劉國棟+王芙蓉+張傳云+陳煜+張景霞+杜召海+張軍

摘要：本研究以12份棉花品種為材料，用三對多態(tài)性豐富的SSR引物對變性和非變性PAGE檢測法進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，兩種檢測方法鑒定單株個(gè)體基因型的類型一致；變性PAGE檢測法檢測結(jié)果清晰，但操作過程繁瑣；非變性PAGE檢測法操作相對簡單、檢測通量高，更適用于材料的高通量檢測分析。

關(guān)鍵詞：棉花；SSR；聚丙烯酰胺凝膠電泳；銀染

中圖分類號：S562文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2017）11-0131-03

Comparison of Denatured and Non-Denatured

PAGE Detection Method on Cotton SSR Markers

Liu Guodong， Wang Furong， Zhang Chuanyun， Chen Yu， Zhang Jingxia， Du Zhaohai， Zhang Jun

（Cotton Research Center of Shandong， Jinan 250100，China）

AbstractThree SSR primer pairs with high polymorphism and 12 cotton varieties were used to comparatively analyze the denatured and non-denatured PAGE detection methods. The results indicated that the type of individual genotype which was identified by the two detection methods was consistent. The testing results of denatured PAGE were more clear， but its operation process was complex. The operation process of non-denatured PAGE was simple and it had high test flux， which was more suitable for high throughput detection analysis.

KeywordsCotton； SSR； PAGE； Silver staining

SSR（Simple Sequence Repeat）又稱簡單序列重復(fù)，均勻地分布在整個(gè)真核生物基因組中，具有共顯性、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建DNA指紋圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的理想工具。SSR標(biāo)記技術(shù)是目前最為成熟的DNA檢測技術(shù)，具有靈活、簡便、成本低的優(yōu)勢。目前，最常用的SSR檢測方法主要是變性PAGE銀染檢測法和非變性PAGE銀染檢測法。變性和非變性PAGE檢測法在檢測微衛(wèi)星產(chǎn)物方面各有優(yōu)劣，許多學(xué)者在比較兩種檢測方法時(shí)都發(fā)現(xiàn)在非變性膠中存在較多非特異性條帶[1-4]。但兩種檢測方法有何異同點(diǎn)和選擇何種方法進(jìn)行SSR分子檢測效果更好等問題一直是困擾分子標(biāo)記檢測研究者的主要問題。本試驗(yàn)選用12個(gè)棉花品種及三對多態(tài)性豐富的SSR引物，對變性與非變性PAGE銀染檢測法進(jìn)行比較分析，為合理有效利用兩種電泳檢測方法提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用12個(gè)棉花品種為山東省區(qū)試棉花品種。選用三對多態(tài)性豐富的SSR引物（NAU1102、NAU3254和NAU3995）進(jìn)行棉花品種的分子標(biāo)記基因型分析，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取將單粒棉種浸泡至種皮松軟后剝掉種皮，放入2 mL離心管中，加入700 μL裂解緩沖液（成分：2% CTAB，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，2% PVP，1% β-巰基乙醇）研磨。65℃水浴20 min，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），混勻至不分層，12 000 r/min離心8 min，取上清，重復(fù)抽提一次取上清，加入0.7倍體積異丙醇，混勻至DNA成團(tuán)析出，70%乙醇洗滌DNA沉淀1次，無水乙醇洗滌1次，晾干后加入200 μL雙蒸水，待充分溶解后備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10 μL反應(yīng)液中包括10×PCR buffer 1.0 μL， 10 mmol/L dNTP Mix 0.2 μL，正、反向Primer（10 μmol/L）各0.6 μL， 5 U Taq DNA聚合酶 0.1 μL， DNA（20～200 ng/μL）2 μL，ddH2O 5.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，1個(gè)循環(huán)；4℃保存。

1.2.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測變性PAGE銀染檢測法。電泳：PCR產(chǎn)物95℃變性5 min， 4℃保溫10 min， 然后在6%變性膠上分離。預(yù)電泳90 W，20 min，用移液器吹吸加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)，梳齒朝內(nèi)插入梳子形成加樣孔。每孔加樣5 mL，90 W恒功率電泳至指示帶（二甲苯氰）到達(dá)膠板的中部，電泳結(jié)束。采用的銀染方法：固定液（10%無水乙醇+0.5%冰醋酸）中輕輕晃動(dòng)5 min；染色液（0.2% AgNO3溶液）中搖動(dòng)染色8～10 min；dH2O中搖動(dòng)30 s；顯影液（3% NaOH+0.5%甲醛）中搖動(dòng)至顯示出清晰的條帶；10%冰醋酸溶液中定影5 min。

非變性PAGE銀染檢測法。電泳：預(yù)電泳80 W，20 min，每孔加樣1.2 μL， 80 W恒功率電泳至指示帶（二甲苯氰）到達(dá)膠板的下部，電泳結(jié)束。采用的銀染方法：0.1wt%的AgNO3溶液中染色8～10 min；dH2O快速漂洗1次，不超過10 s；2wt% NaOH和0.4wt%甲醛的水溶液中顯影至帶型清晰；10%冰醋酸溶液中定影5 min。

2結(jié)果與分析

2.1兩種方法檢測結(jié)果的比較

利用三對多態(tài)性豐富的SSR引物（NAU1102、NAU3254和NAU3995）對12個(gè)棉花品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別在6%聚丙烯酰胺變性凝膠和8%聚丙烯酰胺非變性凝膠上分離PCR產(chǎn)物，結(jié)果在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠中均能檢測出目的片段（圖1、2和圖3）。圖1顯示，引物NAU1102的PCR產(chǎn)物在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠中均檢測到3種帶型；圖2顯示，引物NAU3254的PCR產(chǎn)物在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠中也均檢測到3種帶型；圖3顯示，引物NAU3995的PCR產(chǎn)物在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠中均能檢測到5種帶型。三對SSR引物的檢測結(jié)果在變性膠中都只有目的條帶，而且?guī)颓逦子阼b定；在非變性膠中除目的條帶外，還有較多的非特異性條帶，而且目的條帶帶型和非特異性條帶帶型能一一對應(yīng)。由此可見，變性和非變性PAGE檢測法在鑒定個(gè)體基因型方面檢測結(jié)果無差異。

2.2兩種方法工作效率的比較

由表1可知，變性PAGE檢測法操作過程復(fù)雜，在膠板制備時(shí)需要對玻璃板進(jìn)行預(yù)處理，背板和面板分別需用剝離硅烷和親和硅烷擦拭兩次，然后灌膠，最后組裝膠板；電泳時(shí)需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性處理；染色時(shí)，由于變性PAGE電泳的凝膠極薄，需要粘附在膠板上進(jìn)行染色，因此檢測成本較高、檢測通量較低；整個(gè)檢測過程約需3.5 h，工作效率不高。非變性PAGE檢測法操作過程相對簡單，在膠板制備時(shí)無需對膠板進(jìn)行預(yù)處理，直接組裝玻璃板、灌膠；電泳時(shí)無需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性處理；染色時(shí)，直接對非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色，而且省略了固定步驟，檢測通量高；整個(gè)檢測過程僅需1.5 h，工作效率大大提高?？傊跈z測效率方面，非變性PAGE銀染檢測法操作簡單、污染小、成本低，非常適合用于分子標(biāo)記基因型的高通量檢測。

表1變性和非變性PAGE檢測法比較方法制備膠板電泳染色用時(shí)（h）變性PAGE檢測法需預(yù)處理需預(yù)處理3個(gè)步驟約3.5非變性PAGE檢測法不需要預(yù)處理不需要預(yù)處理2個(gè)步驟約1.5

3討論與結(jié)論

本研究通過比較12個(gè)棉花品種的PCR擴(kuò)增結(jié)果在變性和非變性聚丙烯酰胺凝膠上的帶型表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)變性PAGE檢測法和非變性PAGE檢測法的分辨率無明顯差異；非變性聚丙烯酰胺凝膠中雖然有非特異性條帶，但在檢測分子標(biāo)記基因型方面兩種檢測方法無差異；在檢測效率方面兩種檢測方法差異明顯。究其原因有以下幾個(gè)方面。①聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍與其濃度相關(guān)，兩種檢測方法均采用聚丙烯酰胺凝膠，且二者濃度差異不大，因此分辨率差異不明顯。②非變性聚丙烯酰胺凝膠用于分離雙鏈DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在復(fù)性過程中除了形成由特異擴(kuò)增產(chǎn)物組成的正常雙鏈外，有些SSR引物位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物還會(huì)形成異源雙鏈，異源雙鏈由于空間構(gòu)象的影響，遷移率較低，形成非目的條帶。王曉通等[5]通過對非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中與雜合子相伴產(chǎn)生的非目的條帶的鑒定分析證明了非目的條帶不是非特異性擴(kuò)增的結(jié)果，而是在復(fù)性過程中形成的異源雙鏈。變性聚丙烯酰胺凝膠在配制和加樣過程中加入了變性劑，在變性聚丙烯酰胺凝膠中，目的條帶以特異性擴(kuò)增序列的單鏈形式存在，其遷移速率不受堿基組成及序列構(gòu)象的影響，因此，變性PAGE檢測法鑒定的目的條帶比較清晰。③變性PAGE檢測法需要對膠板和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行前期處理，因此檢測效率不及非變性PAGE檢測法。

綜合比較兩種檢測方法，結(jié)果表明，兩種檢測法均能檢測出目的片段，但變性PAGE檢測法操作過程繁瑣、成本高、耗時(shí)耗力、效率低；非變性PAGE檢測法經(jīng)濟(jì)快速，非常適合進(jìn)行分子標(biāo)記基因型的高通量檢測，如品種的純度鑒定、分子遺傳多樣性研究等。

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收稿日期：2017-04-05