張 敬, 羅寶昌

(湖北省漢川市人民醫(yī)院， 湖北 漢川 431600)

臨床研究

抗凝狀態(tài)不同的血液標(biāo)本對實(shí)時熒光定量PCR法測定HBV-DNA結(jié)果的差異性研究

張 敬, 羅寶昌

(湖北省漢川市人民醫(yī)院， 湖北 漢川431600)

目的探討用不同抗凝劑及不含抗凝劑的真空采血管采集的標(biāo)本，對實(shí)時熒光定量(PCR)法檢測乙型肝炎病毒HBV-DNA結(jié)果的差異，為臨床選擇HBV-DNA標(biāo)本采集容器提供依據(jù)，也為臨床醫(yī)生分析不同標(biāo)本類型的HBV-DNA結(jié)果提供參考。方法用不同抗凝劑及不含抗凝劑的真空采血管采集標(biāo)本，全部利用沉淀煮沸裂解法提取HBV核酸采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA的含量。結(jié)果用不同抗凝劑的真空采血管采集的血漿樣本測定的HBV-DNA含量無顯著性差異(P>0.05)，但經(jīng)EDTA-2K和肝素鋰抗凝的血漿標(biāo)本與不含抗凝劑的血清標(biāo)本測定的HBV-DNA含量比較，結(jié)果顯著降低(P<0.05)。共檢測128份樣本，其中105例三種真空采血管所采集標(biāo)本的檢測結(jié)果均有數(shù)值，此105例總相關(guān)系數(shù)(r)為0.916(P<0.01)。結(jié)論不含抗凝劑的真空采血管采集的血清標(biāo)本測定的HBV-DNA含量顯著高于抗凝的血漿標(biāo)本。

抗凝狀態(tài)不同; HBV-DNA; 結(jié)果差異

乙型肝炎病毒是乙型病毒性肝炎的病原體，具有較強(qiáng)傳染性，傳播途徑復(fù)雜，流行面廣，發(fā)病率高，可導(dǎo)致急慢性乙型肝炎，淤膽型肝炎，嚴(yán)重的可導(dǎo)致急性肝衰竭，臨床主要表現(xiàn)為肝功能損害，部分患者可有黃疸，隱形感染也較為常見。目前臨床上常用的HBV檢測方法主要有酶免疫法，化學(xué)發(fā)光法檢測HBV標(biāo)志物和核酸檢測HBV-DNA，其中，HBV DNA的檢測和定量是診斷慢性HBV感染，監(jiān)測病毒學(xué)應(yīng)答和定制抗病毒治療方案的關(guān)鍵[1]。HBV DNA檢測對確診乙型肝炎和評估乙肝治療效果具有重要的作用[2].本文采用實(shí)時熒光PCR檢測技術(shù)，對EDTA-2K,肝素鋰，以及無抗凝劑的真空采血管采集的無溶血，無脂血的標(biāo)本進(jìn)行HBV-DNA定量檢測，通過對檢測結(jié)果的差異進(jìn)行分析，希望對建立完善的實(shí)驗室標(biāo)本采集指南有一定指導(dǎo)作用，也為臨床醫(yī)生分析不同標(biāo)本類型的HBV-DNA結(jié)果提供參考。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本:選取2016年7月至2017年7月我院感染科門診就診的128例患者，男66例，女62例，年齡(34.2±16.8)歲，均為已被臨床確診為乙型肝炎的抗病毒治療者。所有標(biāo)本均為清晨空腹采血，均無溶血和脂血。

1.2試劑與儀器:HBV-DNA的核酸提取采用上海復(fù)星生產(chǎn)的沉淀煮沸裂解試劑盒，HBV-DNA實(shí)時熒光定量PCR采用上海復(fù)星(PCR-熒光探針法)核酸定量檢測試劑盒(靈敏度500copies/mL,線性范圍500copies/mL～1.00E+8copies/mL)。SLAN-96P實(shí)時熒光定量儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。一次性真空采血管(含EDTA-2K,肝素鋰，無抗凝劑)購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。離心管和槍頭均由浙江拱東醫(yī)用塑料廠生產(chǎn)。

1.3標(biāo)本收集和處理:依據(jù)無抗凝血清管所檢測的HBV-DNA病毒含量，將所選取的128例標(biāo)本分為三組，其中HBV-DNA病毒含量小于5.00E+2copies/mL的標(biāo)本10例標(biāo)為A組；HBV-DNA病毒含量為5.00E+2～9.99E+7copies/mL之間的標(biāo)本108例標(biāo)為B組；HBV-DNA病毒含量大于1.00E+8copies/mL的標(biāo)本10例標(biāo)為C組。每位患者在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下平行采三管靜脈血，采血順序分別為無抗凝劑，肝素鋰，EDTA-2K,每管血量為2mL。采血完成后立即3600rpm離心5min分離血漿和血清置于2mL離心管內(nèi)-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4標(biāo)本DNA提取方法:使用上海復(fù)星提供的沉淀煮沸裂解試劑盒(1)取100μL待檢血清/血漿(凍存樣本使用前在室溫融解，振蕩混勻10s)分別加入100μL核酸提取液A,振蕩混勻10s，12000rpm離心10min，棄上清(2)分別加入50μL充分混勻的核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10s，100℃金屬浴保溫10min，12000rpm離心2min。上清即為PCR反應(yīng)所需核酸。

1.5熒光定量PCR檢測:取PCR反應(yīng)管加入反應(yīng)體系43μL，再加入上述核酸7μL。在SLAN-96P實(shí)時熒光定量PCR儀上擴(kuò)增并測定結(jié)果。擴(kuò)增條件為：50℃反應(yīng)2min，循環(huán)1次；94℃保溫5min，循環(huán)1次；94℃10s，60℃45s，循環(huán)5次；94℃10s，60℃45s，循環(huán)40次；60℃采集FAM﹑JOE熒光通道的信號。其中FAM通道檢測的為標(biāo)本，JOE通道檢測的為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析:HBV-DNA病毒含量經(jīng)換算成數(shù)值后用GraphPad Prism 6.0軟件做統(tǒng)計學(xué)處理。各組內(nèi)數(shù)據(jù)采用Wilcoxon配對檢驗以及Pearson相關(guān)性分析,P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1不同抗凝劑及無抗凝劑真空采血管對HBV-DNA檢測結(jié)果的差異。128例乙型肝炎患者同時采用EDTA-2K,肝素鋰以及無抗凝三種真空采血管采集標(biāo)本檢測HBV-DNA，三種標(biāo)本在同批次檢測。將無抗凝血清管所檢測的10例HBV-DNA病毒含量低于最低檢測限(小于5.00E+2copies/mL)的標(biāo)本標(biāo)記為A組,而A組標(biāo)本的EDTA-2K，肝素鋰管檢測的結(jié)果同時低于最低檢出限，結(jié)果沒有差異(P<0.05)。

2.2將無抗凝管檢測的HBV-DNA病毒含量為5.00E+2～9.99E+7copies/mL之間的108例標(biāo)本標(biāo)記為B組。其中有3例檢出HBV-DNA較低病毒含量的無抗凝標(biāo)本，與其相對應(yīng)的EDTA-2K和肝素鋰管所檢測的結(jié)果均低于檢出限，結(jié)果間不符。其余105例標(biāo)本三種真空采血管檢測結(jié)果均有數(shù)值，將無抗凝管分別與EDTA-2K,肝素鋰管檢測的結(jié)果比較，差異顯著(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)r=0.916(P<0.01),見表1。

表1 B組標(biāo)本無抗凝真空采血管及不同抗凝劑真空采血管檢測HBV-DNA的結(jié)果(對數(shù)值)

2.3將無抗凝管檢測的HBV-DNA病毒含量>1.00E+8copies/mL的標(biāo)本10例標(biāo)記為C組,C組標(biāo)本中有6例的EDTA-2K和肝素鋰管結(jié)果均>1.00E+8copies/mL，三種真空采血管所檢測結(jié)果相符。其余四例標(biāo)本的結(jié)果不符，差異顯著(P<0.05)，見表2。

表2 C組標(biāo)本無抗凝真空采血管及不同抗凝劑真空采血管檢測HBV-DNA的結(jié)果(copies/mL)

3 討 論

目前國內(nèi)檢測HBV-DNA較多采用構(gòu)建在TaqMan技術(shù)上的熒光定量PCR，該檢測方法具有實(shí)時監(jiān)測，靈敏快速，特異性強(qiáng)，定量范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[3]。但對熒光定量PCR準(zhǔn)確性造成影響的因素很多，除了PCR本身因素及反應(yīng)體系外，臨床樣品的采集裝運(yùn)和儲存條件亦會影響核酸的質(zhì)量，干擾HBV DNA的分析。

以往采集HBV-DNA標(biāo)本很多資料都推薦EDTA或枸櫞酸鈉，嚴(yán)禁使用肝素。但楊平嶺等[4]已報道過只有高濃度肝素(1250u/mL)才會抑制聚合酶鏈反應(yīng)，降低測定結(jié)果。臨床常規(guī)使用的中低濃度肝素與EDTA和枸櫞酸鈉對測定結(jié)果的影響無顯著差異(P>0.05)。高國生等[5]曾報道過含不同抗凝劑及促凝劑的真空采血管對HNV DNA檢測結(jié)果無明顯影響。但本人在日常工作中卻發(fā)現(xiàn)無抗凝血清和抗凝血漿樣本中HBV-DNA的含量有差異。

本文利用沉淀煮沸法提取臨床上常用的三種不同真空采血管所采HBV-DNA標(biāo)本的核酸模板，探討EDTA-2K,肝素鋰以及無抗凝管對實(shí)時熒光定量PCR法測定HBV-DNA結(jié)果的差異性。本研究中B組108例樣本，無抗凝管均檢測出病毒拷貝數(shù)值，而EDTA-2K和肝素鋰抗凝管均有三例漏檢，均<5.00E+2copies/mL.其余105例樣本的無抗凝管檢測數(shù)值也顯著高于EDTA-2K和肝素鋰管。C組10例樣本中，除6例均高于檢出限>1.00E+8copies/mL外，其余4例樣本的無抗凝管檢測數(shù)值均高于EDTA-2K和肝素鋰管。基于臨床對慢性乙型肝炎治療研究的深入，HBV-DNA檢測靈敏度的提高至關(guān)重要。綜上所訴，同一患者的標(biāo)本，無抗凝血清管比抗凝血漿管中的HBV-DNA含量高，有助于提高實(shí)驗的靈敏度，值得臨床推廣應(yīng)用。也正是鑒于此種差異性，臨床醫(yī)生在利用HBV DNA定量檢測了解乙肝患者的病毒含量基礎(chǔ)水平，評價藥物療效，判斷治療終點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)耐藥或復(fù)發(fā)的診療過程中也應(yīng)注意參考HBV-DNA檢測的標(biāo)本類型對檢測結(jié)果的影響。

[1] Fourati S C D P J. Evaluation of a new random-access HBV DNA moLecular assay: The VERIS HBV assay. - NCBI[Z].2017.

[2] 周乙華 .HBV DNA相關(guān)檢測的合理應(yīng)用和結(jié)果分析[J].臨床檢驗雜志，2012,30(11)：855～857.

[3] 陳小穎，龍璐，李瓊，等．基于+Pre-NAT+全自動核酸提取平臺的高敏+HBV+DNA+檢測性能評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015,10,38(10)：698～700.

[4] 楊平嶺，李金葉.ABI-7000熒光定量PCR檢測HBV-DNA影響因素的探討[J].齊魯醫(yī)學(xué)檢驗，2005,16,6:73.

[5] 高國生，姜俊，翁彭劍.不同標(biāo)本因素對熒光定量PCR法測定HBV DNA結(jié)果的影響[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2010,1,22(1):37～38.

ResearchontheDifferencesbetweenBloodSamplesAnticoagulatedDifferentofReal-timeFluorescentQuantitativePCRmethodfortheDeterminationofHBV-DNAResults

ZHANGJing,LUOBaochang

(ThePeople'sHospitalofHanchuan,HubeiHanchuan431600,China)

Objective: To investigate the use of anticoagulants and vacuum without anticoagulant blood samples were collected for real-time fluorescence quantitative (PCR) difference method for detection of hepatitis B virus HBV-DNA results, provide the basis for clinical selection of HBV-DNA specimen collection containers, different types of HBV-DNA specimens analysis results provide the reference for clinicians.MethodsWith different anticoagulants and vacuum without anticoagulant blood specimen collection, Extraction of HBV nucleic acids by precipitation boiling cracking method. The content of HBV-DNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsThere was no significant difference in HBV-DNA content between the plasma samples collected from the vacuum collecting vessels with different anticoagulants (P>0.05). However, the plasma levels of EDTA-2K and heparin anticoagulant plasma samples were significantly lower compared with the serum levels of HBV-DNA without anticoagulant (P<0.05). A total of 128 samples were detected, of which 105 samples were collected by three kinds of vacuum blood vessels. The total correlation coefficient (R) of the 105 cases was 0.916 (P<0.01). Conclusions: The content of HBV-DNA in serum samples without anticoagulant is significantly higher than that in anticoagulant plasma samples

Different anticoagulant state; HBV-DNA; Difference between the results

1006-6233(2017)12-2058-04

羅寶昌,Email810523213@qq.com

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.12.038