于可響，侯艷霞，胡 峰，亓麗紅，劉存霞，路 曉，黃 兵，宋敏訓(xùn)

（1.山東省農(nóng)科院家禽研究所 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司，煙臺(tái) 264003）

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體在雞體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律

于可響1，侯艷霞2，胡 峰1，亓麗紅1，劉存霞1，路 曉1，黃 兵1，宋敏訓(xùn)1

（1.山東省農(nóng)科院家禽研究所 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司，煙臺(tái) 264003）

將Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體注射到SPF雞體內(nèi)，通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)雞血清的抗體效價(jià)，確定卵黃抗體在體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射后6 h即可在實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)檢測(cè)到較高水平的抗體，平均中和效價(jià)達(dá)到1:82，12 h抗體水平達(dá)到高峰，平均中和效價(jià)為1:124，然后逐漸降低，到12 d抗體平均效價(jià)降至1:13。卵黃抗體注射后3、6、9、12 d，利用Ⅰ群4型禽腺病毒進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示，抗體注射后6 d（體內(nèi)平均中和抗體為1:36）能起到完全保護(hù)作用，9 d（體內(nèi)平均中和抗體為1:22）只能產(chǎn)生部分保護(hù)作用，12 d（體內(nèi)平均中和抗體為1:13）完全起不到保護(hù)作用。

Ⅰ群4型禽腺病毒；卵黃抗體；體內(nèi)消長(zhǎng)規(guī)律

自2015年6月份開始，我國(guó)大部分養(yǎng)雞地區(qū)爆發(fā)了一種死亡快、死亡率高、剖檢以心包積液和肝臟腫大、質(zhì)脆、出血或壞死為主要病變特征的傳染病，稱為肝炎-心包積液綜合征，又稱安卡拉病。該病是由Ⅰ群血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)ADV）引起，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成了極大經(jīng)濟(jì)損失[1-7]。

大量臨床試驗(yàn)證明，血清4型禽腺病毒卵黃抗體對(duì)該病有很好的預(yù)防和治療作用[8-13]。但抗體注射后，在雞體內(nèi)的消長(zhǎng)變化情況目前還未見報(bào)道。本研究將血清4型禽腺病毒卵黃抗體注射到SPF雞體內(nèi)，通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)雞血清的抗體效價(jià)，確定卵黃抗體在體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律，并通過(guò)攻毒試驗(yàn)確定抗體產(chǎn)生保護(hù)的臨界值。

1 材料與方法

1.1 材料

動(dòng)物保健品有限公司惠贈(zèng)。Ⅰ群4型禽腺病毒由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所分離、保存。LMH細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。SPF雞胚、SPF雞由山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育公司提供。

1.2 方法

1.2.1 Ⅰ群4型禽腺病毒細(xì)胞毒價(jià)測(cè)定 取凍存的LMH細(xì)胞加入到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)蘇，4 h后換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，若生長(zhǎng)良好，每瓶加入1 mL含EDTA的1%胰酶進(jìn)行消化，待至細(xì)胞瓶邊緣細(xì)胞滑落時(shí)，加適量含10%胎牛血清培養(yǎng)液吹散，分裝96孔細(xì)胞板，繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿單層后待用。將凍干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，接種上述LMH細(xì)胞，200 μL/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。放37℃、CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞，接種后96 h記錄細(xì)胞病變情況，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.2.2 Ⅰ群4型禽腺病毒半數(shù)致死量測(cè)定 將凍干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒用生理鹽水做10倍系列稀釋，用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6這5個(gè)稀釋度的病毒分別通過(guò)肌肉注射接種21日齡禽腺病毒抗體陰性的SPF雞，0.2 mL/只、各5只，觀察記錄實(shí)驗(yàn)雞發(fā)病死亡情況，觀察至接種后的10 d。按Reed-Muench法計(jì)算病

Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黃抗體由煙臺(tái)綠葉毒的LD50。

1.2.3 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體中和效價(jià)測(cè)定 ?、袢?型禽腺病毒精制卵黃抗體先用生理鹽水做10倍稀釋，然后用含2%胎牛血清培養(yǎng)液做倍比稀釋，然后加入到96孔細(xì)胞板中，0.1 mL/孔，然后將Ⅰ群4型禽腺病毒SH株用含2%胎牛血清培養(yǎng)液稀釋到100 TCID50/0.1 mL，取0.1 mL加入到上述倍比稀釋的抗體中，放37℃、CO2培養(yǎng)箱中作用1 h。96孔細(xì)胞板的LMH細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄掉培養(yǎng)液，將上述孵育后的混合液0.2 mL加入到細(xì)胞板中，同時(shí)將含100 TCID50/0.1 mL的病毒與等體積的含2%胎牛血清培養(yǎng)液混合作用1 h后，加入到細(xì)胞板中，作為病毒對(duì)照組，將只加2%胎牛血清培養(yǎng)液的細(xì)胞孔作為細(xì)胞對(duì)照組。上述各組各設(shè)8孔重復(fù)，放37℃、CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至96 h，觀察并記錄細(xì)胞病變。按照Reed-Muench法計(jì)算抗體的中和效價(jià)。

1.2.4 卵黃抗體在體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律與攻毒保護(hù)試驗(yàn)將Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黃抗體通過(guò)胸部肌肉注射21日齡禽腺病毒抗體陰性的SPF雞，0.5 mL/只、共40只，標(biāo)記其中10只用于采血，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組，每只胸部肌肉注射生理鹽水0.5 mL，共40只，標(biāo)記其中10只用于采血。分別于注射后6、12、24 h、3 d、6 d、9 d、12 d采集試驗(yàn)組和對(duì)照組各10只雞的血液并分離血清，按1.2.3中的方法測(cè)定血清的中和效價(jià)，繪制卵黃抗體在體內(nèi)消長(zhǎng)變化規(guī)律圖。卵黃抗體注射后3 d、6 d、9 d、12 d分別取試驗(yàn)組和對(duì)照組各5只雞，通過(guò)胸部肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒，100 LD50/只，觀察記錄實(shí)驗(yàn)雞發(fā)病死亡情況，觀察至抗體注射后的10 d。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ群4型禽腺病毒細(xì)胞毒價(jià)測(cè)定

將凍干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒做10倍系列稀釋，在LMH細(xì)胞上進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定，每個(gè)稀釋度8孔重復(fù)，接種后96 h統(tǒng)計(jì)細(xì)胞病變情況。按Reed-Muench法計(jì)算病毒的細(xì)胞毒價(jià)，結(jié)果為108.00TCID50/0.1 mL。

2.2 Ⅰ群4型禽腺病毒半數(shù)致死量測(cè)定

將凍干保存的Ⅰ群4型禽腺病毒做10倍系列稀釋，接種21日齡禽腺病毒抗體陰性的SPF雞，每個(gè)稀釋度接種5只、觀察10 d，記錄實(shí)驗(yàn)雞死亡情況，見表1。按Reed-Muench法測(cè)定病毒的半數(shù)致死量，結(jié)果為104.38LD50/0.2 mL。

表1 SPF雞死亡情況統(tǒng)計(jì)Table 1 SPF chickens mortality statistics

2.3 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體中和效價(jià)測(cè)定

將Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黃抗體做倍比稀釋，在LMH細(xì)胞上進(jìn)行中和效價(jià)測(cè)定，每個(gè)稀釋度8孔重復(fù)，觀察至96 h，記錄細(xì)胞病變情況，見表2。按Reed-Muench法測(cè)定抗體的中和效價(jià)，結(jié)果為1:880。

表2 抗體中和試驗(yàn)細(xì)胞病變數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 2 The number of CEF statistics in antibody neutralization test

2.4 卵黃抗體在體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律與攻毒保護(hù)試驗(yàn)

卵黃抗體注射后6 h、12 h、24 h、3 d、6 d、9 d、12 d分別采集實(shí)驗(yàn)雞的血清，利用細(xì)胞中和試驗(yàn)測(cè)定其中和效價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射后6 h即可在實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)檢測(cè)到較高水平的抗體，中和效價(jià)達(dá)到1:82，12 h抗體水平達(dá)到高峰，中和效價(jià)為1:124，然后逐漸降低，24 h、3 d、6 d、9 d、12 d的抗體效價(jià)分別為1:105、1:55、1:36、1:22、1:13，見圖1。卵黃抗體注射后3 d、6 d、9 d、12 d對(duì)實(shí)驗(yàn)雞進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，抗體注射后3 d和6 d體內(nèi)的抗體能起到完全保護(hù)作用，9 d有部分保護(hù)作用，到12 d無(wú)保護(hù)作用，見表3。死亡的實(shí)驗(yàn)雞都具有心包積液、肝臟壞死出血等典型的Ⅰ群4型禽腺病毒致病特征。

圖1 卵黃抗體在體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律Fig.1 Neutralization antibodies change curve of SPF chickens after yolk antibody injection

表3 攻毒后實(shí)驗(yàn)雞死亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 3 Dead number statistics of test chickens after attacking

3 討論

近兩年肝炎-心包積液綜合征的暴發(fā)給我國(guó)的養(yǎng)雞業(yè)造成了極大的損失，目前已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疫病之一。目前該病的藥物治療效果不佳，抗體注射效果最好，但抗體注射后在雞體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，以及產(chǎn)生保護(hù)的臨界值目前還未見報(bào)道。本研究將細(xì)胞中和效價(jià)為1:880的Ⅰ群4型禽腺病毒精制卵黃抗體注射到21日齡SPF雞體內(nèi)，采集不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)雞的血清，利用細(xì)胞中和試驗(yàn)測(cè)定其中和效價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射后12 h抗體水平達(dá)到高峰，然后逐漸降低，到12 d降至1:13。攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，注射后6 d中和抗體效價(jià)達(dá)到1:36時(shí)體內(nèi)的抗體仍能起到完全保護(hù)作用，9 d中和抗體效價(jià)達(dá)到1:22時(shí)體內(nèi)的抗體只能產(chǎn)生部分保護(hù)作用，到12 d無(wú)保護(hù)作用。

本研究將卵黃抗體注射到SPF雞體內(nèi)，通過(guò)中和試驗(yàn)確定了卵黃抗體在體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律，并通過(guò)攻毒試驗(yàn)確定了體內(nèi)抗體產(chǎn)生保護(hù)的臨界值，為卵黃抗體的臨床治療與緊急預(yù)防提供參考。

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DYNAMICS OF YOLK ANTIBODIES TO SEROTYPE 4 FOWL ADENOVIRUS IN CHICKENS

YU Ke-xiang1, HOU Yan-xia2, HU Feng1, QI Li-hong1, LIU Cun-xia1, LU Xiao1, HUANG Bing1,SONG Min-xun1
(1.Shandong Provincial Key Laboratory of Poultry Disease Diagnosis and Immunology, Institute of Poultry, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250023, China; 2. Yantai Greenery Animal Health Products inc., Yantai 264003, China)

The yolk antibodies to serotype 4 (Group I) Fowl adenovirus (FAV4) were injected into SPF chickens and antibody titers were detected in serum samples collected at different time points. The results showed higher levels of antibodies could be detected in the injected chickens at 6 h post injection and average neutralizing titer reached to 1:82. Antibody level peaked at 12 h post injection with titer of 1:124 and then gradually decreased to 1:13 at d12 post injection. At days 3, 6, 9, 12 days post injection, chickens were challenged with adenovirus. The average neutralizing antibody titer at 1:36 provided chickens for complete protection at 6 days post injection, 1:22 for partial protection at 9 days post injection, and 1:13 for no protection at 12 days post injection.

Serotype 4 Fowl adenovirus group I; yolk antibody; dynamics

2017-10-20

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金（2014QNM39）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0500800）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（SDAIT-11-01）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016GNC 110009）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2015YL067）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2016B14）

于可響，男，博士，副研究員，主要從事禽病研究

宋敏訓(xùn)，E-mail：mxsong@aliyun.com；黃兵， E-mail：hbind@163.com

S852.659.1

A

1674-6422（2017）06-0028-04