劉金香 潘五九 王偉明 董 坤 姚 琳

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

·方藥研究·

槐角提取物中槐角苷的含量測(cè)定研究*

劉金香 潘五九**王偉明 董 坤 姚 琳

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·哈爾濱 150036）

目的：建立槐角提取物中槐角苷的含量測(cè)定方法。方法：采用Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.07%磷酸水溶液（25:75）；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果：槐角苷進(jìn)樣濃度在1.502～300.400μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=4807X+2870（r=0.9999）,平均加樣回收率為101.50%，RSD為1.45%。結(jié)論：所建立的方法簡(jiǎn)單可行，重復(fù)性好，可用于槐角提取物中槐角苷的含量測(cè)定。

槐角 提取物 槐角苷 含量測(cè)定 高效液相色譜法

槐角為豆科植物槐（Sophorajaponica L.）的干燥成熟果實(shí)，性苦、寒 ，具有清熱瀉火，涼血止血功效[1]?；苯侵泻喾N黃酮類和異黃酮類化合物，其中槐角苷是槐角的主要活性成分之一[2]?，F(xiàn)代研究表明槐角苷具有抗炎、抑制免疫、抗生育和雌激素樣等作用[3-4]。我院通過(guò)前期的試驗(yàn)研究，分離純化出槐角提取物，其主要成分為槐角苷。目前，對(duì)于槐角藥材中槐角苷[5-7]含量測(cè)定研究較多，而槐角提取物中的槐角苷的含量測(cè)定研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為有效控制槐角提取物質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以所在科研課題為支撐，通過(guò)HPLC方法測(cè)定槐角提取物中槐角苷的含量，為槐角提取物的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

島津2010LC高效液相色譜儀，SPD-10AVvp檢測(cè)器（島津）；Sartorius BSA224S-CW電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），Sartorius BP211D電子天平（上海精密儀器有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）?；苯擒諏?duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買，批號(hào)為111695—200501）；槐角提取物（自制，批號(hào)為20110901,20010902,20110903），乙腈、甲醇、磷酸為色譜級(jí)，其余試劑均為分析純，水為哇哈哈純凈水。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：乙腈–0.07%磷酸水溶液（25:75）；流速：1.0mL/min；波長(zhǎng)：260nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按槐角苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。樣品中槐角苷峰與相近峰達(dá)到基線分離，分離度良好。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槐角苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含300.400μg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取該儲(chǔ)備液1ml，置于10ml容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，得到對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末約20mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加入70%乙醇40ml，超聲處理（功率300W，頻率40kHz）15分鐘，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液1ml置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10ul，得到對(duì)照品、供試品色譜圖，見(jiàn)圖1、圖2。樣品中槐角苷峰與相近峰達(dá)到基線分離，分離度良好。

圖1 槐角苷對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.25，0.50，2.50，5.00，12.50ml置 50ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和對(duì)照品儲(chǔ)備液各10μl，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以槐角苷峰面積作為縱坐標(biāo)，以槐角苷質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=4807X+2870，r=0.9999，表明槐角苷質(zhì)量濃度在1.502～300.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 儀器的精密度試驗(yàn) 取同一份槐角苷對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定槐角苷峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為0.13%，結(jié)果表明該方法下儀器的精密度較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試液，分別于0、1、2、4、6、8進(jìn)樣，測(cè)定槐角苷峰面積，計(jì)算其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.23%，表明樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批號(hào)供試品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次操作，測(cè)定槐角苷峰面積，其RSD為0.49%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知槐角苷含量的供試品約10mg（批號(hào)20110901），共6份，精密稱定，分別精準(zhǔn)加入等量的槐角苷對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備槐角提取物供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率及RSD。測(cè)得結(jié)果見(jiàn)如下表1。

表1 槐角提取物中槐角苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 樣品測(cè)定

三批樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法，每個(gè)批號(hào)平行制備兩份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，每份供試品溶液重復(fù)測(cè)定兩次。結(jié)果樣品中槐角苷的含量的平均值分別為79.06%，79.59%，80.23%。

2.6 耐用性試驗(yàn)

考不同流速（0.8,0.9,1.0,1.1,1.2mL/min），不同柱溫（25,30,35,40℃），不同色譜柱（Diamonsil C18,Agilent Excend C18）下色譜峰分離度和柱效的變化，結(jié)果，分離度和柱效無(wú)明顯變化，表明此方法的耐用性良好。

3 結(jié)果與討論

3.1 供試品制備方法

參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]中供試品溶液制備方法，分別對(duì)提取溶劑(甲醇，不同濃度乙醇)、超聲提取時(shí)間（10、15、20、30、45min）進(jìn)行考察，確定最優(yōu)提取條件為70%乙醇，超聲提取15min。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[1,9,10]中槐角苷含量測(cè)定方法，考察了甲醇-乙腈-0.07%磷酸水，甲醇-0.07%磷酸水，乙腈-0.07%磷酸水系統(tǒng)，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.07%磷酸水（25:75），目標(biāo)峰保留時(shí)間適中，且色譜峰峰形對(duì)稱性良好，因此，確定流動(dòng)相組成及比例為乙腈-0.07%磷酸水（25:75）。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立槐角提取物的含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能夠有效控制槐角提取物的質(zhì)量，并為該提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

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2013哈爾濱市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013AA3BS040)

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