趙衛(wèi)鋒，何 平 ，周華波 ,2，丁仰保 ，陳泉江 ，劉 琳，李瑞凱，鄒媛婧，廖卓韻，王凌霄，韋祖樟，歐陽康，孫文博，黃偉堅，陳櫻

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2. 南寧市華波寵物醫(yī)院，南寧 530004；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟南250100）

甲流重組犬流感病毒的小鼠致病性研究

趙衛(wèi)鋒1，何 平1，周華波1,2，丁仰保1，陳泉江1，劉 琳1，李瑞凱1，鄒媛婧1，廖卓韻1，王凌霄1，韋祖樟1，歐陽康1，孫文博3，黃偉堅1，陳櫻1

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2. 南寧市華波寵物醫(yī)院，南寧 530004；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟南250100）

本研究通過建立犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）感染BALB/c小鼠模型，探索新發(fā)現(xiàn)的甲流重組CIVs對小鼠的致病性。我們采用9株H1N1和1株H3N2甲流重組CIVs，以106TCID50/ mL的劑量滴鼻攻毒10組小鼠。結(jié)果表明：感染后4 d小鼠體重均有一定程度的下降，其中A/Canine/Guangxi/LZ56/2015（H1N1）（簡稱LZ56）組的小鼠體重下降最為明顯（P＜0.5），其存活率為77.78%；通過TCID50測定發(fā)現(xiàn)10株甲流重組CIVs均能在小鼠的鼻竇和肺臟復(fù)制，以LZ56組的復(fù)制滴度最高，分別達到107.3TCID50/ mL和105.3TCID50/ mL；肺臟病理切片觀察發(fā)現(xiàn)LZ36、LZ45、LZ56和QZ5組出現(xiàn)不同程度病變，以支氣管上皮細胞壞死脫落，肺泡壁增厚，肺泡腔以及支氣管內(nèi)有大量的彌漫性浸潤的單核細胞為主要特征。結(jié)果表明，新型重組CIVs均能感染BALB/c小鼠，并能在小鼠體內(nèi)較好復(fù)制，甚至致死，一旦這些新型CIVs以犬為中間宿主傳播給人，勢必對人類健康構(gòu)成重大威脅。因此，加強對CIVs的監(jiān)測將為防控人流感大暴發(fā)提供提前預(yù)警。

甲型流感；重組；犬流感病毒；致病性；小白鼠

犬流感（canine influenza，CI）是由犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）引起的犬的一種急性接觸性呼吸道疾病，病犬主要表現(xiàn)咳嗽、噴嚏、呼吸困難等。研究發(fā)現(xiàn)犬的呼吸道系統(tǒng)存在兩種唾液酸受體，即SAα2,3Gal和SA α2,6Gal唾液酸受體，主要分布在鼻粘膜、氣管和支氣管的上皮細胞[1,2]，這意味著犬也可以作為中間宿主，可以感染禽和人流感病毒。事實上，臨床發(fā)現(xiàn)了多種亞型禽流感病毒的感染，如禽源H3N2[3]、禽源H5N1[4]、禽源H5N2[5]、禽源H9N2[6]、禽源H10N8[7]和新型重組毒株流感病毒[8]。此外，犬血清學(xué)調(diào)查也證實，2009年爆發(fā)的甲型流感病毒株（pdm/09）、季節(jié)性人流感H3N2亞型病毒也都曾感染犬[9]，并且從病毒分離及動物實驗證實了pdm/09株感染犬[10]，為人流感病毒感染犬提供了直接的證據(jù)。同時我們對廣西地區(qū)CIV的臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒在呈地方流行態(tài)勢，某些城市如梧州CIV檢測陽性率高達40%[11]。隨著2009年甲型流感病毒pdm/09株的暴發(fā)，韓國陸續(xù)報道發(fā)現(xiàn)了與該毒株重組的新病毒株。Song等[8]報道了與pdm/09重組的新型H3N1 CIV，其內(nèi)部基因及NA基因來源于pdm/09譜系。Moon等[12]報道了M基因來源pdm/09譜系，其他基因片段來源H3N2 CIV的重組病毒H3N2mv株。犬和雪貂試驗發(fā)現(xiàn)該病毒可引起典型呼吸道癥狀，并且相比原始的禽源H3N2 CIV具有較強的毒力和復(fù)制能力，證實了源于pdm/09病毒的M基因可以增強病毒復(fù)制和傳播能力[12]。本實驗室前期研究中，從寵物犬中分離獲得了攜帶病毒pdm/09株內(nèi)部基因的重組CIVs，他們以歐亞類禽的表面基因（HA和NA）、pdm/09的內(nèi)部基因（PB2、PB1、PA和NP）為主要特征，其中某些毒株甚至出現(xiàn)“人+豬+犬”三種不同宿主來源片段的重組形式。因此，為了解這些不同亞型pdm/09重組CIVs對哺乳動物的致病性，本實驗通過建立CIVs感染小鼠模型來探索他們的易感性和復(fù)制能力，為將來有效地防控新型流感病毒在人類的暴發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株

由本實驗室分離保存，具體信息如表1所示。

1.2 雞胚和細胞

9～11日齡SPF雞胚購自廣西麗原生物制品有限公司；犬腎細胞MDCK（madin-darby canine kidney cell，MDCK）由廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心惠贈。

1.3 實驗動物

6周齡SPF級BALB/c雌性小鼠約20 g，購買于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.4 實驗方法

采用9～11日齡SPF雞胚尿囊腔接種法擴增病毒，取細胞上清經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每個樣品接種2枚，0.2 mL/枚。37℃孵育，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，72 h后收胚，無菌收集雞胚尿囊液，進行RT-PCR鑒定，然后接種MDCK細胞并通過空斑試驗和TCID50測定其病毒效價。

1.5 實驗動物的感染

99只小鼠隨機平均分成實驗組（10組）和對照組，每組9只，采取麻醉滴鼻的接種方式，實驗組小鼠接種50 μL（約含1.0×106TCID50/mL）病毒液，對照組接種50 μL/只DMEM。接種開始前時刻記為0天，并稱其體重，作為參考值，然后每組小鼠每天稱其體重，當其體重下降20%后則默認其死亡。觀察其臨床癥狀，統(tǒng)計死亡率，攻毒后3 d和5 d時每組隨機剖殺三只小鼠，采集腦、上鼻竇組織、心、肝、脾、肺（左肺固定，右肺滴定）、腎和腸道組織，然后進行TCID50測定病毒效價并觀察肺臟的病理變化。

1.6 實驗數(shù)據(jù)分析

運用Graph Pad Prism 5軟件進行圖表制作，并運用SPSS統(tǒng)計分析軟件分析小鼠實驗所得到的實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 攻毒后小鼠體重變化

攻毒后3 d開始，LZ56、QZ5和WZ 2組出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、食欲減退和被毛凌亂等臨床癥狀。體重均有一定程度下降，其中LZ56組的小鼠體重下降最為明顯，差異具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.5），在攻毒后8 d體重降到83%，之后逐漸恢復(fù)，但是仍比其他組的體重低（如圖1）。

表1 本研究所用新型CIVs毒株信息Table 1 Reassortant patterns of novel Canine influenza viruses in the study

P: 2009年甲型流感病毒譜系; T: 北美三重重組豬流感病毒譜系; E: 歐亞禽源豬流感病毒譜系; A: 禽源H3N2亞型犬流感病毒譜系P: Pandemic/2009; T: Triple reassortant swine; E: Eurasian Avian-like swine; A: Avian-like H3N2 canine

圖1 小鼠體重變化圖Fig.1 Body weight of the mice infected with different CIVs

圖2 小鼠存活率Fig.2 Survival rate of the mice infected with different CIVs

2.2 攻毒后小鼠存活率

通過14 d的體重監(jiān)測，結(jié)果只有LZ56組的重組H1N1亞型毒株均在攻毒后6 d和攻毒后7 d致死小鼠，其存活率為77.78%，其他組的毒株均未能致死小鼠，其存活率為100%（圖2）。

2.3 小鼠攻毒后病毒在呼吸道的復(fù)制情況

采用TCID50方法，對10組小鼠各個臟器中病毒進行滴定，我們發(fā)現(xiàn)這些重組病毒均能在肺臟和上鼻竇復(fù)制，平均病毒滴度≥103.7TCID50/mL，其中LZ56組在肺臟的復(fù)制能力較好，感染后3 d和5 d分別達到106.0TCID50/mL和106.1TCID50/mL。此外LZ45組相比其他組的肺臟復(fù)制較差，感染后5 d的病毒滴度僅有103.7TCID50/mL。相對應(yīng)的是，上鼻竇病毒滴度分別為104.5TCID50/mL和104.9TCID50/mL。結(jié)果表明這些重組H1N1和H3N2亞型CIVs能較好地適應(yīng)在哺乳動物體內(nèi)的復(fù)制，甚至具有潛在的傳播能力（圖3）。

2.4 小鼠肺臟病理變化

我們采用HE染色觀察小鼠肺臟損傷程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有CIVs重組病毒都可以造成肺臟不同程度的病變，其中以LZ36、LZ45、QZ5和LZ56組小鼠肺臟損傷較為嚴重，主要以支氣管壞死脫落、肺泡壁增厚、肺泡腔以及支氣管內(nèi)有大量的彌漫性浸潤的單核細胞為主。對照組肺泡均勻，無萎縮或擴張，無充血或炎細胞浸潤（HE染色-藍紫色，圖中黑色箭頭所指）、巨噬細胞（HE染色-紅色，圖中藍色箭頭所指），見圖4。

圖3 病毒在肺臟和上呼吸道的復(fù)制情況Fig. 3 Virus titers of reassortant CIVs in the lung and turbinate

圖4 感染后5 d小鼠肺臟伊紅蘇木素染色圖Fig.4 HE staining of microscopic lung sections from mice infected with reassortant CIVs at 5 d.p.i

3 討論

不同宿主基因片段的重組產(chǎn)生的新型流感病毒，容易導(dǎo)致傳播力和毒力增強。由于豬呼吸道上皮細胞受體擁有結(jié)合人和禽流感病毒的受體，使得豬成為最佳的中間宿主，接受來自人和禽流感病毒的感染，從而產(chǎn)生新型流感病毒。隨著2009年H1N1甲型流感病毒的暴發(fā)，除了在豬群發(fā)現(xiàn)攜帶pdm/09病毒基因的重配病毒，寵物犬也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列的重配病毒，如H3N2 CIV 和pdm/09病毒中的M基因重組[12]，H3N2 CIV HA基因和pdm/09病毒重組的H3N1 CIV[8]等。此外，韓國學(xué)者采用不同動物模型評估禽源H3N2 CIV對不同宿主的致病性差異，小鼠無任何臨床癥狀，從而確定無適應(yīng)性的小鼠不是禽源H3N2亞型 CIV感染的最佳模型[13]。但是后續(xù)的實驗發(fā)現(xiàn)，攜帶pdm/09病毒的禽源H3N2亞型 CIV卻能在小鼠上復(fù)制。Lyoo等[14]用攜帶pdm/09的PA、M和NS基因的重組H3N2 CIV感染小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病毒不僅引發(fā)小鼠死亡，而且使犬和雪貂在感染后d4排毒。Moon等[12]采用攜帶H3N2亞型 CIV 和pdm/09病毒的M基因重組株進行了雪貂和犬感染實驗，結(jié)果表明重組H3N2亞型 CIV可以通過直接接觸感染引發(fā)傳播，并且有典型的呼吸道癥狀和排毒現(xiàn)象。Lyoo等[14]和Moon等[12]的實驗結(jié)果也說明這一點，攜帶pdm/09基因的的重組病毒，不僅具有致病性，而且具有一定傳播能力。為評估這些新型pdm/09重組CIVs的生物學(xué)特性，本研究通過建立無適應(yīng)性感染小鼠模型，探索了這些重組病毒對小鼠的致病性和復(fù)制能力。與韓國學(xué)者報道一致的是，這些重組毒株能夠?qū)е滦∈蟪霈F(xiàn)不同程度的臨床癥狀和病理變化。盡管這些重組毒株的毒力不是很強，但是值得關(guān)注的是，所有毒株都可以在肺臟和上鼻竇復(fù)制，特別是LZ56組展現(xiàn)較好的復(fù)制能力，甚至致死小鼠。序列分析發(fā)現(xiàn)在LZ56毒株HA蛋白的225位點發(fā)生改變，由谷氨酸（E）變?yōu)楦拾彼幔℅）（數(shù)據(jù)未出示）。研究證實，HA225G將有利于病毒在肺臟復(fù)制，引發(fā)嚴重的肺炎[15]。此外，有研究證實pdm/09的基因片段與毒力、復(fù)制能力和傳播特性相關(guān)。Lakdawala[16]和Chou等[17]用病毒pdm/09株的M基因和病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）株的7個基因片段重組的流感病毒進行雪貂和豚鼠實驗證實，M基因在增強傳播能力中扮演著關(guān)鍵角色。Lyoo等[14]研究表明病毒pdm/09株的PA和NS 基因在病毒的傳播能力和致病性上也有很重要的作用，尤其是PA-P224S和NS-I123V基因氨基酸位點變化。同時Gaelle Gonzalez等[18]研究也證明了流感病毒的毒力是由流感病毒的HA和NA基因決定。因此，這些攜帶EA表面基因和禽源H3N2 CIV表面基因，pdm/09內(nèi)部基因的新型CIVs都能在小鼠的鼻竇較好復(fù)制，是否意味著這些重組病毒具有潛在的傳播能力？這有待進一步研究。

總之，本研究評估了在寵物犬群中出現(xiàn)的新型流感病毒對小鼠的致病性，它們不僅無適應(yīng)感染小鼠，而且在肺臟和上鼻竇能夠較好地復(fù)制，甚至致死小鼠。基因的交替重配將會驅(qū)動病毒的進化和對宿主的適應(yīng)性，一旦這些新型重組CIVs具有跨宿主傳播的特性，人類將受到直接的威脅。因此，加強對寵物犬中CIVs重組事件的監(jiān)測，切斷流感病毒中間傳播路徑，將有利于及早防控人類流感大暴發(fā)。

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PATHOGENICITY OF REASSORTANT CANINE INFLUENZA VIRUS WITH PANDEMIC/2009 IN MICE

ZHAO Wei-feng1, HE Ping1, ZHOU Hua-bo1,2, DING Yang-bao1, CHEN Quan-jiang1, LIU Lin1,LI Rui-kai1, ZOU Yuan-jing1, LIAO Zhuo-yun1, WANG Ling-xiao1, WEI Zu-zhang1, OUYANG Kang1,SUN Wen-bo3, HUANG Wei-jian1, CHEN Ying1
(1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2.Huabo Pet Hospital, Nanning 530004,China; 3. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

In the present study, we assessed the pathogenicity of novel emerging reassortant CIVs carrying pandemic/2009 segments in the mouse model. Mice were infected intranasally with 106TCID50/mL of 9 H1N1 and 1 H3N2 reassortant CIVs. Results showed that body weights of all mice decreased. Especially, mice infected with A/Canine/Guangxi/LZ56/2015 (H1N1) lost more weights at 4 dpi and 77.78% of mice survived. Besides, these reassortant viruses replicated in turbinates and lungs. The virus titers of reached to 107.3TCID50/mL in turbanates and 105.3TCID50/mL in lungs. The pathological lesions were observed, characterized by necrosis of bronchial epithelials,thickness of alveolar septas and interstitial walls and diffuse in filtration of mononuclear cells. Taken together, our results showed thatthese reassortant CIVs with pandemic/2009 infected BALB/c mice and even caused death.

Pandemic/2009; Canine influenza virus; reassortant; pathogenicity; mice

S852.659.5

A

1674-6422（2017）06-0032-05

2017-03-20

廣西自然科學(xué)基金回國項目（2015GXNSFCA139002）；廣西自然科學(xué)基金青年基金項目（2016GXNSFBA380219）；廣西大學(xué)博士啟動項目（XBZ160123）；山東省博士基金（BS2013SW022）

趙衛(wèi)鋒，女，碩士，主要從事寵物流感病毒分子生物學(xué)研究

陳櫻，E-mail：yingchen@gxu.edu.cn