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        兩個(gè)隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥家系COL7A1基因突變分析及產(chǎn)前診斷

        2017-12-28 17:30:04徐哲林志淼
        中華皮膚科雜志 2017年11期
        關(guān)鍵詞:水皰外顯子羊水

        徐哲 林志淼

        100045北京,國(guó)際兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科(徐哲);北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科(林志淼)

        ·論著·

        兩個(gè)隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥家系COL7A1基因突變分析及產(chǎn)前診斷

        徐哲 林志淼

        100045北京,國(guó)際兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科(徐哲);北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科(林志淼)

        目的檢測(cè)2個(gè)隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥家系COL7A1基因突變情況,并在患兒母親再次妊娠時(shí)進(jìn)行胎兒產(chǎn)前診斷。方法收集2例隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患兒臨床資料,提取患兒及其父母的外周血DNA,應(yīng)用PCR擴(kuò)增COL7A1基因的全部118個(gè)外顯子并測(cè)序;用100例無(wú)血緣關(guān)系的健康人外周血作對(duì)照。確定致病突變后,在患兒母親再次妊娠時(shí),羊膜腔穿刺術(shù)獲取羊水細(xì)胞。分別自直接抽提的羊水細(xì)胞以及培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞中提取基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,檢測(cè)COL7A1基因突變,同患兒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,行產(chǎn)前診斷。胎兒娩出后抽取靜脈血,檢測(cè)COL7A1基因突變。所有測(cè)序結(jié)果都經(jīng)過(guò)雙向測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果2例患兒均發(fā)現(xiàn)COL7A1基因復(fù)合雜合突變。例1 COL7A1基因存在c.5453G>A及c.6781C>T復(fù)合雜合突變,分別導(dǎo)致編碼氨基酸發(fā)生p.G1818D突變和產(chǎn)生提前終止密碼p.R2261Efs*25,其中c.5453G>A來(lái)自父親,c.6781C>T來(lái)自母親。例2 COL7A1基因存在c.6205C>T及c.8272_8272delG復(fù)合雜合突變,導(dǎo)致編碼蛋白發(fā)生p.R2069C及p.V2758Sfs*28復(fù)合雜合突變,其中c.6205C>T來(lái)自父親,c.8272_8272delG來(lái)自母親。2例患兒的母親再次懷孕時(shí)所取羊水細(xì)胞及羊水培養(yǎng)細(xì)胞均未測(cè)到患兒所攜帶的COL7A1基因突變。胎兒出生后皮膚黏膜正常,無(wú)水皰,基因檢測(cè)亦未發(fā)現(xiàn)患兒所攜帶的COL7A1基因突變。結(jié)論2例營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患兒均存在COL7A1基因復(fù)合雜合突變,并成功在2例患兒的母親再次妊娠時(shí)進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。

        營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松解;產(chǎn)前診斷;DNA突變分析;膠原Ⅶ型;COL7A1基因

        隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥(recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB, OMIM 609638)是一種常染色體隱性遺傳的大皰性皮膚病,是遺傳性大皰性表皮松解癥中嚴(yán)重的類(lèi)型之一,由COL7A1基因突變導(dǎo)致其編碼的Ⅶ型膠原合成異常所致?;純撼錾蠹从衅つw脆性增加,以周身出水皰、糜爛、粟丘疹及愈后留下萎縮性瘢痕為特點(diǎn)[1]。對(duì)嚴(yán)重威脅到患者生命的RDEB而言,不但需要減少?lài)?yán)重后遺癥的發(fā)生,更應(yīng)設(shè)法阻止疾病在家族中遺傳。本研究中,我們對(duì)2例RDEB患兒進(jìn)行基因檢測(cè),并在患兒母親再次妊娠時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷,阻斷疾病向下一代傳遞。

        病歷資料

        2例RDEB患兒均為散發(fā)病例,家族中未見(jiàn)類(lèi)似患者,患兒父母臨床表型正常,非近親婚配。例1為2歲男童,出生時(shí)即有雙下肢廣泛皮膚缺失,累及小腿至足背(圖1),生后1周開(kāi)始于頸部、臀部和四肢出現(xiàn)水皰和血皰。1歲后手足因萎縮性瘢痕而活動(dòng)受限??谇恢幸喾磸?fù)發(fā)生水皰、大皰和糜爛,偶有嘔吐伴有聲嘶,手足甲板大部分脫落,毛發(fā)稀疏。生長(zhǎng)發(fā)育水平處于同齡兒童低限,曾在當(dāng)?shù)匦衅つw病理和電鏡檢查,診斷為大皰性表皮松解癥。例2為7歲女童,生后不久在腹部和面部各出現(xiàn)1處直徑4 cm皮膚缺失,出生后第2天開(kāi)始吸吮母乳后口唇部位出現(xiàn)水皰,3 d后手背及足跟處出現(xiàn)水皰、大皰,易破潰糜爛。很快以腹部和腰部為主,周身廣泛出現(xiàn)水皰樣皮疹,指、趾甲經(jīng)常脫落。3歲后,癥狀有所減輕,限于腋下、腹部和口周,可見(jiàn)數(shù)個(gè)水皰(圖2)??谇患笆车鲤つづ加衅茲ⅰV橇绑w格發(fā)育正常。

        對(duì)水皰皮損行病理檢查,2例患兒均表現(xiàn)為棘層增厚,表皮下裂隙,真皮層纖維增生伴有淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)合臨床病史分析,2例患兒產(chǎn)科診斷為先天性皮膚缺損待查,臨床診斷為RDEB。

        圖1 例1出生時(shí)脛骨前至足背皮膚缺失,上覆滲出性血痂

        圖2 例2腹部及腹股溝處見(jiàn)瘢痕,其上見(jiàn)水皰及糜爛

        方 法

        1.外周血DNA提?。罕狙芯客ㄟ^(guò)國(guó)際兒童醫(yī)學(xué)中心首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),在患兒母親計(jì)劃再次懷孕的半年前左右,取得患兒及其家屬的知情同意后,取患兒及其父母靜脈血4 ml置于乙二胺四乙酸抗凝管中,以QIAamp DNA Blood Mini試劑盒提取外周血基因組DNA。同時(shí),在本院健康體檢者中隨機(jī)選取100例無(wú)關(guān)健康人,抽取外周血作為對(duì)照標(biāo)本,提取標(biāo)本DNA。

        2.COL7A1基因外顯子PCR擴(kuò)增:在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)中查取COL7A1基因的外顯子序列,根據(jù)文獻(xiàn)[2],應(yīng)用Primer5.0軟件對(duì)COL7A1基因的所有118個(gè)外顯子設(shè)計(jì)72對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,包括所有外顯子的編碼序列及側(cè)翼序列。PCR擴(kuò)增體系為25 μl,含12.5 μl Takara premix PCR熱啟動(dòng)酶(日本Takara公司產(chǎn)品),正反向引物各1 pmol,模板DNA 30 ng。PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性5 min,98℃變性60 s、60℃退火30 s,72℃延伸45 s,循環(huán)35次,72℃延伸7 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,切膠回收特異性目的條帶。

        3.DNA測(cè)序:由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)所得PCR產(chǎn)物測(cè)序,擴(kuò)增片段均行正反向引物測(cè)序。將所有測(cè)序結(jié)果與Ensembl網(wǎng)站(http://www.ensembl.org/index.html)公布的COL7A1基因序列進(jìn)行對(duì)照。

        4.羊水細(xì)胞培養(yǎng):對(duì)例1的母親(于孕14周)和例2的母親(于孕16周)分別行羊膜腔穿刺術(shù),取羊水40 ml,20 ml用于直接抽提胎兒基因組DNA,20 ml用于細(xì)胞貼壁培養(yǎng),以去除穿刺術(shù)過(guò)程中可能的母體細(xì)胞污染。羊水抽出后,室溫下500×g離心6 min,取沉淀物加入10 ml培養(yǎng)液(L?DMEM+10%胎牛血清 +100 U/ml青霉素鉀 +100 μg/ml鏈霉素)、100 μl羊水細(xì)胞培養(yǎng)添加劑,制成細(xì)胞懸液,接種至直徑100 mm培養(yǎng)皿,置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。靜置5 d后,無(wú)菌PBS漂洗傳代擴(kuò)增,每3天更換培養(yǎng)液并傳代1次,傳代3次后,分離羊水培養(yǎng)細(xì)胞。

        5.羊水及羊水培養(yǎng)細(xì)胞中COL7A1基因突變檢測(cè):使用InstaGene Matrix試劑(美國(guó) Bio?Rad公司)提取羊水及羊水培養(yǎng)細(xì)胞中胎兒DNA,通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序檢測(cè)COL7A1基因突變,步驟同“2.COL7A1基因外顯子PCR擴(kuò)增”。

        6.胎兒COL7A1基因突變檢測(cè):2例患兒母親娩出胎兒后,取胎兒靜脈血,提取DNA,檢測(cè)COL7A1基因突變,步驟同“1.外周血DNA提取”和“2.COL7A1基因外顯子PCR擴(kuò)增”,將所得結(jié)果與患兒結(jié)果比對(duì)。

        結(jié) 果

        1.PCR及產(chǎn)物電泳結(jié)果:患兒及其父母的靜脈血、羊水細(xì)胞、羊水培養(yǎng)細(xì)胞及娩出胎兒的靜脈血標(biāo)本經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳,均在特定泳道內(nèi)見(jiàn)到與預(yù)期片段長(zhǎng)度相同的明亮條帶。100例無(wú)關(guān)健康對(duì)照標(biāo)本均能擴(kuò)增出與第63、86、39和111號(hào)外顯子片段長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)的明亮條帶。

        2.患兒測(cè)序結(jié)果:2例患兒均發(fā)現(xiàn)COL7A1基因復(fù)合雜合突變。例1 COL7A1基因第63號(hào)外顯子存在c.5453G>A錯(cuò)義突變,導(dǎo)致相應(yīng)編碼氨基酸出現(xiàn)p.G1818D替代;第86號(hào)外顯子存在c.6781C>T錯(cuò)義突變,使氨基酸出現(xiàn)p.R2261*改變,產(chǎn)生終止密碼子,導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止。例2 COL7A1基因第39號(hào)外顯子存在c.6205C>T錯(cuò)義突變,編碼氨基酸出現(xiàn)p.R2069C替代;第111號(hào)外顯子存在c.8272_8272delG突變,導(dǎo)致編碼氨基酸出現(xiàn)p.V2758Sfs*28改變。所有突變測(cè)序結(jié)果都經(jīng)過(guò)正反向測(cè)序得到驗(yàn)證。100例無(wú)關(guān)健康人未發(fā)現(xiàn)COL7A1基因突變。見(jiàn)圖3、4。

        3.患兒父母測(cè)序結(jié)果:例1 c.5453G>A突變來(lái)自父親,c.6781C>T突變來(lái)自母親。例2 c.6205C>T突變來(lái)自父親,c.8272_8272delG突變來(lái)自母親。2例患兒父母均為攜帶相應(yīng)突變的雜合子。

        4.羊水細(xì)胞及羊水培養(yǎng)細(xì)胞基因測(cè)序結(jié)果:從例1、2的母親再次妊娠時(shí)抽取的羊水細(xì)胞及羊水培養(yǎng)細(xì)胞均未檢測(cè)到COL7A1基因突變。

        圖3 隱性營(yíng)養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患兒COL7A1基因突變 3A、3B:例1的c.5453G>A和c.6781C>T突變;3C、3D:例2的c.6205C>T和c.8272_8272delG突變。箭頭示突變位點(diǎn)

        圖4 健康對(duì)照COL7A1基因PCR產(chǎn)物部分測(cè)序結(jié)果 4A~4D:健康對(duì)照在圖3A~3D所示區(qū)域的測(cè)序結(jié)果。箭頭示與患兒突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的正常位點(diǎn)

        5.娩出胎兒突變檢測(cè)結(jié)果:2例患兒母親均分娩出臨床表型正常的新生兒,后續(xù)基因檢測(cè)示胎兒均未攜帶COL7A1基因突變。

        討 論

        目前,已報(bào)道的引起RDEB的突變包括錯(cuò)義突變、移碼突變以及剪切位點(diǎn)突變等[3]。其中,在COL7A1基因編碼的Ⅶ型膠原三螺旋區(qū)位置引起甘氨酸替代的雜合錯(cuò)義突變?yōu)镽DEB最常見(jiàn)的基因突變。這是由于Ⅶ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征是Gly?Xaa?Yaa連續(xù)重復(fù),甘氨酸是最小的氨基酸,對(duì)于膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。當(dāng)甘氨酸被其他種類(lèi)的氨基酸替代后,可能干擾Ⅶ型膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)域形成,妨礙其結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性,使皮膚基底膜致密板下帶錨纖維(其主要成分為Ⅶ型膠原)不能維持正常功能,導(dǎo)致RDEB發(fā)生[4?5]。

        本研究明確了2例RDEB患兒的COL7A1基因突變位點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上用羊水細(xì)胞培養(yǎng)的方法對(duì)患兒母親,即COL7A1基因突變的攜帶者進(jìn)行產(chǎn)前診斷,阻斷疾病在家系中向下一代遺傳。該2例患兒中,例1出生時(shí)雙小腿皮膚剝脫,與先天性皮膚發(fā)育不全、局限性真皮發(fā)育不良類(lèi)似。所以臨床遇到類(lèi)似皮疹表現(xiàn)的嬰兒時(shí),應(yīng)詳細(xì)詢(xún)問(wèn)患兒出生時(shí)是否有水皰或皮膚剝脫等皮疹表現(xiàn),對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪(fǎng),以鑒別不同類(lèi)型的表皮松解癥。當(dāng)高度懷疑患兒為重度RDEB時(shí),直接進(jìn)行基因測(cè)序確診更為經(jīng)濟(jì)、高效和合理[6]。c.6781C > T和c.8272_8272delG突變都會(huì)導(dǎo)致終止密碼子出現(xiàn),這種突變直接可以確定為致病性突變。此外,c.6205C>T錯(cuò)義突變是HGMD 網(wǎng)站(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)報(bào)告過(guò)的突變位點(diǎn),可使氨基酸出現(xiàn)p.R2069C突變。c.5453G>A導(dǎo)致的p.G1818D雖然沒(méi)有報(bào)道過(guò),但其是位于Ⅶ型膠原結(jié)構(gòu)Gly?X?Y的甘氨酸突變,也是COL7A1最常見(jiàn)的致病性突變類(lèi)型,綜上所述,可以確定兩個(gè)家系的突變位點(diǎn)都是致病性的。例2在生后和嬰兒期發(fā)生皮膚黏膜廣泛水皰,但在3歲后,水皰部位發(fā)生轉(zhuǎn)變,逐漸集中并局限于腋下、腹股溝等皮膚皺褶處。結(jié)合其突變位點(diǎn)(包括c.6205C>T),例2應(yīng)被診斷為反向型RDEB(recessive dystrophic epidermolysis bullosa?inversa,RDEB?I,OMIM 226600)。雖然此型RDEB患者皮疹逐步向皺褶部位轉(zhuǎn)移的原因不明,但c.6205C>T幾乎是本型特有的COL7A1基因突變位點(diǎn)[7]。類(lèi)似皮疹分布的疾病還有家族性良性天皰瘡,可能是因?yàn)轳薨櫜课痪植科つw溫度較高,蛋白酶降解速度與其他部位存在差異。

        對(duì)于父母為COL7A1致病基因突變攜帶者的家庭而言,如果母親再次懷孕,胎兒有25%患本病的風(fēng)險(xiǎn)。REDB作為隱性遺傳病,患者具有復(fù)合雜合突變,而如果患者配偶不攜帶COL7A1基因突變,則后代為攜帶者,不表現(xiàn)出該疾病。由于已經(jīng)明確基因突變位點(diǎn),有再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的胎兒可在母親孕期進(jìn)行羊水穿刺(最佳的羊膜腔穿刺時(shí)間是懷孕14~20周)及產(chǎn)前診斷,避免再次分娩出類(lèi)似疾病的患兒。

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        Mutation analysis of the COL7A1 gene and prenatal diagnosis in two families with recessive dystrophic epidermolysis bullosa

        Xu Zhe,Lin Zhimiao
        Department of Dermatology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,National Center for Children′s Health,Beijing 100045,China(Xu Z);Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China(Lin ZM)

        Xu Zhe,Email:zhexu_cmu@163.com

        ObjectiveTo detect mutations of the COL7A1 gene in 2 families with recessive dystrophic epidermolysis bullosa(RDEB),and to perform prenatal diagnosis during the pregnancy of patients′mothers.MethodsClinical data were collected from 2 patients with RDEB.DNA was extracted from the peripheral blood samples from the patients,their parents and 100 unrelated healthy people who served as controls.PCR was performed to amplify all the 118 exons of the COL7A1 gene followed by DNA sequencing.After identification of pathogenic mutations,amniotic fluid cells were obtained by amniocentesis during the next pregnancy of the patients′mothers,and genomic DNA was extracted from uncultured or cultured amniotic fluid cells followed by amplification and DNA sequencing to detect mutations in the COL7A1 gene.The results were compared with patients′results for prenatal diagnosis.After delivery,venous blood samples were collected from the neonates to detect mutations in the COL7A1 gene.All the results were verified by bidirectional sequencing.ResultsCompound heterozygous mutations in the COL7A1 gene were identified in the 2 patients.Two heterozygous mutations(c.5453G >A and c.6781C>T)in the COL7A1 gene were found in case 1,which resulted in the p.G1818D mutation and the formation of a premature termination codon p.R2261Efs*25.Additionally,the c.5453G>A and c.6781C>T mutations were inherited from his father and mother respectively.Another 2 heterozygous mutations(c.6205C>T and c.8272_8272delG)in the COL7A1 gene were identified in case 2,which led to the p.R2069C and p.V2758Sfs*28 mutations in encoded proteins,and the c.6205C>T and c.8272_8272delG mutations were inherited from the patient′s father and mother respectively.None of the above mutations in the COL7A1 gene was found in the uncultured or cultured amniotic fluid cells,which were collected from the 2 patients′mothers during the next pregnancy.After birth,the neonates showed normal skin and mucosa without blisters,and genetic testing showed none of the above mutations in the COL7A1 gene in the neonates.ConclusionCompound heterozygous mutations in the COL7A1 gene were found in the 2 patients with RDEB,and prenatal diagnosis was successfully performed in the 2 patients′mothers during the next pregnancy.

        Epidermolysis bullosa dystrophica;Prenatal diagnosis;DNA mutational analysis;Collagen type VII;Gene,COL7A1

        Fund programs:Beijing Municipal Natural Science Foundation(7162060);Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support(ZYLX201601);Basic and Clinic Science Foundation of Capital Medical University(16JL22);Maternal and Child Health Foundation of Shunyi Women and Children′s Hospital of Beijing Children′s Hospital(FYJK201601)

        徐哲,Email:zhexu_cmu@163.com

        10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.009

        北京市自然科學(xué)基金(7162060);北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(ZYLX201601);首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床合作研究基金(16JL22);北京兒童醫(yī)院順義婦兒醫(yī)院婦幼健康基金(FYJK201601)

        2017?04?13)

        尚淑賢)

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