jù)http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/在線軟件工具RNAhybrid預(yù)測(cè)miR-451a可能對(duì)BAP31基因的調(diào)控位點(diǎn)，設(shè)計(jì)插入雙熒光素酶載體引物BAP31-(-148)、BAP31-(-177)、BAP31-(666)、BAP31-(3UTR)，見(jiàn)表1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HCT116、SW620、SW480、HT29、DLD結(jié)直腸癌細(xì)胞株，正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM60，以及用于雙熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)時(shí)均用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DEME培養(yǎng)基在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。293T細(xì)胞培養(yǎng)至聚合度為60%-80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)采用Lip2000，按照每μgDNA加入2 μL進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

細(xì)胞總RNA提取采用Trizol方法。向6孔板中每孔加入Trizol試劑500 μl，待細(xì)胞全部裂解后，收集裂解液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中；組織標(biāo)本從液氮中取100 mg，向樣品中加入Trizol試劑500 μl，組織勻漿機(jī)迅速勻漿后，收集勻漿液至1.5 mlEP 管中，加入Trizol至1 ml，室溫靜置5 min。加入氯仿0.2 ml，充分劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min。4℃、12000 g離心15 min，吸取上層水相，向水相中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4℃、12000 g離心10 min。移去上清液，加入預(yù)冷的75%DEPC水-乙醇1 ml，輕輕震蕩，洗滌沉淀，4℃、7500 g離心5 min。棄上清液，自然風(fēng)干5-10 min，加入DEPC水30 μl，溶解沉淀。取RNA樣品1 μl通過(guò)NanoDrop ND-1000微量分光光度計(jì)檢測(cè)各RNA樣品的質(zhì)量。樣品質(zhì)檢合格后立即用RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase，于42℃反應(yīng)60 min，75℃滅活5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放在冰上待用或-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄引物序列見(jiàn)表2。

1.4 Realtime-PCR

按VazymeAceQqPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，配置PCR反應(yīng)體系。Realtime-PCR于Bio-Rad CFX96定量PCR儀上進(jìn)行。最后用2-△△CT公式計(jì)算癌組織相對(duì)于癌旁組織中的miR-451a和BAP31相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表3。

表1 引物序列

表2 逆轉(zhuǎn)錄引物

表3 Realtime-PCR引物

1.5 抑制消減文庫(kù)建立

采用雙向的SSH來(lái)獲取差異表達(dá)基因，分別以轉(zhuǎn)染空白對(duì)照慢病毒HCT16 cDNA為T(mén)ester，以過(guò)表達(dá)miR-451a的HCT116的cDNA為Driver，得到正向文庫(kù)(Forward-subtracted library，F(xiàn)SL)；再以過(guò)表達(dá)miR-451a的HCT116的cDNA為T(mén)ester，以轉(zhuǎn)染空白對(duì)照慢病毒HCT16的cDNA為Driver得到反向文庫(kù)(Reverse-subtracted library，RSL)。采用SMART PCR技術(shù)合成雙鏈cDNA。在0.5 mL RNase-Free的Ep管中，采用SMART IIA Oligonucleotide引物，使用SMART Script Reverse Transcriptase (Clontech，10 U·mL-1)，逆轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，進(jìn)一步合成ds cDNA。兩組ds cDNA，分別用RsaI酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行兩輪雜交和兩輪PCR，產(chǎn)物經(jīng)純化并定量后連接到pGM-T載體中，16℃連接過(guò)夜。取連接產(chǎn)物5.0 μL加ddH2O 5.0 μL用于轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。涂布于含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆接種于2 mL含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將部分陽(yáng)性克隆送成都擎科公司測(cè)序。將序列登錄美國(guó)國(guó)家生物信息中心網(wǎng)站，用BLAST 軟件將得到的序列在線與GenBank中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。將測(cè)序所得的基因序列提交Http://www.omicsbean.com.cn進(jìn)行GO數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析，分析結(jié)果由網(wǎng)站提供。引物序列見(jiàn)表4。

1.6 組織總蛋白的提取和Western blotting

取組織各標(biāo)本組織 100 mg放入EP管中，并加入1 ml DNA/RNA/蛋白質(zhì)提取試劑盒中的GTC裂解液(每500 μL加入β-巰基乙醇10 μL)。用電動(dòng)勻漿器置于冰上勻漿，至肉眼不見(jiàn)塊狀組織為止，收集經(jīng)過(guò)提DNA、RNA柱子后的液體，轉(zhuǎn)入10 mLEP管中，加入4倍體積的預(yù)冷丙酮。-20℃沉淀過(guò)夜。12000 rpm 4℃離心10 min，棄上清，加入1 mL冰乙醇潤(rùn)洗12000 rpm 4℃離心3 min，加入600 μL蛋白Loading buffer，沸水煮10 min，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取稀釋好的樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳(分離膠12%，濃縮膠5%)，轉(zhuǎn)膜，4℃封閉過(guò)夜。一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后，再與HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，ECL顯色，照相。

表4 抑制消減雜交文庫(kù)所需引物

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建

將構(gòu)建的螢光素酶報(bào)告載體pSicheck-BAP31-148, pSicheck-BAP31-177, pSicheck-BAP31-666和pSicheck-BAP31-3UTR。當(dāng)293T細(xì)胞生長(zhǎng)至80%聚合度時(shí)，按照空白、pCDNA+pSicheck、pCDNA-miR451a+pSicheck、pCDNA-miR451a+pSicheck-148、pCDNA-miR451a+pSicheck-177、pCDNA-miR451a+ pSicheck-666、pCDNA-miR451a+ pSicheck-3UTR、pCDNA +pSicheck-148、pCDNA+pSicheck-177、pCDNA+pSicheck-666、pCDNA + pSicheck-3UTR按照miR-451a兩倍于psicheck載體的量共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在48 h后按照Promega 雙螢光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒操作，先用PBS洗滌后，加入PLB制成裂解液400 μl。將小量細(xì)胞裂解液20 μL和熒光素酶測(cè)試試劑II(LARII)100μL混合，螢火蟲(chóng)熒光素酶的活力立即用熒光照度儀檢測(cè)。檢測(cè)完后立即加入Stop &GloTM試劑100 μL，淬滅螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)，同時(shí)激活Renilla熒光素酶反應(yīng)，并立即檢測(cè)Renilla熒光素酶的活力。以熒火蟲(chóng)熒光發(fā)光強(qiáng)度為內(nèi)參，以pCDNA+pSicheck-NC組為陰性對(duì)照，得到其余各組海腎熒光相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。

1.8 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖能力

收集細(xì)胞，接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)5×103，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DEME培養(yǎng)基在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，將pcDNA、pcDNA-miR451a、pSilencer-Scr、psilencer-BAP31轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96、120 h后，將待測(cè)孔每孔加入MTT溶液(5 mg·mL-1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液。每孔加入DMSO150 μL，避光震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上于570 nm處檢測(cè)各孔吸光值(OD)。繪制對(duì)應(yīng)時(shí)間的生長(zhǎng)曲線。

1.9 Hoechst染色

HCT16、SW620轉(zhuǎn)染pcDNA-miR451a、pcDNA-NC、psilencer-BAP31及對(duì)照質(zhì)粒psilencer-Scr。48 h后用4%甲醛固定20 min，適當(dāng)洗滌去除固定劑。滴加少量Hoechst33342染液。室溫放置3-5 min。吸除Hoechst33342染色液，用PBS洗滌2次，每次3-5 min。封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.10 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，300 g，4℃離心5 min收集細(xì)胞。胰酶消化時(shí)應(yīng)注意觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞形狀發(fā)生變圓時(shí)，立即用含有血清的培養(yǎng)基終止消化。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌完畢后，均用300 g，4℃離心5 min。收集細(xì)胞，加入1×Binding Buffer 100 μL重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC5 μL輕輕混勻，避光在室溫反應(yīng)10 min，待上機(jī)檢測(cè)前10 min再加入PI Staining Solution5 μL，隨后加入1×Binding Buffer400 μL，混勻，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)量

2 結(jié)果

2.1 HCT116、HT29、SW620中miR-451a的表達(dá)情況

通過(guò)Realtime-PCR檢測(cè)常見(jiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT16、HT29、SW480、SW620、DLD與對(duì)照正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中miR-451a的表達(dá)量，結(jié)果表明：與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中的miR-451a表達(dá)量相比，miR-451a在HCT116、HT29、SW480、SW620和DLD細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.32、0.44、0.53、0.43、0.73倍，均顯著低于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中的表達(dá)量(P<0.05)；且在這五株細(xì)胞中，以HCT116、HT29、SW620中miR-451a的相對(duì)表達(dá)量最低，見(jiàn)圖1。

圖1 miR-451a在不同結(jié)直腸細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量注：與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460相比，*P<0.05、**P<0.01。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-451a的HCT116中，miR-451a表達(dá)上升

選擇miR-451a相對(duì)表達(dá)量最低的HCT116作為建庫(kù)的細(xì)胞株。利用構(gòu)建的miR-451a過(guò)表達(dá)慢病毒載體Lv-miR-451a和空白慢病毒載體Lv-miR-451a-NC轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株HCT116-Lv-miR-451a和HCT116-Lv-miR-451a-NC。通過(guò)Realtime-PCR檢測(cè)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過(guò)后細(xì)胞株中miR-451a的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明：HCT116-Lv-miR-451a中miR-451a相對(duì)表達(dá)量是未經(jīng)處理的HCT116細(xì)胞中的2.1倍，而HCT116-Lv-miR-451a-NC中miR-451a相對(duì)表達(dá)量是未經(jīng)處理的HCT116細(xì)胞中的1.07倍，HCT116- Lv-miR-451a中miR-451a的相對(duì)表達(dá)量是HCT116-Lv-miR-451a-NC里的1.96倍。HCT116-Lv-miR-451a中miR-451a相對(duì)表達(dá)量顯著高于HCT116-Lv-miR-451a-NC中的(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-451a過(guò)表達(dá)慢病毒載體Lv-miR-451a和空白慢病毒載體Lv-miR-451a-NC后，miR-451a的相對(duì)表達(dá)量注：與空白慢病毒載體Lv-miR-451a-NC相比，**P<0.01。

2.3 抑制消減文庫(kù)的建立

以HCT116-Lv-miR-451a細(xì)胞和HCT116-Lv-miR-451a-NC細(xì)胞互為Diver和Tester，構(gòu)建了正向和反向兩個(gè)文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)顯示：第二輪消減PCR產(chǎn)物大小在800-1200bp彌散，大小符合建庫(kù)要求，見(jiàn)圖3A；通過(guò)對(duì)保守基因GAPDH的定量分析，在消減聞庫(kù)中GAPDH被消減掉8.26倍，證明抑制消減文庫(kù)對(duì)相同基因的消減效率符合建庫(kù)要求，見(jiàn)圖3B。將經(jīng)純化后的第二輪PCR產(chǎn)物克隆到pGM-T載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，兩個(gè)文庫(kù)中總共獲得1149個(gè)陽(yáng)性克隆，其中正向庫(kù)728個(gè)，反向庫(kù)421個(gè)。對(duì)文庫(kù)中所獲得的陽(yáng)性克隆隨機(jī)挑取120個(gè)，其中正向庫(kù)75個(gè)，反向庫(kù)45個(gè)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示在正向庫(kù)中我們獲得了：BAP31、 EEF1A1、CDC20、WDR6、TUFM、RPL13和RPL7A這7個(gè)基因的EST序列，其中7個(gè)BAP31序列占總測(cè)序數(shù)的9.33%，4個(gè)RPL7A序列占總測(cè)序數(shù)的5.33%，EEF1A1和RPL13各3個(gè)分別占總測(cè)序數(shù)的4.0%，CDC20、WDR6和TUFM各1個(gè)，分別占總測(cè)序數(shù)的1.33%；在反向庫(kù)中我們獲得了：DKK1、PSME1、NDUFA3 和GNB2這4個(gè)基因的EST序列，其中5個(gè)DKK1序列占總測(cè)序數(shù)的11.11%，3個(gè)NDUFA3序列占總測(cè)序數(shù)的6.67%， EEF1A1和RPL13各1個(gè)分別占總測(cè)序數(shù)的%，PSME1和GNB2各1個(gè)，分別占總測(cè)序數(shù)的2.22%。以上11個(gè)基因的EST經(jīng)序列比對(duì)分析與人類(lèi)基因組中相對(duì)應(yīng)的基因同源性均為100%。

圖3 SSH文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè)注：A—正向消減文庫(kù)(L1)、反向消減文庫(kù)(L2)和Marker(L3)；B—GAPDH的相對(duì)表達(dá)水平

2.4 生物信息學(xué)結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)miR-451a所調(diào)控的這些基因在生化過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的GO分析，得到了正向文庫(kù)中所得到的7個(gè)基因主要與轉(zhuǎn)錄延伸(GO:0006414)，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的定位(GO:0070972)，蛋白質(zhì)的翻譯(GO:0006412)以及polyA RNA 的結(jié)合(GO:004482)高度相關(guān)；而反向文庫(kù)中的4個(gè)基因的聚類(lèi)分析主要與Wnt信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)有關(guān)。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，miR-451a所調(diào)控的這些基因參與了細(xì)胞分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，見(jiàn)圖4。

圖4 GO分析

2.5 BAP31在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中高表達(dá)

利用Realtime-PCR和Westerblot檢測(cè)在常見(jiàn)結(jié)直腸癌HCT16、HT29、SW620、DLD細(xì)胞株與對(duì)照細(xì)胞株正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中BAP31的表達(dá)量。結(jié)果顯示：以正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中的BAP31mRNA表達(dá)量為對(duì)照，在DLD、HT29、SW620和HCT116細(xì)胞中BAP31的表達(dá)量相對(duì)于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中BAP31表達(dá)量的1.85、2.84、2.37和3.71倍(P<0.01)，見(jiàn)圖5A。以正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中的BAP31表達(dá)量為對(duì)照，在DLD、HT29、SW620和HCT116細(xì)胞中BAP31蛋白的表達(dá)量是正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中BAP31表達(dá)量的1.97、2.20、3.22、和2.81倍(P<0.01)，見(jiàn)圖5B、C。

圖5 BAP31在不同細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量注：A—DLD、HT29、SW620、HCT116和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中BAP31mRNA的相對(duì)表達(dá)量；B—DLD、HT29、SW620、HCT116和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中BAP31 蛋白的相對(duì)表達(dá)量；C—蛋白質(zhì)灰度值掃描統(tǒng)計(jì)；與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460相比，**P<0.01。

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因證明BAP31為miR-451a的靶基因

經(jīng)過(guò)RNAHybrid工具預(yù)測(cè)后，選擇得分較高的3個(gè)位點(diǎn)，分別為BAP31上游177、上游148和開(kāi)放閱讀框內(nèi)(Opening reading frame，ORF)666位點(diǎn)，同時(shí)也考慮了microRNA常用作用方式的3′-UTR區(qū)域來(lái)作為miR-451a的作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究，見(jiàn)圖6A、C。將以上位點(diǎn)的序列克隆進(jìn)psicheck-2.0載體中，檢測(cè)載體上螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶的活性。螢光素酶報(bào)告基因的結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，在BAP31ORF上游177、148、ORF666和3′-UTR的預(yù)測(cè)位點(diǎn)，通過(guò)miR-451a作用后，海腎熒光素酶的活性分別降低了80.3%、30.1%、44.6%和42.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-451a對(duì)BAP31的ORF177位點(diǎn)的作用最強(qiáng)能顯著降低海腎熒光素酶的活性(P<0.01)，見(jiàn)圖6B。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)注：A—RNAHybrid預(yù)測(cè)得分較高的上游177、上游148和開(kāi)放閱讀框內(nèi)666位點(diǎn)與成熟miR-451a的結(jié)合位點(diǎn)示意圖；B—雙熒光素酶報(bào)告載體中所克隆的序列在BAP31基因上的位置示意圖。C—各克隆片段雙熒光素酶報(bào)告載體海腎熒光的相對(duì)強(qiáng)度。(與pSicheck空載體對(duì)照相比，** P <0.01)

2.7 過(guò)表達(dá)miR-451a，沉默BAP31可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖

HCT16、SW620轉(zhuǎn)染pcDNA-miR451a、pcDNA-NC、psilencer-BAP31及對(duì)照質(zhì)粒psilencer-Scr。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-451a，沉默BAP31后，HCT116、SW620兩株細(xì)胞分別在48 h后出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，達(dá)到72 h時(shí)，抑制效果最為明顯。HCT116細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-451a和沉默BAP31基因后，其48 h抑制率分別為：19.75%和28.23%，72 h抑制率分別為：39.50%和45.32%。SW620 細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-451a和沉默BAP31基因后，其48 h抑制率分別為：31.03%和29.25%，72 h抑制率分別為：39.50%和53.56%，見(jiàn)圖7。

圖7 過(guò)表達(dá)miR-451a和沉默BAP31后細(xì)胞活力測(cè)定注：A—HCT116細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-451a和沉默BAP31細(xì)胞相對(duì)活力；B—SW620細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-451a和沉默BAP31細(xì)胞相對(duì)活力

2.8 過(guò)表達(dá)miR-451a，沉默BAP31可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生

HCT16、SW620轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-451a質(zhì)粒pcDNA-miR451a、對(duì)照質(zhì)粒pcDNA-NC；psilencer-BAP31及對(duì)照質(zhì)粒psilencer-Scr。通過(guò)Hocheast染色及AnnexinV-FITC/PI 雙染色法流式細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞凋亡情況。Hocheast染色結(jié)果表明：過(guò)表達(dá)miR-451a或沉默BAP31后，核碎裂增多，凋亡明顯增加，見(jiàn)圖8。AnnexinV-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-451a 后HCT116凋亡增加13.57%，其中早期凋亡增加5.93%，晚期凋亡增加7.64%；沉默BAP31后HCT116凋亡增加5.62%，其中早期凋亡增加1.3%。晚期凋亡增加4.32%；過(guò)表達(dá)miR-451a后SW620的凋亡增加13.2%，其中早期凋亡增加7.1%。晚期凋亡增加6.1%；沉默BAP31后，SW620的凋亡增加8.68%，其中早期凋亡增加3.5%，晚期凋亡增加5.18%，見(jiàn)圖9。

圖8 Hocheast染色測(cè)定細(xì)胞凋亡(×100)

圖9 雙染法流式細(xì)胞檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-451a和沉默BAP31后HCT116、SW620細(xì)胞凋亡情況

3 討論

MiR-451a在慢性髓細(xì)胞白血病、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中低表達(dá)，同時(shí)在乳腺癌、卵巢癌耐藥細(xì)胞株中也低表達(dá)，我們進(jìn)一步在HCT116、HT29、SW480、SW620和DLD這五株結(jié)直腸癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了miR-451a的表達(dá)較正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞低，為后續(xù)抑制雜交消減文庫(kù)建立篩選細(xì)胞奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步研究miR-451a可能調(diào)控的基因，我們采用miR-451a相對(duì)表達(dá)最低的HCT116細(xì)胞，在只改變miR-451a表達(dá)量的前提下，建立了miR-451a差異表達(dá)的模型。首次利用SSH差異表達(dá)基因篩選的方法，建立了分別以轉(zhuǎn)染空白對(duì)照慢病毒HCT16 cDNA為T(mén)ester，以過(guò)表達(dá)miR-451a的HCT116的cDNA為Driver，得到正向文庫(kù)(FSL)；再以過(guò)表達(dá)miR-451a的HCT116的cDNA為T(mén)ester，以轉(zhuǎn)染空白對(duì)照慢病毒HCT16 cDNA為Driver得到反向文庫(kù)(RSL)，在結(jié)直腸癌中篩選到了miR-451a表達(dá)量改變后差異表達(dá)的基因。SSH的方法已在肺癌、食管癌、胃癌等重大疾病的差異表達(dá)基因的篩選上得到了成功的應(yīng)用，它采用兩次消減雜交和兩次PCR，保證了高特異性；通過(guò)雜交操作，可以獲得低豐度差異表達(dá)基因；使用SMARTerTMPCR cDNA Synthesis合成cDNA，只需2 ng總RNA，這對(duì)于微量RNA的富集起到了關(guān)鍵的作用。在我們建立的抑制雜交削減正向文庫(kù)中我們得到了BAP31, EEF1A1, CDC20, WDR6, TUFM, RPL13 和 RPL7A這7個(gè)基因，在反向庫(kù)中我們獲得了DKK1, PSME1, NDUFA3 和GNB2這4個(gè)基因。這說(shuō)明在結(jié)直腸癌中當(dāng)我們上調(diào)miR-451a的表達(dá)后，BAP31, EEF1A1, CDC20, WDR6, TUFM, RPL13 和 RPL7A這7個(gè)基因的表達(dá)下降了，而同時(shí)DKK1、PSME1, NDUFA3 和GNB2這4個(gè)基因的表達(dá)卻上調(diào)了。這提示我們BAP31, EEF1A1, CDC20, WDR6, TUFM, RPL13 和 RPL7A這7個(gè)基因有可能是作為miR-451a的直接靶基因被miR-451a所調(diào)控，而DKK1、PSME1, NDUFA3 和GNB2這4個(gè)基因有可能是作為miR-451a所調(diào)控的通路下游的分子，但仍受到miR-451a的調(diào)控，其更清晰的調(diào)控通路還需要進(jìn)一步的研究來(lái)證明。

通過(guò)對(duì)文庫(kù)中的基因的GO數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-451a調(diào)控的這些基因參與了細(xì)胞生化過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能等方面所起到的作用，主要體現(xiàn)在參與與了轉(zhuǎn)錄延伸、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的定位、蛋白質(zhì)的翻譯、以及polyA RNA的結(jié)合、負(fù)向調(diào)劑Wnt信號(hào)通路等過(guò)程。所以我們認(rèn)為miR-451a在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能很可能是通過(guò)調(diào)控的這些基因參與了細(xì)胞分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)。

BAP31在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，我們進(jìn)一步在HCT116、HT29、SW620和DLD這四株結(jié)直腸癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了BAP31的表達(dá)較正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞高，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了BAP31表達(dá)相對(duì)較高的HCT116和SW620作為我們的研究對(duì)象。MicroRNA在對(duì)靶基因的調(diào)控上，經(jīng)典的調(diào)控模式是與其靶基因的3′-UTR端進(jìn)行結(jié)合調(diào)控，目前大多數(shù)中microRNA靶基因預(yù)測(cè)的軟件大多基于這樣的思想，在microRNA作用堿基的配對(duì)預(yù)測(cè)上，多采用microRNA5′端作用6-7個(gè)堿基嚴(yán)格配對(duì)的模式進(jìn)行microRNA靶基因的預(yù)測(cè)。這種預(yù)測(cè)模式確實(shí)為microRNA所作用的靶基因的研究提供了大量的便利。但是隨著對(duì)microRNA的研究越來(lái)越深入，大量的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA對(duì)于靶基因的作用方式除了經(jīng)典的3′-UTR的結(jié)合外，還有可能在基因的5′-UTR，ORF區(qū)域結(jié)合并發(fā)揮其調(diào)控作用[15-17]。這樣多樣的作用方式在為microRNA靶基因預(yù)測(cè)方面提出了新的挑戰(zhàn)。我們?cè)谘芯縨iR-451a能否直接調(diào)控BAP31的時(shí)候，通過(guò)經(jīng)典的3′-UTR預(yù)測(cè)方法得到了結(jié)果顯示miR-451a對(duì)于BAP31的3′-UTR區(qū)域的作用并不強(qiáng)烈。但是通過(guò)我們SSH文庫(kù)中所得到miR-451a表達(dá)下調(diào)后BAP31的表達(dá)升高，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-451a的表達(dá)量較正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460表達(dá)下降，而B(niǎo)AP31表達(dá)較正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中表達(dá)升高，以及在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-451a后BAP31的表達(dá)量下降了這些結(jié)果，我們還是想驗(yàn)證一下miR-451a是否能直接作用于BAP31。雙熒光素酶結(jié)果讓我們感到驚奇，miR-451a對(duì)BAP31的5‘-UTR區(qū)域序列產(chǎn)生較強(qiáng)的螢光素酶抑制作用，也就是說(shuō)miR-451a可能是直接作用于BAP31的5′-UTR而發(fā)揮調(diào)控BAP31的作用的，這也證實(shí)了BAP31是miR-451a的直接作用靶基因。進(jìn)一步研究了miR-451a是如何通過(guò)調(diào)控BAP31在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用的。通過(guò)我們的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-451a或沉默BAP31 都能顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的研究我們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-451a或沉默BAP31能夠引起結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡增加，甚至在HCT116細(xì)胞中，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-451a或沉默BAP31時(shí)還能使部分細(xì)胞直接壞死。從這點(diǎn)看BAP31也有可能作為以后腫瘤治療中的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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MiR-451aregulatedBAP31incolorectalcancercellsinducedapoptosis

Xu Ke, Han Bing, Bo Yang, Zhou Li-ming△

(Department of Pharmacology, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine,Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective： To investigate the role of miR-451a and its target gene BAP31 in colorectal cancer cell lines.MethodsThe relative expression of miR-451a and BAP31 in colorectal cancer cell lines was detected by real-time PCR in HCT116, SW620, SW480 and DLD cells. The inhibitory subtractive library of colorectal cancer cell line miR-451a was established by suppressing subtractive hybridization method by using the different expressing of miR-451a HCT116 model. The BAP31 protein was selected as the study object of miR-451a.Luciferase reporter gene was used to determine whether BAP31 is directly regulated target genes of miR-451a by testing luciferase relative activity.The proliferation of colorectal cancer cells was evaluated by MTT assay. The apoptosis inducted by miR-451a regulated BAP31 was evaluated by flow cytometry and Hoechst staining.ResultsThe genes related to the possible regulation of miR-451a were obtained in the suppression subtractive library. Seven genes, such as BAP31, EEF1A1 and CDC20, were obtained in the positive library. DKK1, PSME1 and other genes were obtained in the reverse library. The relative expression levels of miR-451a in HCT116, HT29, SW480, SW620 and DLD colorectal cancer cells were 0.32, 0.40, 0.53, 0.43 and 0.73 times higher than those in normal colon epithelial cells NCM460. The relative expression of BAP31 in DLD, HT29, SW620 and HCT116 in colorectal cancer cells was 1.85, 2.84, 2.37 and 3.71 times higher than that in normal colon epithelial cells NCM460. Double-luciferase reporter gene experiments show that miR-451a can act on the upstream of the BAP31 open reading frame at 177 site, and the activity of renilla luciferase is reduced by 80.3%. Over-expressed miR-451a in the HCT116 and SW920 cells,the inhibitory rates of were 39.50% and 39.50% at 72 h, respectively; and the inhibitory rates were 58.32% and 53.56% at 72 h after silencing BAP31, respectively. The apoptosis of HCT116 and SW620 cells were increased 13.57% and 13.2% after 48 hours over-expressed miR-451a; the apoptosis of HCT116 and SW620 cells were increased 5.62% and 8.68%after 48 hours of silencing BAP31.ConclusionsMiR-451a can inhibit the proliferation of cells directly by regulating BAP31-induced apoptosis in colorectal cancer cells.

Colorectal cancer; miR-451a; BAP31; Apoptosis

許可，男，講師，主要從事化療藥理研究，Email：xkkls37@hotmai.com。

△通訊作者：周黎明，女，教授，主要從事化療藥理研究，Email：zhou108@163.com。

2017-3-23)