程瑩星， 黃 勇

(安徽省合肥市第二人民醫(yī)院腫瘤科, 安徽 合肥 230011)

HPV16-E6-DNA對宮頸癌預(yù)后價(jià)值分析

程瑩星， 黃 勇

(安徽省合肥市第二人民醫(yī)院腫瘤科, 安徽 合肥230011)

目的探究HPV16-E6-DNA對宮頸癌預(yù)后預(yù)測價(jià)值。方法回顧性分析本院2014年1月至2017年3月收治的72例宮頸癌患者臨床資料，抽血化驗(yàn)，采用熒光定量(PCR)技術(shù)測定HPV16-E6-DNA病毒載量，按照其檢測結(jié)果將患者分成兩組，即低載量組與高載量組，采用熒光定量(RT-PCR)測定宮頸癌患者組織中的HPV16-E6-DNA病毒載量，利用Kaplan-Meier計(jì)算方式計(jì)算兩組生存率，選用Cox回歸分析法分析影響患者5年生存率的因素。結(jié)果HPV16-E6-DNA病毒載量在宮頸癌患者組織表達(dá)水平與患者年齡、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；低載量組患者1、3、5年生存率分別為95.66%、89.31%、74.30%；高載量患者1、3、5年生存率分別是89.10%、62.61%、51.36%，低載量患者的生存率顯著高于高載量組(P<0.05)；Cox回歸分析結(jié)果顯示，HPV16-E6-DNA病毒載量以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響宮頸癌患者預(yù)后的重要因素(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論HPV16-E6-DNA病毒對宮頸癌患者預(yù)后具有重要預(yù)測價(jià)值，是宮頸癌根治術(shù)后預(yù)后監(jiān)測的重要因子，作為宮頸癌根治術(shù)后影響生存率的危險(xiǎn)獨(dú)立因素。

宮頸癌； HPV16-E6-DNA； 病毒載量

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，隨著人們生活習(xí)慣的改變，該病發(fā)病率呈年輕化趨勢，該病常見病因有高危型HPV感染、多個(gè)性伴侶、分娩次數(shù)及其他生物學(xué)因素等有關(guān)，主要以陰道流血、白帶異常、尿頻尿急等臨床表現(xiàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)[1,2]，該病約占生殖系統(tǒng)惡心腫瘤的首位，嚴(yán)重危及女性患者的生命健康。目前研究較多的高危型人乳頭瘤病毒DNA(high-risk human papillom avirus，HR-HPV)的表達(dá)、病理分型、腫瘤直徑、年齡、組織分化、深肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁浸潤、手術(shù)切緣陽性等[3]。由于檢測技術(shù)、地域、樣本量差異、人群等差異，故各大醫(yī)院檢測結(jié)果不一致，存在較多的爭論。鑒于此，本次研究對72例宮頸癌患者進(jìn)行分析，觀察HPV16-E6-DNA對宮頸癌預(yù)后預(yù)測價(jià)值，為患者預(yù)后的判斷及診治提供倫理依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1一般資料：回顧2014年1月至2017年3月我院婦科腫瘤手術(shù)切除的宮頸癌標(biāo)本135例，通過細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)確診為HPV16陽性患者72例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均為第一次手術(shù)，且手術(shù)前均未進(jìn)行放化治療等；②臨床分期按照2009《國際婦科聯(lián)盟(FIGO)》標(biāo)準(zhǔn)[4]；③隨訪資料完整；④腫瘤直徑測量根據(jù)婦科檢查，結(jié)合MR檢查結(jié)果確定，腫瘤直徑<4cm34例，≥4cm38例。深肌層浸潤為顯微鏡下可見宮頸外1/2肌層受到腫瘤侵犯。HPV16-E6-DNA病毒拷貝數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果分組。72例患者中鱗癌35例、腺癌37例，組織分化程度：低分化25例、中分化17例、高分化30例，最小年齡27歲，最大年齡78歲，平均年齡(55.23±5.14)歲。

1.2檢測儀器與方法：抽血化驗(yàn)，選用Qiagen DNA試劑盒(德國)提取凍存病變組織中的DNA，具體操作步驟應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，DNA溶液放置冰箱冷藏(-80℃)。選用實(shí)時(shí)熒光定量(PCR)儀檢測HPV16-E6-DNA載量。HPV16-E6基因的質(zhì)粒構(gòu)成：選用南京金斯瑞神曲科技公司提供的合成HPV16-E6基因，將其復(fù)制在pcDNA3.1-myc-HisA載體上。HPV16-E6-DNA含量檢測：選用標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)時(shí)熒光定量(PCR)技術(shù)，按照試劑盒說明書進(jìn)行DNA小量制作與純化，并計(jì)算拷貝數(shù)，檢測標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的HPV16-E6基因，獲得DNA含量，每一個(gè)樣品反復(fù)檢測3次，取平均值。

拷貝數(shù)=[質(zhì)量(g)×6.023×1023]÷(324.5×2×質(zhì)粒DNA長度)×100?；蚩截悢?shù)(copy/ng DNA )=[基因含量(copy/μL)] /[DNA含量(μg/μL)]

注：6.023×1023表示1摩爾物質(zhì)的分子數(shù)；324.5表示堿基的平均相對分子質(zhì)量。

1.3觀察指標(biāo)：從患者出院后開始跟蹤隨訪，前2年每半年隨訪一次，以后每年隨訪一次，隨訪方式為來院或電話隨訪。本次隨訪共72例，隨訪過程中2例中斷，隨訪率97.22%。分析HPV16-E6-DNA載量與臨床特征的關(guān)系、病毒載量對生存的影響及宮頸癌患者生存影響因素。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：全部數(shù)據(jù)初步以EpiData3.1軟件校正，選用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理；“n(%)”形式表示計(jì)數(shù)資料，以χ2檢驗(yàn)；采用多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析宮頸癌患者年齡，HPV16-E6-DNA病毒載量、FIGO分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等對宮頸癌患者預(yù)后影響。對于等級資料，采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1HPV16-E6-DNA載量與臨床特征的關(guān)系：表1結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮旁浸潤情況與載量有關(guān)(P<0.05)；其中組織分化程度、病灶類型、腫瘤直徑、肌層浸潤等與載量無關(guān)(P>0.05)。

2.2HPV16-E6-DNA病毒載量對生存率影響：低載量組1、3、5年生存率分別是95.66%、89.31%、74.30%；高載量患者1、3、5年生存率分別是89.10%、62.61%、51.36%，低載量患者的生存率顯著優(yōu)于高載量組(P<0.05)。

2.3分析宮頸癌患者生存狀況的影響因素:表2結(jié)果顯示，HPV16-E6-DNA載量與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者預(yù)后的重要因素(P<0.05)。

表1 HPV16-E6-DNA載量與臨床特征的關(guān)系n(%)

表2 分析宮頸癌患者生存狀況的影響因素

3 討 論

HPV屬于乳多空病毒科A成員之一，是一組沒有被包裹的較小DNA病毒，有種屬特異性和嗜上皮性。1971年由Mazumder D等[5]第一次提出宮頸癌是由HPV感染所致。目前多項(xiàng)研究已證明HPV感染均可導(dǎo)致宮頸癌或其他盆腔惡性腫瘤。文章結(jié)果顯示，宮頸癌患者組織中的HR-HPV E6蛋白陽性表達(dá)率與患者年齡、FIGO分期、組織類型、宮旁浸潤相關(guān)(P<0.05)。但和組織學(xué)分級、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道顯示[6]，高危型HPV感染患者均為>40歲女性，不能自行緩解，與CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌有關(guān)。這與本研究結(jié)果一致。文章研究結(jié)果顯示，宮頸鱗癌均為HPV16感染，而宮頸腺癌均為HPV18感染相關(guān)。本研究中的HPV E6蛋白在鱗癌的表達(dá)高于腺癌等其他類型。但關(guān)于HPV感染對宮頸癌浸潤能力的文獻(xiàn)報(bào)道過少。文章結(jié)果顯示，與HPV感染有關(guān)的高級鱗狀上皮內(nèi)病變、惡性腫瘤中的E6/ E7蛋白表達(dá)水平較高，說明這兩種蛋白的水平直接影響宮頸病變進(jìn)展，并與細(xì)胞惡化程度有關(guān)。據(jù)報(bào)道顯示[7]，特定的HPV16- E6變異將有很高的宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)。各項(xiàng)研究證明端粒酶的激活與宮頸異常增生與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。原因可能與HPV16- E6能提升端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶(HTERT)mRNA的水平，從而激活端粒酶，這是CIN向?qū)m頸癌發(fā)展的重要過程，其陽性表達(dá)率會(huì)隨著宮頸癌的病變程度而不斷升高等有關(guān)，且與宮頸癌的分期呈正相關(guān)[8]。

有學(xué)者指出[9]，高危型HPV在整合宮頸上皮細(xì)胞后，能促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞表達(dá)水平，導(dǎo)致腫瘤鄰近的組織形成新生血管與淋巴管，加快宮頸癌的擴(kuò)散，在上述因素共同作用下促進(jìn)病毒復(fù)制與繁殖，讓處于整合狀態(tài)的病毒癌基因的細(xì)胞不斷增生。這與本次的HPV16- E6蛋白及宮旁浸潤一致。說明高危型HPV- E6蛋白在促進(jìn)宮頸癌上皮癌變期間占據(jù)重要角色，HPV16在宮頸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移均有協(xié)助作用。

HR-HPV感染是誘發(fā)宮頸癌的主要因素。據(jù)流行病學(xué)資料顯示[10]，99.6%的宮頸癌患者均感染HR-HPV，基因型為HPV16，約占60%左右，HR-HPV E6/ E7癌基因和宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系。HR-HPV E6癌蛋白是病毒生命周期的重要蛋白，在宮頸癌病變過程中起主要作用，而且和病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡、宿主細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞增生、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變等相關(guān)，在各種作用機(jī)制下影響宮頸癌的進(jìn)展。本次研究通過提取宮頸癌患者組織中的DNA，采用熒光定量(PCR)技術(shù)測定HR-HPV E6-DNA病毒載量，分析其與宮頸癌病理學(xué)特征的關(guān)系及對患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。結(jié)果顯示，HR-HPV E6-DNA在宮頸癌組織中的表達(dá)與美國陰道鏡和宮頸病理協(xié)會(huì)(ASC-CP)中HPV高危亞型，特別是16和18亞型感染在宮頸病變中占據(jù)主導(dǎo)作用。

結(jié)果顯示，HR-HPV E6-DNA病毒載量與宮頸癌患者年齡有關(guān)，但我國對此類研究報(bào)道較少，為此需要深入探討。嚴(yán)鳴等[11]研究證實(shí)，HR-HPV E6-DNA病毒載量與宮頸癌FIGO分期有顯著性的關(guān)系，分期越晚的DNA中的病毒載量顯著高于早期宮頸癌患者，這與本次研究結(jié)果相符。曾四元等[12]對134例宮頸癌患者的外周靜脈血，利用PCR測定高危型HPV DNA病毒載量，結(jié)果提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的病毒載量顯著高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，結(jié)果顯示，HPV DNA病毒載量和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，這與本次研究結(jié)果一致。

Kaplan-Meier生存率分析結(jié)果顯示，宮頸癌預(yù)后因素與年齡有關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不符。其原因可能與以下情況有關(guān)，由于年輕患者更加注重每年一次的婦科體檢，加之年輕患者身體條件較好等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期、肌層浸潤、病理分級、宮旁浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最為突出，這與本研究結(jié)果一致。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[13]，淋巴轉(zhuǎn)移在大部分實(shí)驗(yàn)中都是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，這與本次研究多因素分析結(jié)果相符，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不會(huì)影響臨床分期，因此對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期宮頸癌患者在治療過程中應(yīng)更加重視，加強(qiáng)隨訪，同時(shí)建議患者進(jìn)行仔細(xì)檢查或是積極診治，避免加重病情進(jìn)一步惡化。本研究得知HR-HPV E6-DNA病毒載量作為宮頸癌預(yù)后的關(guān)鍵因素。有學(xué)者認(rèn)為HPV16- E6蛋白屬于宮頸上皮惡變的催化劑，在增生失控期間引起異常的VEGF-C，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的惡性循環(huán)，它在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中有主導(dǎo)作用。鑒于此，HPV16- E6在分子水平上進(jìn)行病情監(jiān)測、制定治療措施、評估預(yù)后均有重要價(jià)值。Kaplan-Meier生存率分析顯示，HR-HPV E6-DNA低載量組患者1、3、5年生存率分別為95.66%、89.31%、74.30%；而高載量患者1、3、5年生存率分別是89.10%、62.61%、51.36%，高載量組的生產(chǎn)率明顯低于低載量組(P<0.05)。

綜合上述，由于本次研究數(shù)量較少、還需進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對照試驗(yàn)，為探尋對臨床有著指導(dǎo)意義的預(yù)后因素。HR-HPV E6-DNA病毒載量用于宮頸癌患者預(yù)后評估，為指導(dǎo)治療發(fā)揮積極作用。

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ThePrognosticValueofHPV16-E6-DNAforCervicalCancer

CHENGYingxing,HUANGYong

(HefeiSecondPeople'sHospital,AnhuiHefei230011,China)

Objective: To explore the prognostic value of HPV16-E6-DNA in cervical cancer.MethodsA retrospective analysis of our hospital in January 2014 ～2017 year in March 72 cases of cervical cancer patients with clinical data, blood tests, using fluorescence quantitative (PCR) technique for detection of HPV16-E6-DNA virus load, according to the test results of the patients were divided into two groups, namely low load and high load group, using fluorescence quantitative (RT-PCR) determination of cervix cancer tissue HPV16-E6-DNA viral load, using Kaplan-Meier to calculate the survival rates of the two groups, using the factor Cox regression analysis in patients with 5-year-survival rates.ResultsThe expression levels of HPV16-E6-DNA viral load in patients with cervical cancer were related to age, FIGO stage and lymph node metastasis (P<0.05); The 1, 3 and 5 year survival rates of the patients in the low load group were 95.66%, 89.31% and 74.30% respectively; The 1, 3 and 5 year survival rates of the patients in the high load group were 89.10%, 62.61% and 51.36% respectively; The survival rate of patients in the low load group was significantly higher than that of high load group, the difference was statistically significant (P<0.05); Cox regression analysis showed that HPV16-E6-DNA viral load and lymph node metastasis were the important factors affecting the prognosis of patients with cervical cancer (P<0.05).ConclusionHPV16-E6-DNA virus is an important predictor of the prognosis of cervical cancer patients. It is an important factor in the prognosis of cervical cancer after radical resection. It is also an independent factor in the survival rate of cervical cancer after radical operation.

Cervical cancer; Patients; HPV16-E6-DNA; Viral load

1006-6233(2017)12-1944-05

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目編號(hào)，(編號(hào)2016J019)

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.12.003