街曉霞 馬明悅

撫順市傳染病醫(yī)院肝病科 （遼寧撫順，113015）

·實驗研究·

縮肝丸對四氯化碳致大鼠肝纖維化的影響

街曉霞 馬明悅

撫順市傳染病醫(yī)院肝病科 （遼寧撫順，113015）

目的：觀察縮肝丸對CCl4致大鼠肝纖維化的防治作用。方法：采用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維動物模型。SD雄性大鼠50只，隨機分為正常組、CCl4模型組、安絡(luò)化纖丸組、縮肝丸大劑量組、縮肝丸小劑量組，灌胃給藥。用藥第10周末處死全部大鼠，留取血清測生化指標，肝組織樣本病理切片HE染色及Masson膠原纖維染色鏡下觀察。結(jié)果：縮肝丸可使CCl4造模大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ含量降低；HE染色顯示縮肝丸可降低炎性細胞浸潤程度，減少假小葉的形成和脂質(zhì)空泡的數(shù)量；Masson膠原纖維染色顯示縮肝丸可降低膠原纖維增生程度。結(jié)論：縮肝丸具有較好的保肝及延緩肝纖維化進程的作用。

縮肝丸；四氯化碳；大鼠；肝纖維化

肝纖維化（LF）是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)，是可逆的。防止肝纖維化的形成，對預(yù)防治療肝硬化有非常重要的意義。目前治療肝纖維化尚無特效療法，有研究表明中藥治療往往效果良好［1］。我國傳統(tǒng)中醫(yī)中藥在抗肝纖維化、早期肝硬化方面有長期的臨床實踐積累［2］，因此中藥治療肝纖維化的作用機制值得研究與挖掘?？s肝丸是我院獨有配方制劑，由茵陳、茯苓、柴胡、郁金、當歸、紅花、蒼術(shù)、鱉甲組成，具有舒肝理氣、活血化瘀、回縮肝脾之功效。本研究主要觀察縮肝丸對CCl4大鼠肝纖維化模型的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 CCl4（分析純），橄欖油（化學純）。透明質(zhì)酸（HA），伊萊瑞特生物科技有限公司生產(chǎn)，批號E－EL－0036c；層粘連蛋白（LN），博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，批號EK0435；III型前膠原（PCIII），武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司生產(chǎn)，批號SED087Ra，均為酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒?？s肝丸由撫順市傳染病醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，以蒸餾水配成166mg／m l藥液；安絡(luò)化纖丸由森隆藥業(yè)有限公司出品，以蒸餾水配成110．6mg／ml藥液。

1．2 主要儀器 微型高速離心機（C2500-R-230V，美國Labnet）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（ICV-450，日本 ASONE）；全自動酶標儀（Multiskan MK3，Thermo scientific）；全自動生化儀（7020，HITACHI）；病理切片機 RM（2235輪轉(zhuǎn)式切片機，Leica）；顯微鏡（E100型生物顯微鏡，NIKON）。

1．3 動物實驗 SD雄性大鼠50只，體重150－200g（湖北省實驗動物研究中心提供，動物合格證號：42000600008078）。隨機分為5組：正常組（即空白對照組）、模型組、安絡(luò)化纖丸組、縮肝丸大劑量組、縮肝丸小劑量組，每組大鼠數(shù)量均為10只。參照文獻［3－5］，模型組、安絡(luò)化纖丸組、縮肝丸大劑量組、縮肝丸小劑量組分別在實驗第1日按5ml／kg皮下注射40%CCl4橄欖油溶液，以后按3ml／kg、每周2次皮下注射40%CCl4橄欖油溶液，共10周；正常組皮下注射等體積生理鹽水。實驗第1天即開始給藥。正常組及模型組將生理鹽水按5ml／kg灌胃；安絡(luò)化纖丸組將制備好的安絡(luò)化纖丸藥液按10ml／kg灌胃；縮肝丸小劑量組將制備好的縮肝丸藥液按10ml／kg灌胃；縮肝丸大劑量組將制備好的縮肝丸藥液按20ml／kg灌胃。每天早晚各1次，持續(xù)10周。用藥第11周，大鼠腹腔注射100g／L水合氯醛（按3ml／kg劑量）麻醉后，腹主動脈取血，分離血清備檢（纖維化、肝功指標檢測）。同時取肝左葉于10%福爾馬林液固定［3］，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，HE染色及Masson膠原纖維染色。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）采用全自動生化分析儀進行檢測；透明質(zhì)酸（HA）、層粘蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）按ELLSA試劑盒說明步驟進行。蘇木素伊紅（HE）染色：光鏡下觀察肝組織學變化；Masson膠原纖維染色：光鏡下觀察膠原纖維增生情況。

1．4 數(shù)據(jù)處理方法 所獲數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以±s表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0．01表示差異具有統(tǒng)計學意義，P＞0．01表示差異無統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠血清學檢測結(jié)果見表1。 縮肝丸大劑量組5項指標均高于正常組，但低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義；縮肝丸小劑量組5項指標均高于正常組，但低于模型組，與模型組比較HA、LN、PCⅢ差異具有統(tǒng)計學意義?？s肝丸大、小劑量組雖未能完全防止肝纖維化的形成，但具有減輕其肝纖維化程度的作用。

表1 各組大鼠血清學檢測結(jié)果比較 （±s）

表1 各組大鼠血清學檢測結(jié)果比較 （±s）

與正常組比較 ＃P＜0．01；與模型組比較，*P＜0．01

組別 ALT（U／L）AST（U／L）HA（ng／mL）LN（ng／mL）PCⅢ（ng／m L）正常組（n＝10）45±3．85 75±10．51 110．23±16．13 125．60±8．44 42．23±3．13模型組（n＝10）239±22．29＃252±23．87＃232．60±25．87＃181．47±10．19＃169．77±4．65＃安絡(luò)化纖丸組（n＝10）130±12．53*160±11．26*142．18±13．40*142．68±4．88*98．51±3．99*縮肝丸大劑量組（n＝10）178±12．29*190±6．17*150．42±11．33*150．19±5．76*116．33±3．29*縮肝丸小劑量組（n＝10）210±5．40 221±10．91 177．14±14．74*161．19±5．72*128．52±3．49*

2．2 HE染色結(jié)果 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無肝細胞脂肪變性、壞死，無纖維組織增生，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見明顯病變；模型組見正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細胞索排列紊亂，大量假小葉形成，假小葉周圍由增生的纖維組織包繞，假小葉內(nèi)無中央靜脈，肝細胞腫大，大量炎性細胞浸潤，少量脂肪變性；縮肝丸小劑量組，肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，少量炎性細胞浸潤及少許纖維組織增生，脂肪變性明顯；縮肝丸大劑量組、安絡(luò)化纖丸組肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，少量炎性細胞浸潤及少許纖維組織增生，相比模型組肝組織病理改變明顯改善（見插頁圖1）。

2．3 Masson膠原纖維染色結(jié)果 正常組僅在中央靜脈周圍出現(xiàn)極少量的藍色膠原纖維；模型組膠原纖維增生明顯，大量存在于匯管區(qū)，少量存在于中央靜脈周圍，肝實質(zhì)內(nèi)可見增生的膠原纖維形成纖維間隔分割包繞肝細胞形成假小葉；縮肝丸大劑量組、安絡(luò)化纖丸組的膠原纖維增生量均少于模型組，膠原纖維增生受到明顯抑制，匯管區(qū)及肝小葉中央靜脈膠原纖維明顯減少，肝實質(zhì)內(nèi)增生的膠原纖維較短較細，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，雖未能完全防止膠原纖維的增生，但能降低膠原纖維增生的程度；縮肝丸小劑量組防止膠原纖維增生效果不如上述兩組，但仍然較模型組有所改善，膠原纖維組織增生有所減少（見插頁圖2）。

3 討論

本研究表明：縮肝丸可使CCl4造模大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ含量降低，保持肝小葉結(jié)構(gòu)正常，抑制膠原纖維增生，使肝細胞索疏松而窄，且多集中在中央靜脈周圍，肝細胞水腫、脂肪變性、炎細胞浸潤減少，提示縮肝丸具有較好的保肝及延緩肝纖維化形成的作用。

肝纖維化在中醫(yī)學屬“黃疸”、“脅痛”、“肝瘟”、“積聚”等范疇?；静C是正衰邪盛、熱毒瘀結(jié)、肝脾損傷。肝為藏血之臟，肝郁氣滯，導(dǎo)致血瘀。縮肝丸配方中由具有活血化淤功效的紅花、當歸，佐以郁金、柴胡舒肝理氣，茵陳清熱利濕，外加鱉甲軟堅散結(jié)，茯苓、蒼術(shù)健脾。整個配方起到了舒肝理氣、活血化瘀、回縮肝脾的作用?，F(xiàn)代研究表明，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活造成細胞外間質(zhì)成分（ECM）生成過多，降解相對不足，在肝內(nèi)過度沉積是肝纖維化形成的重要原因。有研究表明紅花能夠通過下調(diào)肝組織中TIMP－1的表達而相對降低TIMP-1／MMP-1來促進ECM降解發(fā)揮抗肝纖維化作用［6］，鱉甲經(jīng)煎煮亦可發(fā)揮抑制HSC增殖的作用［7］。但縮肝丸配方組成藥味眾多，哪一味中藥在起關(guān)鍵作用尚不明確，其作用機理有待進一步研究。

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10．3969／j．issn．1005-0264．2017．05．011

2017－03－27 編輯：陳盛鐸）