(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.013

石河子地區(qū)棉花苗期葉斑病病原菌種類鑒定

李映程，張國(guó)麗，楊 超，任毓忠，李 卓，張 莉，李國(guó)英

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

目的研究石河子地區(qū)棉花苗期葉斑病病原菌種類。方法棉花苗期，采集石河子地區(qū)典型葉斑病樣120個(gè)，用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離和純化，共得到105個(gè)鏈格孢屬(Alternariaspp.)菌株，選取其中15個(gè)代表性菌株，通過(guò)致病性測(cè)定、常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定及組蛋白3基因序列分析，對(duì)病原菌種類進(jìn)行鑒定。結(jié)果供試15個(gè)代表性菌株均具有致病性。形態(tài)學(xué)測(cè)定，可將其鑒定為A.alternata和A.tenuissima兩類；基于組蛋白3基因序列分析，前一類與A.alternata(AF404620、KF997067和KR866858)相似性達(dá)99%，后一類與A.tenuissima(KT384348)相似性達(dá)99%以上。結(jié)論2016年引起石河子地區(qū)棉花苗期葉斑病的病原菌為A.alternata和A.tenuissima。

棉苗葉斑病；病原菌；鑒定

0 引 言

【研究意義】棉花葉斑病是新疆棉花上的一種常見病害，但對(duì)其缺乏比較系統(tǒng)地研究。2016年4月下旬和整個(gè)5月北疆棉區(qū)低溫高濕，棉花苗期葉斑病大發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)100%，盡快搞清其病原種類對(duì)其防治具有十分重要的意義。【前人研究進(jìn)展】棉花葉斑病是一種世界性病害，其中鏈格孢菌(Alternariaspp)是一類重要的病原，但各地報(bào)道引起葉斑病的鏈格孢菌種類存在較大差異。田逢秀[1](1995)、簡(jiǎn)桂良[2](2003)認(rèn)為引起我國(guó)棉花輪紋斑的鏈格孢菌以大孢鏈格孢菌(A.macrospora)、細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)和棉鏈格孢菌(A.gossypina)等為常見；李莎[3](2011)認(rèn)為引起輪紋斑病的鏈格孢菌94%由鏈格孢菌 (A.alternata)引起，6%由大孢鏈格孢菌(A.macrospora)引起；賈菊生[4]鑒定引起新疆棉花葉斑病的病菌主要是鏈格孢菌(A.alternata)和大孢鏈格孢菌(A.macrospora)。近年來(lái)研究證明，鏈格孢屬級(jí)特征明顯，種級(jí)特征變異較大，所以僅根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行種的鑒定比較困難，特別是鏈格孢屬小孢子組的一些種，必須結(jié)合分子生物學(xué)的手段，才能將其準(zhǔn)確鑒定到種[5，6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)王泰云[7](2014)、楊超[8](2017)研究，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析組蛋白3基因序列，可以較好的分辨出小孢子鏈格孢類群。研究通過(guò)組蛋白3基因序列分析，結(jié)合其形態(tài)特征，進(jìn)一步對(duì)石河子棉區(qū)棉花葉斑病菌進(jìn)行鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】根據(jù)病原的形態(tài)特征，結(jié)合組蛋白3基因序列分析，進(jìn)一步查明新疆石河子地區(qū)棉花苗期葉斑病的病原種類。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年春季由于石河子地區(qū)持續(xù)低溫多雨，棉花葉斑病大發(fā)生，為鑒定其病原，分別從石河子大學(xué)試驗(yàn)站、新疆農(nóng)墾科學(xué)院、121團(tuán)、143團(tuán)、石河子總場(chǎng)、148團(tuán)進(jìn)行調(diào)查，并采集具有典型葉斑癥狀的120個(gè)病樣供分離鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離與純化

采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離，首先將具典型癥狀的發(fā)病葉片用自來(lái)水清洗干凈，然后在病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm的小塊，用0.1%的升汞處理5～10 s，后用無(wú)菌水清洗3遍，再用無(wú)菌的吸水紙將病組織上的水分吸干，最后將其移入PDA平板上，將其置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后觀察分離結(jié)果，并采用常規(guī)稀釋法[9]進(jìn)行單孢分離純化，將純化的菌株接于PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d后置4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的致病性測(cè)定

采用離體葉片接種法。采集植株相同部位的健康葉片，清洗干凈，用75%酒精輕輕擦拭葉片表面，消除雜菌，再用無(wú)菌的縫衣針輕輕刺傷葉片表面，4℃處理24 h后接種；用少量無(wú)菌水洗下PDA平板培養(yǎng)了7 d的分生孢子，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量孢子濃度，配置成1×107個(gè)/mL分生孢子的懸浮液，采用噴霧法進(jìn)行接種，待葉片表面布滿小液滴為好，以無(wú)菌水為對(duì)照，置于(12×12) cm墊有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的發(fā)芽盒中，在智能光照培養(yǎng)箱中，白天18℃，夜間12℃培養(yǎng)，定期觀察并記錄發(fā)病情況。發(fā)病后，觀察其癥狀并進(jìn)行分離，鏡檢與原接種菌的異同。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

用刀片直接在病斑上刮取分生孢子，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)、顏色和分生孢子的縱橫隔膜數(shù)，并測(cè)量50個(gè)分生孢子的大小。在無(wú)菌操作下，根據(jù)采集地點(diǎn)和分離菌株的數(shù)量，選取15個(gè)具有代表性的菌株，分別將其轉(zhuǎn)接到PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察各菌落的顏色并記錄其形態(tài)特征。采用常規(guī)的玻片培養(yǎng)法[10]，25℃下培養(yǎng)5 d，觀察并記錄分生孢子的著生狀態(tài)并拍照，參照張?zhí)煊頪11]對(duì)病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將供試15個(gè)代表性菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用滅菌刀片刮取菌絲于無(wú)菌的研缽中，加液氮冷凍充分研磨，收集研磨物，采用BioFlux試劑盒提取真菌基因組DNA。采用引物H3-1a(5’-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3’)和H3-1b (5’-GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT-3’，由上海生物工程股份有限公司合成)，PCR擴(kuò)增各試驗(yàn)菌株組蛋白3基因的部分編碼序列[7]。反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性2 min；96℃變性15 s，55℃退火30 s，75℃延伸35 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸2 min，反應(yīng)體系為25 μL。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在凝膠成像儀上觀察并拍照。在ZF-90型多功能暗箱式紫外透射儀下切取目的條帶，使用全式金凝膠回收試劑盒(Easy Pure Quick Gel Extraction Kit)回收目的片段。將回收純化的目的片段直接與pMD19-T載體連接，在4℃下孵育過(guò)夜。連接產(chǎn)物通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化菌液涂布于加有Amp的麥康凱平板上，37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，直至長(zhǎng)出單菌落。挑取白斑菌落，進(jìn)行PCR檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆，篩選出的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子穿刺于LB固體培養(yǎng)基中，送到上海生物工程有限公司測(cè)序。

將供試菌株的組蛋白3基因部分序列的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，應(yīng)用MEGA 5.0軟件中的臨近法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株間的親緣關(guān)系，確定分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉苗葉斑病的癥狀

2016年經(jīng)在石河子地區(qū)6個(gè)棉田單位調(diào)查，棉花葉斑病在石河子大學(xué)試驗(yàn)站、新疆農(nóng)墾科學(xué)院、121團(tuán)、143團(tuán)、石河子總場(chǎng)、148團(tuán)均發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)100%。其田間癥狀表現(xiàn)為：發(fā)病初期子葉上產(chǎn)生近圓形或不規(guī)則形的黑褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)展成近圓形或不規(guī)則形，直徑2～3 mm的病斑，邊緣常有清晰的黃褐色暈圈，嚴(yán)重時(shí)病斑相互愈合形成較大的褐色枯死斑，引起葉片枯焦或病斑脫落成穿孔。人工接種一般5 d左右開始出現(xiàn)水浸狀的斑點(diǎn)，稍微擴(kuò)展后組織壞死，產(chǎn)生與田間相似的癥狀 。圖1

2.2 病原菌分離及代表性菌株的選擇

從石河子地區(qū)共采集具有典型葉斑癥狀的病樣120個(gè)，成功分離出105個(gè)鏈格孢屬(Alternariaspp.)菌株，分離率為87.50%。依據(jù)采集地點(diǎn)、分離菌株的數(shù)量，選取15個(gè)具有代表性的菌株，供病原鑒定。表1

表1 菌株編號(hào)及來(lái)源
Table 1 Number and source of strain

序號(hào)Ordernumber菌株編號(hào)Strain采集地點(diǎn)Origin采集時(shí)間Acquisitiontime1121-1石河子地區(qū)121團(tuán)2016年5月24-3石河子總場(chǎng)3連2016年5月34-9Ld石河子總場(chǎng)9連2016年5月4148-4-2石河子地區(qū)148團(tuán)2016年5月5148-10-1石河子地區(qū)148團(tuán)2016年5月6148-11-3石河子地區(qū)148團(tuán)2016年5月7S1石河子大學(xué)試驗(yàn)站2016年4月8SN2石河子農(nóng)墾科學(xué)院2016年5月9121-2石河子地區(qū)121團(tuán)2016年5月10143-9-1石河子地區(qū)143團(tuán)2016年5月11143-8-8石河子地區(qū)143團(tuán)2016年5月11143-2石河子地區(qū)143團(tuán)2016年5月134-9Lx石河子總場(chǎng)9連2016年5月144-9-4石河子總場(chǎng)9連2016年5月15148-8-3石河子地區(qū)148團(tuán)2016年5月

2.3 病原菌的致病性測(cè)定

室內(nèi)接種5 d后，葉片開始出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn)，以后組織壞死呈褐色斑點(diǎn)，癥狀與田間病害癥狀相似，15個(gè)代表性菌株均會(huì)引起葉片發(fā)病，對(duì)照組棉花葉片則未出現(xiàn)癥狀。從發(fā)病組織中再次分離的菌株與原接種菌形態(tài)特征一致。根據(jù)柯赫氏法則，說(shuō)明供試菌株就是造成田間棉花葉斑病的病原菌。圖1

注：A:接種細(xì)極鏈格孢菌；B:接種鏈格孢菌；C:田間癥狀

Note: A:A.alternatainoculated； B: extremely fineA.tenuissimainoculated； C: symptoms in the field

圖1 棉花苗期葉斑病癥狀
Fig.1 Symptoms of leaf spot of cotton seedling

2.4 棉花葉斑病的病原菌鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)觀察，可將供試菌株分為兩類。一類在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，其菌落中央略微隆起，褐色或深褐色，毛氈狀，分生孢子梗單生或簇生，直立或彎曲，分生孢子單生或2～11個(gè)串生，黃褐色或褐色，棒狀、倒梨形，有喙或無(wú)喙，喙孢錐形或短柱狀，孢身表面有刺突，具0～7個(gè)橫隔，0～2個(gè)縱膈或斜隔，大小為(12.5～35.0) μm×(5.0～12.5) μm。將其初步鑒定為A.alternata。圖2A、C、E

另一類在PDA上培養(yǎng)7 d產(chǎn)生的菌落，中央略微隆起，灰白色至深灰綠色或深橄欖綠色，絨毛狀。分生孢子梗單生或簇生，直立或曲膝狀彎曲，分生孢子倒棍棒形、卵圓形或近橢圓形，淡褐色至暗褐色，單生或7～15個(gè)串生，有喙或無(wú)喙，喙孢錐形或短柱狀，孢身表面有刺突，具0～6個(gè)橫隔，0～2個(gè)縱隔或斜隔，大小為(7.5～30.0) μm×(5.0～10.0) μm。將這些菌株初步鑒定為A.tenuissima(圖2 B、D、F)?？梢妰烧咴谛螒B(tài)上比較相似，差別較小。圖2

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

采用H3-1a/H3-1b引物對(duì)15種代表性菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別擴(kuò)增出大小為546和494 bp的片段。經(jīng)BLAST比對(duì)，所測(cè)1～6號(hào)菌株與A.tenuissima(KT384348)相似性達(dá)100%，與A.tenuissima(KT384290)相似性達(dá)99%；7～15號(hào)菌株與A.alternata(AF404620、KF997067和KR866858)相似性達(dá)99%。表1，圖3

通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，用組蛋白3基因很容易將供試菌株區(qū)分為兩個(gè)類群，即A.alternata和A.tenuissima，且A.alternata比例高于A.tenuissima，但所有供試菌株與大鏈格孢A.macrospora都不聚在一起，說(shuō)明在石河子棉區(qū)苗期暫未發(fā)現(xiàn)由A.macrospora引起的葉斑病。圖4

圖2 鏈格孢(A、C、E)和細(xì)極鏈格孢(B、D、F)菌落、分生孢子及著生方式
Fig.2 A.alternata (A、C、E) and A.tenuissima (B、D、F) colonies, sub spore and the mode of production

注：第1～6為A.tenuissima；7～15為A.alternata；16為陰性對(duì)照；M為標(biāo)準(zhǔn)分子大小DL，2 000 bp

Note： 1-6:A.tenuissima; 7-15:A.alternataand 16: negative control; lane M:molecular size marker DL, 2,000 bp

圖3 病原菌組蛋白3基因PCR擴(kuò)增
Fig.3 The result of the PCR of pathogen's histone 3 gene segment

圖4 病原菌與相似種組蛋白3基因序列發(fā)育樹
Fig.4 Dendrogram of histone 3 gene sequences of the pathogen and its related

3 討 論

據(jù)劉偉[12]報(bào)道，棉花葉斑病多發(fā)生于棉花幼苗期子葉及成株期葉片，若此時(shí)陰雨連綿、大量降雨，氣溫偏低，易造成該病流行，這與2016年4～5月石河子地區(qū)棉花葉斑病大爆發(fā)的情況類似。

關(guān)于由鏈格孢菌引起的棉花葉斑病病原種類，不同地區(qū)存在明顯差異。Sciumbato G L和Pinckard J A[13](1972)報(bào)道印度棉花輪紋斑病是由大孢鏈格孢菌引起的；美國(guó)的密蘇里、路易斯安那州以及以色列是由大孢鏈格孢造成的。在國(guó)內(nèi)，簡(jiǎn)桂良[2](2003)認(rèn)為棉輪紋斑病由多種鏈格孢菌引起，其中主要為A.tenuissima。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，棉輪紋斑病以大孢鏈格孢(A.macrocpora)、細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)和棉鏈格孢(A.gossypina)等為常見種，最常見的為大孢鏈格孢(A.macrospora)。李莎等[3]經(jīng)鑒定，認(rèn)為在國(guó)內(nèi)該病94%主要由鏈格孢菌(A.alternata)引起，6%由大孢鏈格孢菌(A.macrospora)引起。賈菊生[4](1994)通過(guò)采集南北疆病樣鑒定，認(rèn)為石河子和瑪納斯棉區(qū)的葉斑病病原為A.arternata。這次以形態(tài)學(xué)特征同時(shí)結(jié)合組蛋白3基因序列分析，將引起石河子棉區(qū)苗期葉斑病的病原鑒定為兩個(gè)種，即A.alternata和A.tenuissima，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)大孢鏈格孢(A.macrocpora)和棉鏈格孢(A.gossypina)。

在鏈格孢菌中，A.alternata和A.tenuissima都屬于小孢子種。大量研究證明，鏈格孢菌的分生孢子梗及孢子的形態(tài)、大小受環(huán)境影響較大，即使在相同的培養(yǎng)條件下，不同種孢子形態(tài)容易趨同，給準(zhǔn)確鑒定造成很大障礙，特別是鏈格孢菌小孢子種在人工培養(yǎng)條件下孢子形狀、大小有趨同傾向，單憑形態(tài)學(xué)特征很難將其鑒定到種。近年來(lái)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)在病原菌鑒定方面的應(yīng)用越來(lái)越多。王洪凱等[15]研究發(fā)現(xiàn)ITS、mt LSU、b/ eta-tubulin、EF-1α、CAL、ACT和CHS等核苷酸序列在小孢子鏈格孢種間差異很小或沒(méi)有差異，不能準(zhǔn)確區(qū)分小孢子鏈格孢種。研究采用特異性引物H3-1a/H3-1b，對(duì)組蛋白3基因序列分析，能夠很好的將這兩個(gè)小孢子鏈格孢種進(jìn)行區(qū)分，這一研究結(jié)果與王泰云等[7]報(bào)道的結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

經(jīng)對(duì)石河子棉區(qū)所采120個(gè)典型葉斑病樣分離培養(yǎng)和鑒定，分離出105個(gè)鏈格孢屬(Alternariaspp.)菌株，分離率為87.50%。選用其中15個(gè)代表性菌株進(jìn)行致病性測(cè)定都可引起葉斑病，說(shuō)明鏈格孢菌 (Alternariaspp.)是引起葉斑病的主要病原。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和致病性測(cè)定,以及采用特異性引物H3-1a/H3-1b，對(duì)組蛋白3基因序列分析，能夠很好將其分為兩個(gè)種，即鏈格孢(A.alternata)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)，其中鏈格孢占60%，細(xì)極鏈格孢占40%。兩者形態(tài)比較相似，僅憑形態(tài)學(xué)很難將兩者進(jìn)行區(qū)別，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析組蛋白3基因序列，能夠很好的將兩者區(qū)別開來(lái)。2016年在石河子棉區(qū)苗期嚴(yán)重發(fā)生的葉斑病，主要由鏈格孢(A.alternata)和細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)引起。

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IdentificationofPathogensCausingLeafSpotDiseaseatCottonSeedlingStageinShiheziArea

LI Ying-cheng, ZHANG Guo-li, YANG Chao, REN Yu-zhong, LI Zhuo, ZHANG Li, LI Guo-ying

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

ObjectiveThe aim of the study is to verify the pathogens that cause cotton seedling leaf spot in Shihezi area.Method120 samples of cotton leaf spot were collected from Shihezi area, and 105 strains ofAlternariaspp were isolated and purified by conventional method, and 15 representative strains were identified through survey of morphological characteristics, test of pathogenicity and sequence analysis of histone 3 gene.ResultThe selected 15 representative strains were pathogenic. The pathogens were preliminarily identified asA.alternataandA.tenuissimaaccording to morphological characteristics, respectively. Based on histone 3 gene sequence analysis, the results showed that the similarity of nucleotide homogeneity ofA.alternata(AF404620, KF997067 and KR866858) was 99% andA.tenuissima(KT384348) was more than 99%, respectively.ConclusionThe pathogens causing cotton seedling leaf spot areA.alternataandA.tenuissimain Shihezi in 2016.

cotton seedling leaf spot; pathogen; identification

Supported by: Selection of High-yield and Fine-quality Peanuts Varieties and Study on the Cultivation(2016B01008-2)

LI Guo-ying(1941-), male, native place: Hebei, Professor, research field: plant pathogenic fungi and fungal diseases. (E-mail)lgyshzu@163.com

ZHANG Li(1970-), female, native place: Jiangsu, Ph. D., research field: plant pathology. (E-mail)1602784618@qq.com

S435.621

A

1001-4330(2017)11-2060-07

2017-08-28

科技部中小企業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目(14C26216513812)

李映程(1994-)，男，甘肅人，碩士，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，(E-mail)1363731850@qq.com

李國(guó)英(1941-)，男，河北人，教授，研究方向?yàn)橹参锊≡婢驼婢『Γ?E-mail)lgyshzu@163.com

張莉(1970-)，女，江蘇人，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，(E-mail)1602784618@qq.com