曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，譚 磊，孫英杰，宋翠萍，孟春春，丁 鏟

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與新城疫病毒的早期復制

曲昱蓉，詹 媛，仇旭升，譚 磊，孫英杰，宋翠萍，孟春春，丁 鏟

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為了研究泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）具體參與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）復制的哪個階段，本研究通過在NDV感染不同階段加入泛素-蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑MG-132，結合使用蛋白酶K試驗證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)并未參與NDV入侵細胞的過程，而是參與了NDV入侵細胞之后的復制早期階段（0～6 h）。再利用蔗糖密度梯度離心試驗分離細胞內體，使用針對內體標志蛋白Rab5的抗體確定內體位于第8～10層。建立了檢測Herts/33毒株P基因的絕對熒光定量方法，繪制了標準曲線。并通過該絕對熒光定量法比較MG-132和DMSO處理的細胞內體中病毒含量，發(fā)現(xiàn)使用抑制劑處理的細胞內體所在層中病毒含量較高，提示蛋白酶體抑制劑可以使NDV滯留于細胞內體中。本研究首次證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與了NDV進入細胞后從內體釋放出來的過程。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；新城疫病毒；MG-132；內體

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種多邊形的有囊膜的病毒，病毒粒子直徑大約200～300 nm。其基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA[1]。新城疫病毒是一種在經濟上非常重要的禽類病毒，它可以導致家禽養(yǎng)殖業(yè)巨大的損失[2]。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是真核細胞中除溶酶體系統(tǒng)外最重要的蛋白質降解系統(tǒng)。靶蛋白的泛素化過程一般為泛素活化酶E1通過自身活性位點的半胱氨酸殘基與泛素分子的羧基末端進行共價結合以激活泛素分子。這種含有高能硫酯鍵的泛素分子通過E1的活性位點傳遞至下一級反應，即與泛素連接酶E2反應。最終泛素蛋白連接酶E3與結合在E2上的泛素分子和底物蛋白相結合，將泛素分子轉移至底物蛋白上。最終26S蛋白酶體識別并降解已被K48位泛素化修飾的靶蛋白，完成蛋白質降解過程[3]。

相關研究表明冠狀病毒屬中的鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus，MHV）在使用蛋白酶體抑制劑MG-132后，會被滯留于內體（Endosome），或被錯誤誘導至溶酶體（Lysosome）中，阻礙其進一步復制。證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到MHV從內體釋放到細胞質的過程中[4]。通過全基因組的RNA干擾篩選發(fā)現(xiàn)一種泛素蛋白連接酶（E3）-Itch蛋白，在Itch蛋白被敲除的細胞中，流感病毒的病毒核糖核蛋白復合體可以正常進入內體，但卻無法從內體中釋放出來，這也說明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與流感病毒從內體釋放出來的過程[5]。

之前的實驗已經初步驗證泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV在細胞中的復制[6]。但NDV在進入細胞后，是否也要利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)協(xié)助其在細胞內轉移卻不清楚。為了進一步探索泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV復制的具體機制，我們首先利用蛋白酶體抑制劑MG-132確定了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV復制的早期階段。在初步確定相關的時間階段后，利用蛋白酶K試驗，確定泛素-蛋白酶體不參與NDV入侵細胞的過程，而僅參與到入侵細胞后復制的早期階段。最后我們利用蔗糖密度梯度離心法來分離細胞內體（Endosome），建立絕對熒光定量法檢測Herts/33毒株P基因，證明當使用蛋白酶體抑制劑MG-132時，大量NDV會被滯留于內體中，證明NDV在復制早期階段會利用泛素-蛋白酶體系統(tǒng)協(xié)助其在細胞內發(fā)生轉移。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞

本試驗所用病毒毒株為NDV標準強毒Herts/33毒株，由揚州大學劉秀梵院士惠贈；雞胚成纖維細胞系DF-1細胞和人子宮頸癌細胞系HeLa細胞由本實驗室保存，細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 蛋白酶體抑制劑階段性加入實驗

參考文獻[4]方法，接種DF1細胞至35 mm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至90%時，將培養(yǎng)皿分成6組，分別為a組（無MG-132處理）、b組（MG-132預處理2 h）、c組（MG-132全程處理）、d組（MG-132處理0～6 h）、e組（MG-132處理6～12 h）和f組（MG-132處理12-18 h）。按照該分組方式使用蛋白酶體抑制劑MG-132（10 μmol/mL），每組細胞都接種1 MOI Herts/33病毒。在病毒感染后6、12、18、24 h收取細胞上清，并再次換上1.5 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。檢測每個時間點收取細胞上清TCID50值，結果按照Reed-Muench法計算。

1.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對NDV入侵過程的影響

1.3.1 蛋白酶K藥物濃度篩選試驗 將DF1細胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至90%時，接種1 MOI Herts/33株病毒，置于4℃培養(yǎng)15 min，用PBS漂洗3次后將一個培養(yǎng)皿繼續(xù)置于4℃培養(yǎng)，使NDV僅吸附在細胞上，另一個培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)15 min，使已經吸附在細胞膜上的NDV可以入侵細胞。將蛋白酶K進行系列稀釋，分別稀釋為0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL，作用細胞5 min后，用PBS漂洗3次以去除殘留的蛋白酶體K。換上含有3%FBS的維持培養(yǎng)后，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收取細胞上清，檢測其TCID50值。在這個試驗中蛋白酶K被用于洗去吸附于細胞表面但未能入侵的病毒粒子。蛋白酶K是從林伯氏白色念球菌中純化得到的一種高活性蛋白酶，可用于一般生物樣品中蛋白質的降解，切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵[7]。

1.3.2 蛋白酶K藥物試驗 DF1細胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至90%時，其中2個培養(yǎng)皿使用10 μmol/mL MG-132處理細胞2 h，另設2個相同稀釋度DMSO處理細胞培養(yǎng)皿。抑制劑預處理2 h后接種1 MOI Herts/33株病毒，立即將細胞置于4℃冰箱孵育15 min，用PBS漂洗3次后，換上無抗無血培養(yǎng)基，將一個MG-132處理培養(yǎng)皿和一個DMSO處理培養(yǎng)皿繼續(xù)置于4℃培養(yǎng)15 min，另一組的2個培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)15 min。用0.5 μg/mL蛋白酶K作用細胞5 min以去除吸附于細胞表面但未能入侵的病毒粒子，PBS漂洗3次以去除殘留的蛋白酶K。換上維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，12 h之后收取每個培養(yǎng)皿的上清并檢測計算上清TCID50值。

1.3.3 肝素鈉陽性對照試驗 DF1細胞接種至35 mm培養(yǎng)皿中，待細胞生長至80～90%時，其中一個培養(yǎng)皿用100 μg/mL肝素鈉預處理2 h，另一個培養(yǎng)皿使用10 μmol/mL MG-132預處理2 h，作為空白對照的培養(yǎng)皿中只加入無抗無血DMEM培養(yǎng)基。預處理2 h后，根據細胞計數(shù)結果，感染1 MOI Herts/33病毒后立即置于4℃培養(yǎng)15 min，用PBS清洗3次，換上新鮮培養(yǎng)基后都置于37℃培養(yǎng)15 min，0.5 μg/mL蛋白酶K 處理5 min后，用PBS漂洗3次以去除殘留的蛋白酶體K。換上維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，12 h之后收取每個培養(yǎng)皿的上清并檢測計算TCID50值。文獻報道肝素鈉能阻斷病毒入侵[8]，在本試驗中作為影響病毒入侵的陽性對照藥物。

1.4 蛋白酶體抑制劑對新城疫病毒入侵后影響

1.4.1 蔗糖密度梯度離心 將HeLa細胞接種至100 mm培養(yǎng)皿中，細胞生長至90%時，使用0.4 μmol/mL的MG-132預處理細胞2 h，接種1 MOI Herts/33株病毒，37℃細胞培養(yǎng)箱中作用1 h，再換上含有MG-132的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h。設置相同稀釋度的DMSO處理組。將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基棄去，用PBS清洗3次后，置于冰上，使用Homogenization buffer（100 mL水，250 mmol/L 蔗糖，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF）裂解細胞，每個培養(yǎng)皿中加入500 μL Homogenization buffer，冰上裂解30 min后，收集裂解液通過22-G（6.5號）針頭10次，4℃、1000×g的離心15 min，取上清即為PNS（已提取過核酸的上清）。輕輕滴加60%蔗糖溶液，將PNS中蔗糖濃度調整為40.6%。將2.4 mL上述蔗糖濃度為40.6%的PNS溶液置于13.8 mL超速離心管底層，在上面緩慢加入4.8 mL 35%蔗糖溶液，再上一層為1.5 mL 25%蔗糖溶液，最上一層為1 mL Homogenization buffer。另一個離心管中以同樣方式加入DMSO處理的細胞樣品，兩個離心管配平后在超速離心機中以4℃、100 000×g離心1 h。離心結束后從上至下取出10層溶液置于離心管中，凍存于-80℃。

1.4.2 蔗糖密度梯度離心分層結果鑒定 從蔗糖密度梯度離心收取的各層溶液中取出80 μL溶液，加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，混勻后沸水煮10 min，進行Western blot試驗。使用的抗體為針對早期內體（Endosome）標志物的Anti-Rab5抗體和針對細胞質標志物的 Anti-actin抗體。

1.4.3 蔗糖密度梯度離心分層樣品脫糖及cDNA樣品制備 取實驗1.4.1蔗糖密度梯度離心各層樣品各500 μL置于無RNA酶的離心管中，在其中加入1 mL無水乙醇，混勻后置于-40℃過夜，4℃、12 000×g離心20 min。棄去上清并將離心管液體全部吸干，加入500μL DEPC水溶解即為脫糖樣品，提取脫糖樣品RNA，并反轉錄為cDNA。

1.4.4 絕對熒光定量標準曲線繪制 根據Herts/33病毒 P基因核苷酸序列，設計并合成1對特異性熒光定量PCR引物。Herts/33-F：5'-ATTTCAGGT CCCGGAGATCC-3'；Herts/33-R：5'-GAGGTG ATCAATGCACGGAC-3'。以Herts/33 P基因質粒作為標準品，根據其濃度和質粒片段長度計算拷貝數(shù)/μL。將該質粒進行稀釋后作為熒光定量PCR反應的模板。將Herts/33病毒P基因質粒稀釋成8個稀釋度，作為模板進行Real-time PCR，其PCR反應程序：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)后，以DNA拷貝數(shù)的對數(shù)即log（DNA copies）為橫坐標，以Ct值為縱坐標，繪制標準曲線圖，并得出標準曲線方程。

1.4.5 Real-time PCR法檢測蔗糖密度梯度離心各層樣品 采用試驗1.4.4中相同的Real-time PCR反應程序，對蔗糖密度梯度離心后各層樣品cDNA進行Real-time PCR試驗，多次檢測后取Ct值的平均值，帶入標準曲線方程以計算蔗糖密度梯度離心分離各層樣品中Herts/33病毒P基因的表達情況。

2 結果

2.1 泛素-蛋白酶體參與到NDV增殖的早期階段

我們通過將蛋白酶體抑制劑MG-132的分階段加入結合細胞上清病毒滴度檢測試驗來確定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV感染周期的關鍵性階段，可以從圖1看出當全程使用MG-132時，細胞上清的病毒滴度一直都較低。在0～6 h階段，病毒處在早期增殖階段，每個處理組的病毒滴度都較低，而從6 h開始病毒逐漸增殖，上清中病毒的滴度達到頂峰。在復制早期階段（0～6 h）時，c處理組（全程處理）和d處理組（0～6 h處理）的上清病毒滴度最低，而b處理組（2 h預處理）對病毒滴度的抑制作用幾乎沒有。在病毒增殖的中期和晚期，除了c處理組（全程處理）的病毒滴度受到抑制，其余處理組的病毒滴度與未使用MG-132的空白組幾乎一樣。由此初步證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV復制早期階段。

圖1 處理各個時間段細胞上清中的病毒滴度Fig.1 The virus titers of each time period in culture medium

2.2 蛋白酶K工作濃度確定

DF1細胞感染1 MOI病毒后，立即置于4℃讓病毒吸附15 min后用PBS洗去未吸附的病毒，將一組細胞繼續(xù)置于4℃，只吸附而沒有或極少病毒可以入侵；另一組細胞轉移至37℃培養(yǎng)箱，使已吸附的病毒粒子可以侵入細胞；最后兩組細胞分別用12種不同濃度的蛋白酶K處理5 min，洗去未入侵的病毒，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后檢測上清TCID50值。試驗過程中發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍酌窴濃度大于0.5 μg/mL時，處理5 min后細胞出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，說明蛋白酶K濃度過大。而當濃度為0.25 μg/mL、0.2 μg/mL或0.1 μg/mL時，無論細胞是否有37℃的入侵階段，病毒滴度都不發(fā)生改變，說明蛋白酶K的濃度過低，未能洗去未入侵的病毒。而當?shù)鞍酌窴濃度為0.5 μg/mL時，一直置于4℃培養(yǎng)的細胞上清病毒滴度比轉移至37℃培養(yǎng)的細胞上清滴度要低100.56，說明0.5 μg/mL蛋白酶K處理5 min，可以洗去吸附于細胞膜表面的病毒。由此，最終確定蛋白酶K 的工作濃度為0.5 μg/mL。

2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)未參與NDV入侵

用10 μmol/mL的MG-132和相同稀釋度的DMSO分別預處理細胞2 h后，感染1 MOI Herts/33病毒并先置于4℃使病毒吸附15 min，用PBS洗去細胞表面未吸附的病毒后，分為兩組，一組繼續(xù)置于4℃、15 min，另一組置于37℃入侵15 min。以0.5 μg/mL蛋白酶K作用5 min處理未入侵病毒后，用PBS漂洗3次，以去除殘留的蛋白酶K，換上維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，檢測細胞上清TCID50。結果顯示，當將細胞一直置于4℃時，MG-132處理組病毒滴度為103.67/0.1 mL，DMSO組的病毒滴度為103.72/0.1 mL；當細胞先置于4℃，后置于37℃，使病毒入侵時，MG-132處理組病毒滴度為104.1/0.1 mL，DMSO組的滴度為103.96/0.1 mL。以上結果暗示，無論病毒入侵細胞的階段存在與否，蛋白酶體抑制劑MG-132對NDV的入侵沒有影響（圖2）。

圖2 蛋白酶體抑制劑MG-132對病毒入侵的影響Fig.2 Effect of proteasome inhibitor MG-132 on NDV internalization

以相同的試驗方法，使用MG-132和肝素鈉這2個藥物，肝素鈉可以阻斷病毒粒子吸附細胞作為陽性對照藥物，空白細胞組的TCID50為104.25/0.1 mL，MG-132處理組的病毒滴度為104.25/0.1 mL，而肝素鈉處理組的病毒滴度為103.8/0.1 mL。發(fā)現(xiàn)使用蛋白酶體抑制劑MG-132對病毒入侵無影響，而使用肝素鈉的細胞，因阻止病毒吸附進而影響入侵細胞的病毒粒子數(shù)，最終導致細胞上清中病毒滴度降低。由此，進一步證實泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV感染的早期階段，雖然不參與入侵階段，但是參與NDV入侵細胞之后的早期復制階段（圖3）。

圖3 蛋白酶體抑制劑MG-132和肝素鈉對病毒入侵的影響Fig.3 Effect of proteasome inhibitor MG-132 and Heparin on virus internalization

2.4 蔗糖密度梯度離心后分層結果

我們用MG-132和DMSO分別作用于HeLa細胞，預處理2 h后，感染1 MOI Herts/33病毒后，繼續(xù)用MG-132和DMSO處理細胞3 h。處理細胞后進行蔗糖密度梯度離心，離心結束后從上至下逐層取出1～-10層。使用針對早期內體標志物的抗體anti-Rab5進行Western blot試驗，結果表明，該蔗糖密度梯度離心法將內體主要分離至8～-10層（圖4）。

圖4 蔗糖密度梯度離心分層鑒定Fig.4 Identification of the samples of sucrose density gradient centrifugation

2.5 Real-time PCR標準曲線繪制

所制備的Herts/33病毒P基因標準品質粒濃度為378.8 ng/μL，質粒大小為1200 bp，換算成拷貝數(shù)為2.881×1014copies/μL。將該標準品質粒從5-5～5-12稀釋成8個稀釋度，取每個稀釋度質粒2μL作為模板進行Real-time PCR，在多次試驗確定最終反應條件之后，同時進行重復性試驗。在這個稀釋范圍內，線性關系良好，以DNA拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以平均Ct值為縱坐標，繪制標準曲線圖，并得出標準曲線方程Y=-3.3024X+47.4777，R2為0.9996（圖5）。

圖5 Herts/33病毒P基因質粒標準曲線Fig.5 Standard curve of Herts/33 P gene

2.6 蛋白酶體抑制劑對NDV入侵細胞后在細胞內分布的影響

我們將蔗糖密度梯度離心后各層樣品提取RNA并反轉錄為cDNA，作為Real-time PCR反應的模板，檢測使用蛋白酶體抑制劑MG-132和使用相同稀釋度DMSO處理細胞中病毒分布情況的差異。將多次檢測結果Ct值取平均值后帶入標準曲線，計算每層樣品中Herts/33病毒P基因的拷貝數(shù)。發(fā)現(xiàn)當使用蛋白酶體抑制劑MG-132后，第8、9、10層中病毒含量比不使用該抑制劑對照組中病毒含量高，且差異顯著（圖6），而根據Western blot實驗結果顯示，第8、9、10層為內體所在的層，我們推測當使用蛋白酶體抑制劑后，NDV有可能會被滯留于內體。

圖6 蛋白酶體抑制劑MG-132導致NDV滯留于內體Fig.6 The proteasome inhibitor MG-132 retained the NDV in the endosomes

3 討論

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中發(fā)揮降解蛋白質功能的26S蛋白酶體，由一個催化核心即20S蛋白酶體分子和位于兩端的兩個19S調節(jié)復合體組成。MG-132是一種肽醛類20S蛋白酶體活性抑制劑，它通過與20S蛋白酶體的β內環(huán)上活性位點的蘇氨酸氨基端羥基形成共價半縮醛鍵而抑制其蛋白水解活性，是一種常用的泛素-蛋白酶體抑制劑[9]。已經有文獻報道泛素-蛋白酶體參與到新城疫病毒的復制，但該系統(tǒng)參與到新城疫病毒復制的具體階段卻還不清楚，所以在本實驗中，我們使用MG-132階段性加入，結合NDV感染實驗，來確定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV感染的何種階段，結果顯示，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV感染早期階段（0～6 h）。

為了進一步確定泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是參與到NDV入侵細胞的階段還是入侵之后的早期復制階段，我們設計實驗利用蛋白酶K處理吸附于細胞表面但還未入侵的病毒粒子。發(fā)現(xiàn)無論是否使用蛋白酶體抑制劑MG-132，NDV在只有吸附過程或同時具有37℃入侵階段時，病毒的增殖都未受到MG-B2的影響，這就說明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)并未參與NDV入侵細胞的過程。再結合上述MG-132階段性加入的試驗結果，我們得出一個初步的結論，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與到NDV進入細胞后早期復制階段。

早期內體一般是內吞途徑中用于運輸內吞物質的囊性小泡，將內吞物質從細胞膜表面運送至晚期內體和溶酶體之中[10]。副粘病毒屬需要通過識別細胞上受體蛋白，繼而病毒囊膜與細胞受體膜發(fā)生融合才能引起病毒感染。在膜融合的過程中，F(xiàn)蛋白在內體酸性環(huán)境中發(fā)生構象轉變是至關重要的一步[11]。NDV通過內吞途徑進入細胞后，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是否參與到NDV進入內體，并從內體釋放的過程是我們關心的。

為了驗證這一假設，我們采用蔗糖密度梯度離心的方法分離細胞內體，根據相關文獻的報道，我們將細胞樣品制備成含有40.6%的蔗糖溶液，置于離心管最底層，離心時內體逐漸上浮，達到特定蔗糖密度的所在層。Rab5、Rab7、Rab9和Rab11都是比較好的早期內體的標志物，在我們的試驗中采用anti-Rab5抗體用于檢測是否分離到內體，并確定內體分離至8、9、10這三層。我們先制備Herts/33株NDV P基因質粒標準品，以此標準品做模板繪制絕對熒光定量標準曲線。再根據Western blot實驗結果，將蔗糖密度梯度離心樣品進行脫糖，并提取總RNA。反轉錄為cDNA當做模板進行絕對熒光定量PCR試驗。將各層樣品中檢測數(shù)值帶入標準曲線，計算每層樣品P基因表達拷貝數(shù)，結果顯示在蔗糖密度梯度離心所分離的8、9、10層中，MG-132處理的細胞中NDV含量比DMSO處理的細胞要高。從這一試驗的結果，我們推測，蛋白酶體抑制劑的加入很有可能將NDV滯留于內體中，阻止其從內體釋放出來，進而阻止其基因組RNA的復制。總之，本研究初步證明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與NDV入侵細胞后復制早期從內體釋放出來的過程。

參考文獻

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THE UBIQUITIN-PROTEASOME SYSTEM PARTICIPATES IN THE EARLY STAGE OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS REPLICATION

QU Yu-rong, ZHAN Yuan, QIU Xu-sheng, TAN Lei, SUN Ying-jie, SONG Cui-ping, MENG Chun-chun,DING Chan
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The proteasome system inhibitor MG-132 together with the protease K were used to study the role of ubiquitin-proteasome system (UPS) in the specific replication stage of Newcastle disease virus (NDV) in host cells. The results showed that the ubiquitin-proteasome system did not participate in the NDV invasion stage but was involved in the early stage of replication (0-6 h) after the invasion of the cells. The intracellular endosomes were isolated at 8-10 layers using sucrose density gradient centrifugation assay and confirmed using antibodies against the endosome marker protein Rab5. The absolute fluorescence quantitative method for detecting the P gene of Herts / 33 strain was developed to detect the viruses in endosomes from MG-132 treated cells and DMSO treated cells. It concluded that the MG-132 treated cells had higher viral content in the endosomes, suggesting that ubiquitin-proteasome system inhibited NDV release from endosomes.

Ubiquitin-proteasome system; Newcastle disease virus; MG-132; endosome

2017-05-19

國家自然科學基金（31372421、31530074 ）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303033）

曲昱蓉，女，博士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn

S852.659.5

A

1674-6422（2017）06-0001-07