(1.巴里坤哈薩克自治縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆哈密 839200；2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3. 新疆阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.020

PPRV中國新疆南疆株F基因遺傳演化分析

張路瑤1，2，李 飛2，3，焦海宏2，趙 麗2，劉永宏2

(1.巴里坤哈薩克自治縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆哈密 839200；2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3. 新疆阿克蘇地區(qū)動物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000)

目的分析中國新疆南疆2014年P(guān)PRV毒株來源，為中國新疆南疆PPR防控提供理論依據(jù)。方法調(diào)查中國新疆南疆阿克蘇地區(qū)某羊場發(fā)病羊發(fā)病情況、臨床癥狀觀察及病理學(xué)檢查，實驗室進(jìn)行PPRVF基因RT-PCR和F基因測序，進(jìn)一步對PPRVF基因序列分析。結(jié)果毒株與國內(nèi)PPRV毒株F基因核苷酸同源性最高的是中國新疆China/XJYL/2013毒株，與國外的毒株F基因核苷酸同源性最高的是印度Izatnagar/94毒株及Izatnagar-94毒株；此次毒株與國內(nèi)PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性最高的是中國新疆China/XJYL/2013毒株，與國外的PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性最高的是印度Izatnagar/94毒株。PPRV毒株F基因進(jìn)化樹分析顯示：PPRV毒株與北京PPRV毒株進(jìn)化關(guān)系最近，與中國新疆伊犁PPRV毒株同屬一個分支，與國外印度及孟加拉國毒株的進(jìn)化關(guān)系較近。結(jié)論2014年中國新疆南疆存在PPR疫情，該疫情毒株與此次疫情前后國內(nèi)的PPR毒株及印度PPR毒株進(jìn)化關(guān)系較近。

小反芻獸疫；診斷；F基因；序列分析

0 引 言

【研究意義】小反芻獸疫(Peste Des Petits Ruminants, PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste Des Petits Ruminants Virus, PPRV)引起小反芻動物的一種急性烈性高度接觸性傳染病[1]。中國2013～2014年P(guān)PR疫情起始于中國新疆，并在中國形成了大流行，對中國養(yǎng)羊業(yè)造成了極其嚴(yán)重的危害，目前該病仍然威脅著中國小反芻獸的健康，調(diào)查清楚各地PPR流行毒株及其特征，對該病的防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1942年，科特迪瓦報道全球首次PPR疫情[2]，并逐漸擴(kuò)散到非洲中部、阿拉伯半島、中東[3-6]和亞洲的印度[7]、巴基斯坦[8-9]等地。2007年7月，PPRV傳入中國西藏阿里地區(qū)[10]；2007年11月，中國西藏阿里地區(qū)有4個縣報道PPR疫情的發(fā)生[11]；2008年2月，西藏野生巖羊發(fā)生PPRV感染[12]；2008年6月，西藏那曲地區(qū)發(fā)生PPR疫情[13]；2010年5月，西藏日土縣發(fā)生PPR疫情[14]。2013年11月，中國新疆伊犁地區(qū)霍城縣暴發(fā)PPR疫情[15]。2013年11月～2014年9月，中國有20多個省份相繼發(fā)生PPR疫情。2015年中國有8個省份報道PPR疫情的發(fā)生，2016年中國有6個省份報道PPR疫情的發(fā)生[16]。PPRV為單股負(fù)鏈RNA病毒，從3′到5′依次為：N-P-M-F-H-L 6個基因。PPRVF基因全長2 321 bp，共編碼546個氨基酸，F(xiàn)蛋白作為病毒表面的纖突蛋白，起著破壞靶細(xì)胞膜的作用[17-19]。PPRV主要感染小反芻動物，以發(fā)熱、口鼻分泌物增多、口鼻黏膜糜爛壞死、腸炎和肺炎為主要特征[20]。胃腸道及呼吸道的出血、壞死[21-22]，結(jié)腸與直腸結(jié)合部有斑馬條紋狀出血，病羊多組織出現(xiàn)嗜酸性胞漿包涵體的多核巨細(xì)胞[23]?！颈狙芯壳腥朦c】通過對PPRVF基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，可以反映PPRV以時間為軸線的演變過程。研究通過對中國新疆南疆阿克蘇地區(qū)某羊場發(fā)病羊的流行病學(xué)調(diào)查作出初步診斷，結(jié)合分子生物學(xué)手段對PPRVF基因片段進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，從而為PPRV在不同地域之間的傳播途徑提供線索?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察和病理學(xué)剖檢對中國新疆南疆阿克蘇地區(qū)某羊場發(fā)病羊進(jìn)行病例分析，進(jìn)一步通過分子生物學(xué)手段對PPRVF基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、測序及基因序列分析，確定中國新疆南疆PPR疫情來源及PPRV隨時間的演變特征，為PPR疫情防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料

實驗地點為新疆阿拉爾市塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室。病料獲得時間為2014年5月。

10%福爾馬林液固定的病死羊組織，來自中國新疆南疆阿克蘇地區(qū)某羊場。陽性對照為新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司Nigeria 75/1株弱毒疫苗。

1.1.2 引物

按照引物的設(shè)計原則，利用Primer Premier 5.0分子生物學(xué)軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的PPRV基因序列作為參照，設(shè)計PPRVF基因特異性引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。上游引物為3'-GCTCCGGCAAGGTCCCTC-5′，下游引物為3'-CTGAGTTTCTTGCGTCCT-5′，預(yù)期擴(kuò)增大小1 808 bp。

1.1.3 主要試劑及儀器

AllPrep DNA/RNA FFPE Kit(Code No. 80234)，購自凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司；TaKaRa RNA LA PCRTMKit(AMV)Ver.1.1(Code No.: RR012A)，購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA marker Ⅲ(Code No.: MD103)，購自天根生化科技(北京)有限公司；Gold view、6×Loading Buffer。PCR儀(TC-5000, Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(jī)(R134a, Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY-12，北京市六一儀器廠)，紫外分析儀(JY02S，北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司)，購自上海珂淮儀器有限公司等。

1.2 方 法

1.2.1 中國新疆南疆PPR病例分析

對中國新疆南疆阿克蘇地區(qū)某羊場發(fā)病羊進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查、臨床癥狀觀察及病理學(xué)剖檢，分析病例。

1.2.2 中國新疆南疆PPRV F基因序列分析

按照AllPrep DNA/RNA FFPE Kit試劑盒，從福爾馬林固定組織提取總RNA；用自行設(shè)計合成的引物，按照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit(AMV)Ver.1.1試劑盒進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增PPRVF基因，退火溫度為52.7℃。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定后，將特異性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司測序。用DNAStar和DNAMAN分子生物學(xué)軟件，對PPRVF基因測序片段進(jìn)行拼接，并對其進(jìn)行序列比對和遺傳演化分析，列出參考毒株。表1

表1 參考毒株
Table 1 Reference strai

序號No.Genebank登錄名GenebankAccessionNumbers毒株名StrainName序列名SequenceName備注Remarks1KC812765BD/PPR/Dhaka-1/2010Bangladesh2010孟加拉國2010Bangladesh20102KR781450Benin/B1/1969Benin1969貝寧1969Benin19693KR781449Benin/10/2011Benin2011貝寧2011Benin20114KP868655CH/GDDG/2014CHGDDG2014中國廣東2014Guangdong,China20145KM089830CH/HNNY/2014CHHNNY2014中國河南2014Henan,China20146KM089831CH/HNZK/2014CHHNZK2014中國河南2014Henan,China20147KM089832CH/HNZM/2014CHHNZM2014中國河南2014Henan,China20148KP260624China/BJ/2014ChinaBJ2014中國北京2014Beijing,China20149KM816619GZL-14ChinaJilin2014中國吉林2014Jilin,China201410EU364809China/Tibet/0701ChinaTibet0701中國西藏2007Tibet,China200711FJ905304China/Tibet/Geg/07-30ChinaTibet0730中國西藏2007Tibet,China200712JF939201China/Tib/07ChinaTibet2007中國西藏2007Tibet,China200713JX217850Tibet/Bharal/2008ChinaTibet2008中國西藏2008Tibet,China200814KT633939China/XJBZ/2015ChinaXJBZ2015中國新疆巴州2015BazhouofXinjiang,China201515KX951414China/XJNJ/2014ChinaXJNJ2014實驗株experimentalstrains16KM091959China/XJYL/2013ChinaXJYL2013中國新疆伊犁2013YiliofXinjiang,China201317KX354359PPRV-FYChinaZheJiang2015中國浙江2015Zhejiang,China201518EU267273ICV89Coted'Ivoire1989科特迪瓦1989Coated'Ivoire198919KR781451CIV/01P/2009Coted'Ivoire2009科特迪瓦2009Coated'Ivoire200920KJ867540Ethiopia1994Ethiopia1994埃塞俄比亞1994Ethiopia199421KJ867541Ethiopia2010Ethiopia2010埃塞俄比亞2010Ethiopia201022KJ466104Ghana/NK1/2010Ghana2010加納2010Ghana201023KR140086Izatnagar/94India1994印度1994India199424KJ867542Sungri1996MSDIndia1996印度1996India199625KR261605India/TN/Gingee/2014India2014印度2014India201426KT270355IND/TN/GIN/2014/01India201401印度2014India201427KX033350IND/Delhi/2016/05India2016印度2016India201628FJ750562Bhopal2003IndiaBhopal2003印度2003India200329JN632534Guj/2007IndiaGuj2007印度2007India200730KF752444Izatnagar-94IndiaIzatnagar-94印度1994India199431GQ410434Jhansi/2003IndiaJhansi2003印度2003India200332GQ410435Revati/2006IndiaRevati2006印度2006India200633GQ452015Sungri-96IndiaSungri96印度1996India199634KF648287Kurdistan2011IraqKurdistan2011伊拉克2011Iraq201135KM463083KN5/2011Kenya2011肯尼亞2011Kenya201136KU236379Lib/2015Liberia2015利比里亞2015Liberia201537KC594074Morocco2008Morocco2008摩洛哥2008Morocco200838KC609746Morocco-2008Morocco-2008摩洛哥2008Morocco200839HQ197753Nigeria/75/1Nigeria1975尼日利亞1975疫苗株Nigeria1975Vaccinestrain

續(xù)表

表1 參考毒株
Table 1 Reference strai

序號No.Genebank登錄名GenebankAccessionNumbers毒株名StrainName序列名SequenceName備注Remarks40EU267274Ng76/1Nigeria1976尼日利亞1976Nigeria197641KR828814NGKW2012-MSLNNigeria2012尼日利亞2012Nigeria201242KR828813NGYO2013-2162Nigeria2013尼日利亞2013Nigeria201343X74443Nigeria/75/1Nigeria75-1尼日利亞1975Nigeria197544KJ867544Oman1983Oman1983阿曼1983Oman198345KP789375E32/1969Senegal1969塞內(nèi)加爾1969Senegal196946KM212177SnDk11I13Senegal2013塞內(nèi)加爾2013Senegal200347NC_006383Turkey2000Turkey2000土耳其2000Turkey200048KJ867543Uganda2012Uganda2012烏干達(dá)2012Uganda201249KJ867545UAE1986UnitedArabEmirates1986阿拉伯聯(lián)合酋長國1986UnitedArabEmirates1986

2 結(jié)果與分析

2.1 病例調(diào)查

中國新疆南疆阿克蘇地區(qū)某羊場養(yǎng)羊580只，均為綿羊。2014年5月，該羊場89只羊發(fā)病，病情嚴(yán)重者50余只，其中27只死亡，發(fā)病羊日齡段以2月齡左右為主，雌性和雄性均有。該群羊PPR疫苗免疫情況參差不齊，成年羊全部強(qiáng)制免疫新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司Nigeria 75/1株弱毒疫苗，羔羊未免疫。

發(fā)病急，病羊表現(xiàn)為高熱，精神沉郁，食欲減退或廢絕，口鼻大量灰白色惡臭狀分泌物，可見淚斑，咳嗽，呼吸困難，拉稀，消瘦。

病死羊眼、口、鼻、肛門周圍粘有飼草料等；鼻孔周圍、牙齦、舌頭、唇部可見糜爛和潰瘍；肺臟不同區(qū)域顏色不一，表面富有光澤，間質(zhì)增寬，出現(xiàn)多處暗紅色、質(zhì)度較實區(qū)域，切面有紅色泡沫性液體流出(圖1a)；腸黏膜面有暗紅色紋理(圖1b)；淋巴結(jié)灰紅色，切面不平整；腎臟表面有灰黃色斑塊；其他臟器無明顯眼觀病變。圖1

(a)肺表面富有光澤，出現(xiàn)大面積暗紅色或紫色區(qū)域，質(zhì)度較硬；(b)腸黏膜面見紅色條紋

(a) The surface of the lung is full of luster, there is a large area of dull red or purple area, and the quality is hard; (b) Intestinal mucosal surface appear red stripe.

圖1 綿羊小反芻獸疫尸體剖檢
Fig.1 Post mortem in sheep with peste des petits ruminants (PPR)

2.2 RT-PCR結(jié)果

按照AllPrep DNA/RNA FFPE Kit試劑盒對福爾馬林固定組織樣品提取總RNA，根據(jù)PPRVF基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得片段產(chǎn)物大小約為1 808 bp的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，對照成立。圖2

2.3 F基因核苷酸序列分析

研究通過對福爾馬林固定組織樣品提取總RNA、RT-PCR及測序獲得的中國新疆南疆PPRV毒株F基因命名為China/XJNJ/2014，其與來自于Genbank數(shù)據(jù)庫的48個F基因全序列進(jìn)行核苷酸序列比對。核苷酸同源性分析結(jié)果顯示：試驗China/XJNJ/2014毒株與西藏4個PPRV毒株F基因核苷酸同源性范圍為97.6%～97.7%；與此次PPR疫情報道的第一株，即新疆伊犁China/XJYL/2013毒株F基因核苷酸同源性為99.9%，與中國新疆巴州China/XJBZ/2015毒株F基因核苷酸同源性為98.4%；同中國內(nèi)地毒株F基因核苷酸同源性范圍為99.6%～99.9%，其中同源性最低的是河南CH/HNZM/2014毒株，同源性為99.9%的有北京China/BJ/2014毒株、吉林GZL-14毒株和浙江PPRV-FY毒株；與國外PPRV毒株的F基因核苷酸同源性范圍為87.9%～98.2%，其中同源性最低的為肯尼亞KN5/2011毒株和烏干達(dá)Uganda 2012毒株，同源性最高的為印度Izatnagar/94毒株和Izatnagar-94毒株均達(dá)98.2%；與印度2014年毒株India/TN/Gingee/2014和IND/TN/GIN/2014/01毒株F基因核苷酸同源性分別為97.3%和97.1%，與印度2016年毒株IND/Delhi/2016/05毒株F基因核苷酸同源性為97.1%；試驗PPRV China/XJNJ/2014毒株F基因與中國目前使用的疫苗株Nigeria/75/1毒株的F基因核苷酸同源性為92.7%。表2

進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示：China/XJNJ/2014毒株與北京China/BJ/2014毒株進(jìn)化關(guān)系最近，與中國2013年以后的9個毒株共同構(gòu)成一個小分支；與國外毒株對比分析，2013～2014年P(guān)PR疫情毒株與印度IND/TN/GIN/2014/01毒株、IND/TN/GIN/2014/01毒株、IND/Delhi/2016/05毒株及孟加拉國BD/PPR/Dhaka-1/2010毒株關(guān)系最近；中國14個毒株、印度11個毒株、孟加拉國1個毒株、摩洛哥2個毒株、伊拉克1個毒株、土耳其1個毒株、埃塞俄比亞Ethiopia 2010毒株和尼日利亞NGYO2013-2162毒株共同構(gòu)成第Ⅳ譜系；阿曼1個毒株、阿拉伯聯(lián)合酋長國1個毒株、肯尼亞1個毒株、烏干達(dá)1個毒株和埃塞俄比亞Ethiopia 1994毒株共同構(gòu)成PPRV第Ⅲ譜系；貝寧2個毒株、加納1個毒株、利比里亞1個毒株、科特迪瓦CIV/01P/2009毒株和塞內(nèi)加爾SnDk11I13毒株，包括尼日利亞的Nigeria/75/1毒株、Ng76/1毒株、NGKW2012-MSLN毒株和Nigeria/75/1毒株，共同構(gòu)成PPRV第Ⅱ譜系；PPRV譜系Ⅰ由科特迪瓦ICV89毒株和塞內(nèi)加爾E32/1969毒株構(gòu)成。圖3

2.4 F蛋白氨基酸序列

將試驗獲得的PPRV China/XJNJ/2014毒株 F蛋白氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的48個PPRV F蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示：試驗China/XJNJ/2014毒株F蛋白氨基酸與西藏的4個毒株F蛋白氨基酸同源性范圍為98.7%～98.9%；與2個中國新疆毒株，即中國新疆伊犁China/XJYL/2013毒株和中國新疆巴州China/XJBZ/2015毒株F蛋白氨基酸同源性分別為100%和98.7%；同中國內(nèi)地毒株F蛋白氨基酸同源性范圍為99.8%-100%，其中與河南CH/HNZK/2014毒株、北京China/BJ/2014毒株、吉林GZL-14毒株和浙江PPRV-FY毒株F蛋白氨基酸同源性均為100%；與國外PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性范圍為94.1%～99.3%，其中同源性最低的為科特迪瓦ICV89毒株，同源性最高的為印度Izatnagar/94毒株為99.3%，與印度2014年毒株India/TN/Gingee/2014和IND/TN/GIN/2014/01毒株及2016年IND/Delhi/2016/05毒株F蛋白氨基酸同源性均為98.7%；與中國目前使用的疫苗株Nigeria/75/1的F蛋白氨基酸同源性為96.7%。表2

M：Maker Ⅲ；1：XJNJ-F；2：陽性對照(弱毒疫苗)；3：陰性對照

M: Maker Ⅲ; 1: XJNJ-F; 2: Positive control (Attenuated vaccine); 3: Negative control

圖2 PPRV F基因PCR擴(kuò)增
Fig.2 Amplification of PPRV F gene by PCR

圖3 來自不同地區(qū)和不同年代的小反芻獸疫病毒毒株F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.3 Phylogenetic tree of F gene of PPRV isolated from different regions and different ages

3 討 論

3.1 PPR臨床病例

根據(jù)對中國新疆南疆阿克蘇地區(qū)某羊場發(fā)病情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病羊主要集中為未免疫PPR的2月齡左右的羔羊，呼吸道和消化道病變明顯，同時結(jié)合發(fā)病情況、臨床癥狀及眼觀病理變化分析，初步疑似該群羊感染PPRV。實驗室進(jìn)一步從福爾馬林固定組織病料提取RNA進(jìn)行RT-PCR及F基因序列分析。

3.2 F基因核苷酸序列

根據(jù)PPRVF基因核苷酸同源性結(jié)果分析，試驗所獲得China/XJNJ/2014毒株與中國西藏的4個毒株F基因核苷酸同源性較中國其他省份PPRV毒株F基因核苷酸同源性低，與中國新疆伊犁2013年毒株的進(jìn)化關(guān)系最高。2013年中國新疆伊犁暴發(fā)PPR疫情之后，由于國家采取強(qiáng)有力的防制措施，使得中國新疆表象上控制了該疫情，但中國新疆仍然存在隱性感染PPRV的羊。中國新疆南北疆養(yǎng)羊業(yè)均較發(fā)達(dá)，羊產(chǎn)品貿(mào)易及活羊調(diào)運(yùn)頻繁，加之南北疆羊肉價格存在顯著差異，這樣隱性感染PPRV的羊很有可能從北疆被調(diào)運(yùn)入南疆，并在南疆長期存在PPR病原，當(dāng)環(huán)境因素發(fā)生較大變化時，隱性感染的羊則很容易出現(xiàn)顯性癥狀，導(dǎo)致南疆發(fā)生PPR疫情。試驗毒株與此次疫情中國內(nèi)地毒株核苷酸同源性較高。中國新疆作為中國的養(yǎng)羊大省，其羊產(chǎn)品遠(yuǎn)銷北京、浙江、廣東等內(nèi)地省份，以及活羊調(diào)運(yùn)使PPRV傳播風(fēng)險也較高，所以導(dǎo)致中國新疆PPR疫情傳入內(nèi)地。

試驗所獲得的PPRV毒株F基因與國外PPRV毒株F基因核苷酸同源性最高的是印度Izatnagar/94毒株，印度與中國相鄰且PPR疫情多發(fā)[24]，有文獻(xiàn)報道2013年中國新疆伊犁PPR疫情可能由中國周邊國家傳入[25]。另外，試驗毒株與印度近年發(fā)生的PPR毒株India/TN/Gingee/2014、IND/TN/GIN/2014/01和IND/Delhi/2016/05F基因核苷酸同源性也較高。研究發(fā)現(xiàn)中國新疆南疆PPRV毒株與中國新疆伊犁PPRV毒株F基因核苷酸同源性最高，推測中國新疆南疆PPR疫情可能是由于印度PPR疫情傳入中國新疆伊犁后，延續(xù)到中國新疆南疆地區(qū)。試驗毒株與國外肯尼亞KN5/2011毒株F基因核苷酸同源性最低，肯尼亞地處非洲東部，與中國相距較遠(yuǎn)，PPRV的地區(qū)差異及各毒株的地域分布導(dǎo)致試驗毒株與肯尼亞毒株F基因同源性最低。China/XJNJ/2014毒株與中國目前所使用的PPRV弱毒疫苗毒株F基因核苷酸同源性僅為92.7%，所以中國新疆南疆該次疫情是由于接種PPR疫苗后毒力返強(qiáng)而導(dǎo)致發(fā)病的可能性較低。

PPRVF基因作為麻疹病毒屬中高度保守的基因，在PPRVF基因全序列中其5′端的序列具有PPRV的病毒特異性，前人的研究發(fā)現(xiàn)PPRVF基因序列能反映出PPRV隨時間的演變規(guī)律，有利于分析PPRV在不同的地理區(qū)域的傳播規(guī)律[26]。并根據(jù)PPRVF基因的特異性將PPRV分成4個分支依次為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[27]，雖然PPRV被分為4個譜系，但只有一個血清型[28]。根據(jù)試驗獲得的PPRV毒株F基因核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的48個PPRV毒株F基因核苷酸序列進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果表明，試驗毒株F基因進(jìn)化關(guān)系與中國2013年之后的PPR疫情毒株進(jìn)化關(guān)系較近，與西藏毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國周邊國家中印度及孟加拉國的毒株進(jìn)化關(guān)系較近。Kwiatek等[29]利用PPRVN基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，第Ⅳ譜系均來自于亞洲，而研究發(fā)現(xiàn)位于西非尼日利亞2013年NGYO2013-2162毒株被劃分為第Ⅳ譜系。這與前人的報道不一致，可能與尼日利亞毒株的變異有關(guān)，也可能是不同的基因片段分析結(jié)果存在差異。劉永宏等[30]根據(jù)PPRV毒株F基因核苷酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建也發(fā)現(xiàn)非洲西北部的摩洛哥毒株屬于第Ⅳ譜系，這與研究的結(jié)果一致。前人的研究中塞內(nèi)加爾毒株只屬于第Ⅰ譜系，研究發(fā)現(xiàn)塞內(nèi)加爾的2個毒株屬于不同的譜系，如SnDk11I13毒株屬于第Ⅱ譜系，E32/1969毒株屬于第Ⅰ譜系，這也說明目前一個國家或一個地區(qū)存在多個譜系的PPRV毒株。

3.3 F蛋白氨基酸序列

PPRV F蛋白C末端有一個結(jié)構(gòu)域，長32個氨基酸，為一個易變結(jié)構(gòu)域。其經(jīng)過純化了的F蛋白在病毒感染宿主體的初期有導(dǎo)致宿主機(jī)體溶血、細(xì)胞融合及啟動感染的生物學(xué)活性[31]。F蛋白是一種包膜表面糖蛋白，其序列高度保守，保守性僅次于M蛋白[32]。根據(jù)試驗獲得的PPRV F蛋白氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的48個PPRV毒株F蛋白氨基酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗毒株與西藏的4株P(guān)PRV毒株F蛋白氨基酸同源性介于98.7%～98.9%，低于試驗毒株與中國新疆伊犁China/XJYL/2013毒株F蛋白氨基酸同源性。這也體現(xiàn)此次PPR疫情是早年西藏疫情的傳入和延續(xù)的可能性較小，而由中國新疆北疆傳入的可能性較大。試驗毒株與中國2013年以后的內(nèi)地毒株F蛋白氨基酸同源性較高，這可能與中國新疆養(yǎng)羊業(yè)的羊肉銷售及羊只調(diào)運(yùn)有關(guān)。試驗毒株與國外PPRV毒株F蛋白氨基酸同源性最高的是印度毒株，同源性最低的是科特迪瓦ICV89毒株，這也表明中國此次疫情毒株可能為印度等周邊國家傳入。試驗PPRV毒株F蛋白氨基酸序列與中國目前使用的疫苗毒株F蛋白氨基酸序列同源性較低，這與PPRVF基因核苷酸序列比對結(jié)果一致，說明試驗毒株為接種疫苗毒毒力返強(qiáng)的可能性較低。

4 結(jié) 論

2014年，中國新疆南疆存在PPR疫情；新疆南疆PPR疫情毒株與中國2013～2014年P(guān)PR疫情國內(nèi)毒株及此次疫情報道的PPRV第1株(China/XJYL/2013)所在地的周臨國印度PPR毒株(Izatnagar/94)進(jìn)化關(guān)系較近。

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GeneticEvolutionAnalysisofFgeneofPPRVinSouthernXinjiang

ZHANG Lu-yao1, 2, LI Fei2, 3, JIAO Hai-hong2, ZHAO Li2, LIU Yong-hong2

(1.nimalHusbandryandVeterinaryWorkstationsofBarkolKazakAutonomousCounty,KumulXinjiang839200,China; 2.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,KeyLaboratoryofTarimAnimanlHusbandryScienceandTechnologyofXinjiangProduction&ConstructionCorps,AlarXinjiang843300China; 3.AksuAnimalLoimiaControllingandDiagnosticCenter,AksuXinjiang843300,China)

ObjectiveIn order to provide a theoretical basis for the prevention and control of PPR in southern Xinjiang, the PPRV strains in 2014 was analyzed.MethodThe incidence of sheep in a sheep farm in Akesu Prefecture of southern Xinjiang was investigated. The clinical symptoms and pathological examination were performed. The PPRVFgene RT-PCR andFgene sequencing were carried out in the laboratory, and the sequence analysis of PPRVFgene was further carried out.ResultPPRVFgene sequence analysis showed that the test China/XJYL/2013 in Xinjiang had the highest homology with domestic PPRV strainFgene nucleotide. Compared with the Foreign strains, the highest homology of nucleotide is India strains Izatnagar/94 and Izatnagar-94 strains; PPRV strainFgene phylogenetic tree analysis in this study showed that the relationship of this PPRV strain had recently evolved from Beijing PPRV strain and belonged to the same branch of Ili PPRV strain, which had close evolutionary relationship with foreign strains in India and Bangladesh.ConclusionThere existed PPR epidemic in southern Xinjiang in 2014, and the epidemic strains and the domestic PPR before and after the outbreak of the PPR strains and the surrounding countries strains were relatively close to the evolution.

PPR; diagnosis;Fgene; sequence analysis

Supported by: Tarim University and Huazhong Agricultural University Scientific Research Funds "Peste-des-petits Ruminants Epidemiological Investigation in Southern Xinjiang"(HNTDLH1404)

LIU Yong-hong(1981-), male, native place: Wuchuan Inner Mongolia, Associate professor, doctoral, The research direction for infectious diseases and immune pathology, (E-mail)lyhdky@126.com

S852.6

A

1001-4330(2017)11-2118-12

2017-08-24

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)塔里木大學(xué)科研聯(lián)合基金“新疆南疆小反芻獸疫流行病學(xué)調(diào)查”(HNTDLH1404)

張路瑤(1991-)，男，陜西禮泉人，碩士，研究方向為動物群發(fā)性疾病的防控檢測，(E-mail)875793428@qq.com

劉永宏(1981-)，男，內(nèi)蒙古武川人，副教授，博士，研究方向為傳染病與免疫病理學(xué)，(E-mail)lyhdky@126.com