劉珊珊，張國勝，潘靜

（1.濰坊護理職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濰坊 262500）

長鏈非編碼RNA-尿路上皮癌相關(guān)分子1在宮頸癌中的表達及臨床意義

劉珊珊1，張國勝1，潘靜2

（1.濰坊護理職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 262500；2.山東省濰坊市益都中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濰坊 262500）

目的檢測長鏈非編碼RNA（lncRNA）-尿路上皮癌相關(guān)分子（UCA1）在宮頸癌組織中的表達，探討UCA1與宮頸癌臨床病理特征、術(shù)后生存率及預(yù)后間的關(guān)系。方法利用lncRNA芯片篩選宮頸癌及癌旁組織中差異表達的lncRNAs；利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測宮頸癌組織及配對癌旁組織中UCA1的表達；利用Spearman秩相關(guān)分析UCA1與宮頸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系；利用生存分析曲線UCA1與宮頸癌患者術(shù)后5年生存率的關(guān)系；利用Cox風(fēng)險比例模型分析UCA1與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果UCA1在宮頸癌表達水平高于癌旁組織；UCA1的表達與宮頸癌FIGO分期相關(guān)（P=0.015）；UCA1高表達的宮頸癌患者術(shù)后5年生存率低于低表達的患者，UCA1表達及FIGO分期為宮頸癌患者獨立的預(yù)后指標。結(jié)論UCA1在宮頸癌中表達升高，并與宮頸癌患者生存及預(yù)后密切相關(guān)。

尿路上皮癌相關(guān)分子；宮頸癌；預(yù)后；生存

全球每年因?qū)m頸癌而死亡的患者數(shù)高達53萬， 死亡人數(shù)位居婦科腫瘤的第2位[1]。放射治療、化學(xué)治療和根治性切除術(shù)已成為了宮頸癌的標準化治療方案[2]。然而，宮頸癌患者術(shù)后預(yù)后差異仍非常顯著，且臨床上缺乏有效的判斷患者預(yù)后的分子標志物。因此，更深入的理解宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制、鑒定有效的治療靶點及預(yù)后判斷分子標志物對宮頸癌患者的個體化治療及提高整體生存率意義重大。

隨著基因芯片及基因測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的非編碼RNA已被證實在疾病的診斷及治療中具有重要的作用。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在過去被認為是基因組RNA中的“轉(zhuǎn)錄噪聲”，近年來也被證實，可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達[3]。H19[4]、MALAT1[5]和HOTAIR[6]也被證實在中的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。有研究報道，TUG1[7]、MEG3[8]和ANRIL等[9]lncRNAs可促進宮頸癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移。然而，尿路上皮癌相關(guān)分子1（urothelial can cer associated 1，UCA1）在宮頸癌中表達及臨床相關(guān)性尚無研究報道。本研究通過基因芯片篩選出UCA1在宮頸癌組織中表達上調(diào)，并證實UCA1的表達與宮頸癌患者生存及預(yù)后密切相關(guān)。本研究有助于鑒定新的宮頸癌治療分子靶點及預(yù)后判斷標志物。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床標本選取2007年12月-2010年12月于本研究所用宮頸癌組織及癌旁組織，入組患者在濰坊市益都中心醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為宮頸癌并行根治性切除術(shù)。同一患者腫瘤組織及配對癌旁組織切除后，立刻儲存于液氮之中，備后續(xù)實驗使用。所有入組患者均親自簽署知情同意書，同意其標本用于本項研究?；颊呷虢M前均未接受放化療，且無其他器官重大疾病史。術(shù)后生存資料采用電話方式進行回訪，回訪時間以患者死亡或本研究截止之日。

1.1.2 實驗試劑和儀器RNA提取試劑RNAiso reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（購自日本TaKaRa公司）。宮頸癌組織及癌旁組織間lncRNA表達譜差異委托上海伯豪公司行l(wèi)ncRNA芯片檢測。4℃高速離心機（購自德國Eppendorf公司），置入-80℃冰箱冷凍保存（購自青島海爾公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取研磨組織至粉末狀，加入適量的RNAiso reagent，再研磨直至裂解液呈透明狀，將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管，12 000 r/min，4℃離心5 min。向上清液中加入1/5體積RNAiso reagent的氯仿，震蕩至溶液呈乳白狀，再次12 000 r/min，4℃離心15 min。離心后溶液分為3層，即無色的上清液、中間白色蛋白層及下層有機層。吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入等體積異丙醇，12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清液，加入500μl 75%的乙醇，再次12000r/min，4℃離心5 min。所得沉淀即為RNA，加入200 μl去離子水，置入-80℃冰箱冷凍儲存。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄取總 RNA 2 μl，加入10 mmol/L dNTP，Oligo（dT）（0.5 μg/μl）各 1 μl。70℃ 5 min，冰上放置2 min。加入 10×Buffer 2μl，RNase抑制劑 1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μl?；靹蚝?42℃ 60 min，80℃5 min。所得產(chǎn)物即為cDNA模板。

1.2.3 qRT-PCR加入 125 μl的 20×SYBR溶液至1.0 ml 2.5×Real Master Mix中，所得溶液作為試劑A。實驗采用20 μl體系，內(nèi)還有9 μl試劑A，1 μl 20×ROX Reference Dye，1μl正向引物，1 μl反向引物，cDNA 模板 2 μl，6 μl去離子水。qRT-PCR 的反應(yīng)條件 為：95℃ 2 min；95℃ 20 s，60℃ 20s，72℃ 30s，共循環(huán)35個。UCA1正向引物：5'-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3'；反向引物：5'-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3'；U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACG CTTCACGAAYYYGCGT-3'。計算公式為：UCA1相對表達量：2-ΔΔCt=2-[（CtUCA1-CtU6）待測樣本-（CtUCA1-CtU6）校準樣本]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，采用配對設(shè)計的t檢驗分析宮頸癌組織與癌旁組織間UCA1的表達水平差異，采用Spearman秩相關(guān)分析UCA1表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗分析UCA1表達水平與宮頸癌患者生存周期間的關(guān)系，采用Cox風(fēng)險比例模型分析UCA1的表達水平與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，檢驗水準α入=0.050，α出=0.100，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌及癌旁組織中差異表達的lncRNAs

提取5例宮頸癌及同一患者配對癌旁組織標本的RNA，利用LncRNA芯片檢測在宮頸癌組織及癌旁組織中差異表達的lncRNAs。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，在宮頸癌中有21個上調(diào)、63個下調(diào)的lncRNA。取上調(diào)和下調(diào)的30個lncRNAs制備熱圖，結(jié)果顯示UCA1在宮頸癌組織中表達上調(diào)，而在癌旁組織中表達下調(diào)（見圖1），提示UCA1可能參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控。

圖1 宮頸癌組織及癌旁組織中差異表達的lncRNAs

2.2 UCA1在宮頸癌和癌旁組織中的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，71例癌旁組織中UCA1的相對表達量為（0.914±0.751），71例宮頸癌組織中UCA1的相對表達量為（6.137±2.984），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.194，P=0.015），見圖 2。宮頸癌組織中UCA1的表達水平高于癌旁組織。

圖2 宮頸癌組織及癌旁組織中UCA1的相對表達水平

2.3 UCA1與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)宮頸癌組織中UCA1表達的均數(shù)6.137，將UCA1表達水平高于6.137的患者作為UCA1高表達組，將UCA1表達水平低于6.137的患者作為UCA1低表達組，利用Speraman秩相關(guān)分析UCA1表達水平與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，UCA1的表達水平與宮頸癌FIGO分期密切相關(guān)，隨著FIGO分期的進展，UCA1的表達逐漸升高（r=0.614，P=0.015），見表1。而UCA1表達水平與宮頸癌的其他臨床病理特征，包括年齡、HPV狀態(tài)、腫瘤類型及組織分化程度均無相關(guān)性（見表1）。提示UCA1的表達與宮頸癌的病情進展呈正相關(guān)。

表1 UCA1的表達與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 UCA1與宮頸癌術(shù)后5年生存率的關(guān)系

生存曲線結(jié)果顯示，UCA1的表達與宮頸癌患者術(shù)后5年總體生存率（Log-rank檢驗：P=0.008，見圖3A）及無進展生存率（Log-rank檢驗：P=0.021，見圖3B）密切相關(guān)，UCA1高表達組的宮頸癌患者術(shù)后5年生存率及無進展生存率低于UCA1低表達組。

2.5 UCA1與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

Cox風(fēng)險比例模型多因素分析結(jié)果顯示，UCA1高表達組宮頸癌患者術(shù)后總體生存風(fēng)險系數(shù)為3.791（95%CI：1.984，10.314，P=0.019），UCA1 高表達組宮頸癌患者術(shù)后無進展生存風(fēng)險系數(shù)為2.715（95%CI：1.613，5.187，P=0.032）。UCA1 為宮頸癌患者術(shù)后總體生存預(yù)后及無進展生存預(yù)后的獨立預(yù)測指標。此外，F(xiàn)IGO分期也被證實為宮頸癌患者術(shù)后總體生存預(yù)后（＾HR=4.185，95%CI：2.145，13.314，P=0.008）及無進展生存預(yù)后（＾HR=5.134，95%CI：2.114，7.875，P=0.011）的獨立預(yù)測指標。而其他病理特征與宮頸癌患者術(shù)后預(yù)后無關(guān)。見表2、3。

圖3 UCA1的表達與宮頸癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系

表2 UCA1的表達與宮頸癌術(shù)后總體生存預(yù)后的關(guān)系

表3 UCA1的表達與宮頸癌術(shù)后無進展生存預(yù)后的關(guān)系

3 討論

LncRNA為近年來的研究熱點，一系列研究結(jié)果表明lncRNA的表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。與編碼蛋白的mRNA不同，大多數(shù)lncRNAs的表達具有極高的組織特異性。YANG等的研究顯示，lncRNA PVT1在宮頸癌患者血清中表達異常升高，并與患者的腫瘤體積及臨床分期密切相關(guān)，且可作為宮頸癌早期診斷的分子標志物[10]。CAO等的研究顯示，lncRNA-SPRY4-IT1在宮頸癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且可作為判斷宮頸癌患者生存及預(yù)后的獨立分子標志物[11]。lncRNA在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，然而，僅僅少數(shù)的lncRNAs得到較為充分的研究，大多數(shù)lncRNAs在宮頸癌中的表達及功能尚未得到充分研究。

通過lncRNA芯片篩選宮頸癌組織及癌旁組織中差異表達的lncRNAs，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-UCA1在宮頸癌組織中的表達高于癌旁組織，根據(jù)宮頸癌中UCA1的表達水平將患者分為UCA1高表達組及低表達組，結(jié)果顯示UCA1的表達與宮頸癌FIGO分期密切相關(guān)，UCA1高表達的宮頸癌患者術(shù)后5年生存率高于低表達的患者，UCA1表達及FIGO分期為宮頸癌患者獨立的預(yù)后判斷指標。UCA1在胰腺癌[12]、結(jié)腸癌[13]及腦膠質(zhì)瘤[14]多種腫瘤中已證實發(fā)揮重要的作用。NI等的研究顯示，UCA1在結(jié)腸癌中表達上調(diào)，并與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān)，并可作為結(jié)腸癌獨立的判斷預(yù)后的分子標志物[15]。FANG等的研究顯示，UCA1在口腔鱗狀細胞癌中表達上調(diào)，此外，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的組織中UCA1的表達要高于原位腫瘤患者[16]。與既往研究結(jié)果相符，筆者的研究也證實UCA1在宮頸癌中可能作為癌基因發(fā)揮作用，并與腫瘤的分期密切相關(guān)。

近年來，有研究認為UCA1可作為調(diào)控不同信號通路中關(guān)鍵分子而參與腫瘤的發(fā)生及進展。YANG等的研究顯示，UCA1可通過PI3K/AKT而調(diào)控CRBE的表達，進而調(diào)控膀胱癌細胞周期[17]。另有研究報道，UCA1可通過 mTOR-STAT3/miR-143-HK2途徑而調(diào)控膀胱癌腫瘤細胞的葡萄糖代謝水平[18]。此外，研究顯示在膀胱癌中miR-1可調(diào)控UCA1的表達[19]，提示microRNA和lncRNA間有著復(fù)雜的調(diào)控機制。因此，后續(xù)研究有必要進一步深入研究UCA1在腫瘤中扮演癌基因的分子機制。

本研究通過lncRNA芯片及qRT-PCR技術(shù)篩選并證實長鏈非編碼RNA-UCA1在宮頸癌組織中表達上調(diào)，并與宮頸癌患者的FIGO分期密切相關(guān)。更為重要的是，研究發(fā)現(xiàn)UCA1可作為判斷宮頸癌患者生存及預(yù)后的分子標志物。本研究結(jié)果為鑒定宮頸癌診斷及治療的分子靶點奠定必要的基礎(chǔ)。

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Significance of long non-coding RNA urothelial cancer associated 1 in cervical cancer

Shan-shan Liu1,Guo-sheng Zhang1,Jing Pan2
(1.Weifang Nursing Vocational College,Weifang,Shandong 262500,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Yidu Central Hospital of Weifang,Weifang,Shandong 262500,China)

ObjectiveTo investigate the expression level of long non-coding RNA (lncRNA)urothelial cancer associated 1 (UCA1)in cervical cancer,and evaluate its prognostic value in cervical cancer.MethodsCancer tissue as well as adjacent normal tissue from patients diagnosed with cervical cancer were harvested in this study.LncRNA arrays were performed to identify differentially expressed lncRNAs.Expression of UCA1 was measured by qRT-PCR.Spearman rank correlation analysis was performed to evaluate the association between UCA1 and clinical manifestation of cervical cancer patients.K-M survival analysis was utilized to determine correlation of UCA1 expression with 5-year survival.Cox's proportional hazards regression models were applied to analyze the relationships between UCA1 and prognosis of cervical cancer patients.ResultsUCA1 was upregulated in cervical cancer tissues compared with normal tissues.Expression of UCA1 was closely associated with FIGO stage of cervical cancer (P=0.015).Expression of UCA1 was negatively correlated with 5-years survival rate.UCA1 and FIGO stage were independent prognostic risk factor of cervical cancer.ConclusionUCA1 is upregulated in cervical cancer,and is negatively associated with outcome of cervical cancer.

UCA1;cervical cancer;prognosis;survival

R737.33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.009

1005-8982（2017）30-0051-05

2017-05-23

（王榮兵 編輯）