馬秀麗，劉存霞，亓麗紅，胡 峰，裴宗飛，于可響，黃 兵，李玉峰，宋敏訓(xùn)，艾 武

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東省禽病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.山東省綠色食品發(fā)展中心，濟(jì)南 250000）

一起禽肺病毒與H9亞型禽流感病毒混合感染的研究報(bào)道

馬秀麗1，劉存霞1，亓麗紅1，胡 峰1，裴宗飛2，于可響1，黃 兵1，李玉峰1，宋敏訓(xùn)1，艾 武1

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東省禽病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.山東省綠色食品發(fā)展中心，濟(jì)南 250000）

從山東省一起疑似禽肺病毒感染的病例中分離到1株H9亞型禽流感病毒（H9 subtype Avian influenza virus，AIV-H9），未分離到禽肺病毒（Avian metapneumovirus，APV），但血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APV-ELISA抗體參差不齊。根據(jù)已公布的APV的G基因和AIV-H9的HA基因序列分別設(shè)計(jì)合成引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到大小為692 bp和1683 bp的目的條帶；測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，該發(fā)病雞場(chǎng)感染的APV（SD/RZ/15） G基因片段與Genbank中登錄的B型APV核苷酸序列同源性最高（92.1%～-94.5%）且遺傳距離最近，處于同一個(gè)分支。分離到的AIV-H9毒株（CK/SD/RZ/H9/15）的HA基因與參考毒株的核苷酸序列同源性為87.3%～98.9%，遺傳進(jìn)化關(guān)系分析表明該分離毒株與近幾年分離的H9處于同一個(gè)分支上。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定該病例為B型APV與AIV-H9的混合感染引起。

禽肺病毒；H9亞型禽流感病毒；混合感染

禽肺病毒（Avian metapneumovirus，APV）于1978年首次在南非報(bào)道[1]，火雞和雞是APV的自然宿主，不同日齡的雞均能感染。禽肺病毒感染后可引起3種疾?。夯痣u鼻氣管炎（turkey rhinotracheitis，TRT）、肉雞腫頭綜合征（swolean-head syndrome，SHS）和禽鼻氣管炎（rhinotracheitis，ART）。該病沒(méi)有特征性的臨床表現(xiàn)和病變，但可以通過(guò)感染禽與易感禽直接接觸傳播，或者接種感染禽類的呼吸道粘液或者其他樣品傳播。所引起的癥狀常與雞傳染性支氣管炎、支原體、鼻氣管鳥(niǎo)桿菌感染和禽流感等呼吸道疾病相混淆[2]。由于APV分離比較困難，目前所報(bào)道的APV感染，實(shí)驗(yàn)證據(jù)多限于血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。已報(bào)道檢測(cè)到APV的地區(qū)國(guó)家有南非，歐洲大陸、美國(guó)、法國(guó)、巴西、中國(guó)、韓國(guó)、日本、以色列、約旦、尼日利亞等國(guó)家，中國(guó)大陸于1998年首次分離到APV[3]。對(duì)APV感染種雞的血清學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)種雞群中普遍存在APV感染，個(gè)別種雞群陽(yáng)性感染率達(dá)100%[4,5]，而且開(kāi)產(chǎn)前后或30周齡左右易感染，抗體水平明顯升高。

H9亞型禽流感（H9 subtype avian influenza virus，AIV-H9）通常不發(fā)病或僅表現(xiàn)輕微的上呼吸道癥狀，因此，AIV-H9的感染或其引起的疾病常常被忽視。然而，一旦AIV-H9與其他病原微生物合并感染，就會(huì)給養(yǎng)殖場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，AIV-H9流行趨勢(shì)不斷增加且感染宿主十分廣泛，因此，越來(lái)越被人們所重視[6,7]。

禽肺病毒單獨(dú)發(fā)病較少，往往與大腸桿菌或禽流感混合感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)引起一起39日齡ROSS雞最高日死淘率1.86%，發(fā)病雞只有腫頭、腫臉臨床癥狀，剖檢細(xì)菌感染較嚴(yán)重（心包炎、肝周炎）等進(jìn)行了病原分離和抗體檢測(cè)，研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 山東某雞場(chǎng)發(fā)病雞氣管、肺臟組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

6日齡SPF雞胚購(gòu)于山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育公司；反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）購(gòu)自Promega公司；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；APV試劑盒購(gòu)自IDEXX公司。

1.3 病毒分離

取發(fā)病雞氣管、肺臟等組織勻漿搗碎，加雙抗作用，離心取上清，經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚5枚，0.2 mL/枚，另設(shè)生理鹽水對(duì)照。37℃溫箱培養(yǎng)，觀察7 d，記錄結(jié)果，收取活胚尿囊液，進(jìn)行血凝試驗(yàn)，按同樣方法繼代6次。收獲尿囊液接種CEF細(xì)胞，盲傳3代。

1.4 發(fā)病雞群的抗體檢測(cè)

采集發(fā)病雞群1#和2#舍血清30份，按照IDEXX公司APV試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行APV抗體的檢測(cè)，常規(guī)HI試驗(yàn)進(jìn)行H9抗體的檢測(cè)。

1.5 RT-PCR鑒定

參考GenBank中收錄的APV G基因序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，上游引物：5'-TGTCGTGGTAGTTAGTCG-3'和下游引物：5'-TTGGTCGGTTGTCGTTTA-3'，擴(kuò)增片段692 bp；參考AIV-H9 HA基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物：5'-AGCAAAAGCAGGGGAATTT-3'和下游引物：5'-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTG-3'，擴(kuò)增片段1683 bp。引物均由北京博尚生物有限公司合成。Trizol方法提取病料中的病毒RNA，進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。RT反應(yīng)條件：72℃ 5 min，42℃ 30 min，95℃ 2 min。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 1 min，50℃ 退火1 min，72℃延伸 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，雙酶切法鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，并送至北京博尚生物有限公司測(cè)序。

1.6 序列分析

將獲得的基因序列分別與GenBank中公布的APV G基因和AIV-H9 HA基因進(jìn)行核苷酸序列同源性分析，用Boot-strap法（Replication值為1000）計(jì)算基因遺傳距離并繪制進(jìn)化關(guān)系發(fā)生樹(shù)，其中Bootstrap值小于50%的數(shù)值未顯示，分析分離毒株與參考毒株之間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

病料經(jīng)卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，第一代雞胚60 h出現(xiàn)死亡，經(jīng)HA試驗(yàn)檢測(cè)，分離病毒HA效價(jià)達(dá)4 log2，該分離毒株可被AIV-H9陽(yáng)性血清中和，確定尿囊液中含有AIV-H9，命名為CK/SD/RZ/H9/15。將病料上清液與等體積AIV-H9陽(yáng)性血清混合，室溫作用0.5 h后，經(jīng)卵黃囊接種SPF雞胚，37℃溫箱培養(yǎng)5 d，收集活胚尿囊液，繼續(xù)盲傳6代后，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)APV，均未擴(kuò)增出目的條帶，表明沒(méi)有分離到APV。

2.2 發(fā)病雞群的抗體檢測(cè)

份血清分別進(jìn)行H9亞型禽流感HI檢測(cè)和APV-ELISA測(cè)定。結(jié)果顯示，H9-HI抗體滴度參差不齊，最高者與最低者相差10 log2；14份血清為APV陽(yáng)性，血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率為46.7%，且ELISA抗體滴度參差不齊，最高者可達(dá)2136，最低者為1，見(jiàn)表1。

2.3 序列分析

擴(kuò)增與等體積AIV-H9陽(yáng)性血清混合作用后的病料中APV的G基因（標(biāo)記為SD/RZ/15），進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，該基因與Genbank中登錄的B型APV核苷酸序列同源性最高，高達(dá)92.1%～94.5%；而該序列與A型APV核苷酸序列同源性為54.1%～54.4%，與C型APV核苷酸序列同源性最低，僅為13.0%～25.4%。遺傳進(jìn)化關(guān)系分析表明該病料中APV的G基因與B型APV遺傳距離最近，處于同一個(gè)分支（圖1）；分離到的AIV-H9毒株（CK/SD/RZ/H9/15）的HA基因與參考毒株的核苷酸序列同源性為87.3%～98.9%，遺傳進(jìn)化關(guān)系分析表明該分離毒株與近些年分離的H9處于同一個(gè)分支上。

選取2個(gè)發(fā)病雞群共抽取30

3 討論

禽肺病毒（APV）為副黏病毒科、肺病毒亞科、偏肺病毒屬的病毒[8]，F(xiàn)和G蛋白是副粘病毒的兩個(gè)主要表面蛋白，并且是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的重要抗原[9]，因此，F(xiàn)和G蛋白常被作為重點(diǎn)研究對(duì)象。根據(jù)禽肺病毒G蛋白的基因不同可以將其分為A、B、C、D 4個(gè)亞型，其中A亞型和B亞型呈世界范圍內(nèi)廣泛流行，C亞型感染以美國(guó)為主，中國(guó)最近也發(fā)現(xiàn)C亞型禽肺病毒[10]，D亞型僅見(jiàn)法國(guó)報(bào)道[11,12]。其中APV/C亞型，明顯區(qū)別于APV/A和APV/B，而與人偏肺病毒的基因組相似[13]。

由于APV的分離比較困難，禽肺病毒感染最常用的診斷方法主要依賴ELISA的血清學(xué)檢測(cè)法。商品化的ELISA試劑盒可用于禽肺病毒多個(gè)亞型抗體的檢測(cè)，但不能分型，而PCR技術(shù)結(jié)合測(cè)序分析可進(jìn)行APV的分型。因此，本試驗(yàn)中我們首先對(duì)采集的病料進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果APV和AIV-H9均為陽(yáng)性。同時(shí)我們又對(duì)該雞場(chǎng)2個(gè)發(fā)病雞群共抽取30份血清進(jìn)行APV-ELISA測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率為46.7%，且ELISA抗體參差不齊，滴度最高者可達(dá)2136，表明抗體檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果相吻合。

表1 發(fā)病雞群抗體檢測(cè)結(jié)果Table 1 Antibody detection of infectious chickens

圖1 基于APV G基因核苷酸序列的進(jìn)化關(guān)系分析Fig. 1 Phylogenetic analysis based on G gene of APV

圖2 基于AIV-H9 HA基因核苷酸序列的進(jìn)化關(guān)系分析Fig. 2 Phylogenetic analysis based on HA gene of AIV-H9

為進(jìn)一步分離APV，我們先用AIV-H9陽(yáng)性血清中和病料，然后經(jīng)卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，收獲尿囊液，檢測(cè)無(wú)血凝活性后繼續(xù)盲傳6代，仍未見(jiàn)雞胚死亡。再將收取的尿囊液接種雞胚成纖維細(xì)胞（chickenembryo fibroblast，CEF），盲傳4代也未見(jiàn)細(xì)胞病變。收獲的細(xì)胞毒經(jīng)RT-PCR鑒定為APV陰性，表明未能分離到APV，這可能與送檢樣品的采集時(shí)機(jī)不準(zhǔn)確有直接關(guān)系。APV的分離與樣品的采集時(shí)間非常關(guān)鍵，雞群一旦出現(xiàn)臨床癥狀，排毒期已過(guò)，就很難分離到病毒，所以采集樣品時(shí)，最好采集發(fā)病雞群中沒(méi)有臨床癥狀雞只的氣管棉。盡管我們沒(méi)能分離到APV，但通過(guò)對(duì)該發(fā)病雞群感染的APV（SD/RZ/15）的G基因片段進(jìn)行測(cè)序與進(jìn)化關(guān)系分析，明確了該病例為B型APV感染所致。從該發(fā)病雞群中也分離到1株AIV-H9，命名為CK/SD/RZ/H9/15，對(duì)雞胚的致死率很高，且死亡時(shí)間較經(jīng)典毒株縮短，多集中在48～72 h，表明該病毒對(duì)雞胚的致死力有所增強(qiáng)。遺傳進(jìn)化分析表明該分離毒株與近幾年分離的H9處于同一個(gè)分支上，未發(fā)生明顯的遺傳變異。

盡管APV感染在中國(guó)發(fā)現(xiàn)較晚，但已經(jīng)在許多地區(qū)廣泛流行[14]。目前，針對(duì)APV感染尚無(wú)有效的治療方法。一旦確認(rèn)感染，應(yīng)用抗生素預(yù)防細(xì)菌性繼發(fā)感染，減輕癥狀、減少死亡[15]。疫苗接種是預(yù)防APV感染的有效措施，建議引進(jìn)國(guó)外商品化的A亞型或B亞型疫苗?？共《局兴幙捎糜贏IV-H9的治療。此外，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理?xiàng)l件和生物安全措施，可明顯減少APV和AIV-H9混合感染造成的損失。

[1] Buys S B, Du Preez J H. A preliminary report on the isolation of a virus causing sinusitis in turkeys in South Africa and attempts to attenuate the virus[J]. Turkeys,1980, 28: 36-56.

[2] Jones R. Avian pneumovirus infection: questions still unanswered[J]. Avian Pathol, 1996, 25(4): 649-648.

[3] 沈瑞忠, 曲立新, 于康震, 等. 禽肺病毒的分離鑒定[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 1999, 21(1): 76-77。

[4] Owoade A A, Ducatez M F, Hubschen J M,et al. Avian metapneumovirus subtype A in China and subtypes A and B in Nigeria[J]. Avain Dis, 2008, 52: 502-506.

[5] 郭龍宗, 曲立新. 種雞禽肺病毒感染的血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2009, 36(4): 149-150.

[6] Li C, Yu K, Tian G,et al. Evolution of H9N2 influenza viruses from domestic poultry in Mainland China[J].Virology, 2005, 340(1): 70-83.

[7] 張毅, 王幼明, 王芳, 等.我國(guó)禽流感研究進(jìn)展及成就[J].微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41(3): 497-503.

[8] Randhawa J S, Wilson S D, Tolley K P,et al. Nucleotide sequence of the gene encoding the viral polymerase of avian pneumovirus[J]. J Gen Virol, 1996, 77: 3047-3051.

[9] Sugiyama M, Koimaru H, Shiba M,et al. Drop of egg production in chickens by experimental infection with an avian metapneumovirus strain PLE8T1 derived from swollen head syndrome and the application to evaluate vaccine[J]. J Vet Med Sci, 2006, 68(8): 783-787.

[10] Wei L, Zhu S S, Yan X,et al. Isolation and charact-erization of avian metapneumovirus subgroup C in chickens[J]. The French branch of WVPA (GF-AMVA),2013: 379.

[11] Cook J K A, Cavanagh D. Detection and differentiation of avian pneumoviruses(metapneumoviruses)[J]. Avian Pathol, 2002, 31:117-132.

[12] Shobha B, Preeti B. Avian and human metapneumo virus[J]. Ny Acad Sci, 2007, 1102: 66-85.

[13] Seal B S. Avian pneumoviruses and emergence of a new type in the United States of America[J]. Anim Health Res Rev, 2000, 1: 67-72.

[14] 徐仕忠, 秦云, 于鵬, 等. 中國(guó)雞群禽偏肺病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告[J]. 中國(guó)家禽, 2013, 35(6): 59-60.

[15] 孫石開(kāi), 劉闖, 魯俊鵬, 等. 覃健萍禽肺病毒研究進(jìn)展[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 34(9): 756-760.

A BRIEF REPORT OF MIXED INFECTION OF AVIAN METAPNEUMOVIRUS AND H9 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VIRUS

MA Xiu-li1, LIU Cun-xia1, QI Li-hong1, HU Feng1, PEI Zong-fei2, YU Ke-xiang1, HUANG Bing1,LI Yu-Feng1, SONG Min-xun1, AI Wu1
(1. The Key Lab of Poultry Disease Diagnosis and Immunology of Shandong Institute of Poultry Science, Shandong Academy of Agricultural Science, Jinan 250023, China; 2. Shandong Green Food Development Center, Jinan 250000, China)

The H9 subtype Avian influenza virus (AIV-H9) （CK/SD/RZ/H9/15）was isolated from a case infected by Avian metapneumovirus (APV) in Shandong. No APV was isolated and antibody was detected irregularly by ELISA. However, the cDNA fragments of 692 bp and 1683 bp were amplified using specific primers corresponding to G gene of APV and HA gene of AIV-H9 in GenBank. The nucleotide sequences analysis showed that the APV shared more than 92.1%-94.5% homology with B type APV in G gene,which suggested that APV might belong to B type APV. Furthermore, the AIV strain CK/SD/RZ/H9/15 shared 87.3%-98.9% homology with AIV-H9 in view of HA gene, which suggested closer relationship between isolated viruses in recent years. In conclusion, the case was caused by mixed infection of APV and AIV-H9.

Avian metapneumovirus; H9 subtype Avian influence virus; mixed infection

2017-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項(xiàng)目（31440086）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（SDAIT-13-011-01）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2016A10）

馬秀麗，女，博士，副研究員，主要從事禽病診斷與防制技術(shù)研究

宋敏訓(xùn)，E-mail：mxsong@aliyun.com；艾武，E-mail：aw5970@163.com

S852.659.5

A

1674-6422（2017）06-0023-05