孫金鳳，田康明，沈微，陳獻(xiàn)忠，王正祥*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)3(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安，223003)

大腸桿菌不同菌株木糖代謝差異性的遺傳本質(zhì)

孫金鳳1,3，田康明2，沈微1，陳獻(xiàn)忠1，王正祥2*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津，300457)3(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安，223003)

在木糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，不同大腸桿菌菌株的生長速率存在較大差異。在緩慢生長菌株EscherichiacoliB0013和E.coliB2198中表達(dá)快速生長菌株E.coliK12的木糖運(yùn)輸和分解代謝的2個(gè)操縱子(xylBA-xylFGH)，能夠顯著提高其利用木糖生長的速率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)表達(dá)木糖運(yùn)輸基因xylFGH即可以顯著提高菌株起始生長速率。對菌株K12、B0013和B2198的xylFGH基因序列進(jìn)行測定和分析比對，發(fā)現(xiàn)菌株B0013和B2198利用木糖生長緩慢是由于木糖運(yùn)輸載體基因發(fā)生無義突變而導(dǎo)致讀框中斷，B0013的xylH基因中TGG突變?yōu)門AG(Trp126*)，B2198的xylG基因中CGA突變?yōu)門GA(Arg241*)，木糖運(yùn)輸效率低下。在B0013中過量表達(dá)其自身的另一種木糖運(yùn)輸載體基因xylE或調(diào)控基因xylR，可以適當(dāng)提高其生長速率。但是木糖高效運(yùn)輸系統(tǒng)xylFGH缺陷而導(dǎo)致的生長緩慢表型，并不能夠僅僅通過表達(dá)低效運(yùn)輸載體基因xylE而顯著改善。對菌株B0013的xylH基因進(jìn)行回復(fù)突變，突變株恢復(fù)快速生長表型。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，xylH基因第126個(gè)密碼子因無義突變而形成的終止密碼TAG，重新回復(fù)為Trp密碼TGG。

大腸桿菌；木糖運(yùn)輸載體；生長差異分析；回復(fù)突變；遺傳本質(zhì)

木質(zhì)纖維素乙醇是有望替代化石能源的最具代表性的生物質(zhì)燃料。但是木質(zhì)纖維素水解液中組成糖類復(fù)雜，不僅含有己糖還有戊糖，主要是葡萄糖和木糖，其中木糖是自然界中除了葡萄糖之外含量第2的碳水化合物[1-2]。傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌種Saccharomycescerevisiae不能夠發(fā)酵木糖[3]，而Escherichiacoli作為轉(zhuǎn)化可再生的生物質(zhì)資源生產(chǎn)燃料和化學(xué)品的重要菌種，具有很多優(yōu)良特性，其中最令人感興趣的特性是其既能夠代謝己糖，也能代謝戊糖，但2者的代謝方式明顯不同[2]。

從E.coli中已經(jīng)純化并鑒定了2種D-木糖特異性運(yùn)輸系統(tǒng)，即親和力相對較低的D-木糖/H+同向運(yùn)輸載體XylE和高親和力的D-木糖運(yùn)輸載體XylFGH。木糖運(yùn)輸載體基因xylFGH和xylE受XylR的調(diào)控[2]。E.coli中木糖運(yùn)輸主要是通過高親和力載體xylFGH[4-5]，木糖運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞后，通過磷酸戊糖途徑進(jìn)行分解代謝。D-木糖首先由木糖異構(gòu)酶XylA催化，異構(gòu)化形成D-木酮糖，然后由木酮糖激酶XylB催化形成D-木酮糖-5-磷酸。編碼木糖分解代謝酶的基因xylAB和編碼運(yùn)輸載體的基因xylFGH在E.coli染色體上相鄰排列但讀框方向相反[6-7]。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1。所有培養(yǎng)物均以15%甘油管形式于-70 ℃保藏在中國高校工業(yè)微生物資源中心(http://CICIM-CU.jiangnan.edu.cn)。菌株E.coliK12由中心保藏；E.coliB0013、B2198由本研究前期篩選并保藏。培養(yǎng)物在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，必要時(shí)添加100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)或50 μg/mL卡那霉素(Km)。用于本研究基因克隆與表達(dá)的質(zhì)粒有pMD18T-simple、pTH18Kr和pTH18Ks1[10]。

1.2 分子克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化、PCR和克隆等通用操作參照分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行[11]。除非特別說明，所有PCR采用TaKaRa PrimerSTAR DNA polymerase(寶生物工程(大連)有限公司)。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

重組質(zhì)粒pTH-xylB-H的構(gòu)建。以E.coli不同菌株的染色體DNA為模板擴(kuò)增，以引物xylB-H1-p1和xylB-H1-p2擴(kuò)增木糖運(yùn)輸操縱子的DNA序列 (xylFGH)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物xylB-H1；以引物xylB-H2-p1和xylB-H2-p2擴(kuò)增木糖分解代謝操縱子序列(xylBA)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物xylB-H2。擴(kuò)增產(chǎn)物xylB-H1經(jīng)EcoRI和BamHI酶切，克隆入經(jīng)同樣酶切的載體pTH18Kr，得到pTH-xylB-H1。PCR產(chǎn)物xylB-H2直接克隆入pMD18T-simple中，得到pMD18T-xylB-H2。經(jīng)NcoI(NcoI位點(diǎn)位于xylG內(nèi)部)和BamHI酶切pMD18T-xylB-H2，分離xylB-H2′片段；將此片段連接到同樣經(jīng)NcoI和BamHI酶切的質(zhì)粒pTH-xylB-H1中，得到重組質(zhì)粒pTH-xylB-H，其含有完整的xylBA和xylFGH操縱子。

相似地，分別構(gòu)建含有xylFGH、xylBA、xylR、xylE基因的重組質(zhì)粒pTH-xylFGH、pTH-xylBA、pTH-xylR及pTH-xylE。

1.3 細(xì)胞增殖與碳源利用試驗(yàn)

從LB平板接種新鮮菌落到50 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后離心收集細(xì)胞，用M9培養(yǎng)基洗滌重懸，作為種子液。接種含有5 g/L木糖的100 mL改良M9培養(yǎng)基，使得初始OD600為0.1，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，定期取樣測定OD600。

M9基本培養(yǎng)基組成(1 L)：15.11 g Na2HPO4·12H2O, 3 g KH2PO4, 1 g NH4Cl, 0.5 g NaCl。進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，添加0.1 % MgSO4和0.1 %微量金屬離子儲(chǔ)備液，得到改良M9培養(yǎng)基。

(1)用Anycasting模擬仿真技術(shù)，對殼體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析．結(jié)合設(shè)計(jì)準(zhǔn)則及經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)出一種澆注系統(tǒng)，再對澆注系統(tǒng)進(jìn)行模擬并就模擬結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，以鑄件缺陷情況確定選擇最適合該殼體生產(chǎn)的澆注系統(tǒng)．

微量金屬離子儲(chǔ)備液組成(1 L)：2.4 g FeCl3·6H2O, 0.3 g CoCl2·6H2O, 0.15 g CuCl2·2H2O, 0.3 g ZnCl2, 0.3 g Na2MoO4·2H2O, 0.075 g H3BO3, 0.495 g MnCl2·4H2O[12]。

LB培養(yǎng)基和M9培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min備用。

微量金屬離子貯備液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用。500 g/L木糖貯備液在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。所有的培養(yǎng)試驗(yàn)是在500 mL搖瓶中進(jìn)行，平行測定3次。所有結(jié)果都是3次平行測定的平均值。

1.4 分析方法

采用UNICO UV2000分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)測定600 nm的吸光度值 (OD600, 1 cm光程) 監(jiān)控培養(yǎng)過程的細(xì)胞密度。吸光度值與細(xì)胞干重之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示：OD600為1.0相當(dāng)于0.38 g/L細(xì)胞干重(DCW)。培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長速率(dX/dt)與細(xì)胞濃度X呈正比，滿足方程式(1)：

(1)

平均比生長速率可以通過方程式(2)計(jì)算：

lnXt-lnX0=μt

(2)

式(1)和(2)中：dX/dt，細(xì)胞生長速率；μ，比生長速率；X，細(xì)胞濃度；t，培養(yǎng)時(shí)間；Xt、X0，分別為t時(shí)刻和初始的細(xì)胞濃度。

DNA序列測定是根據(jù)Applied Biosystems指導(dǎo)手冊進(jìn)行，運(yùn)用Sequence Scanner (Applied Biosystems)軟件進(jìn)行DNA序列分析。為確保測序結(jié)果的可靠性，部分樣品寄往寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大腸桿菌菌株利用木糖生長的速率不同

在M9木糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)菌株E.coliK12和工業(yè)生產(chǎn)菌株E.coliB0013、B2198，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K12的生長速率明顯快于B0013和B2198。在37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，K12的細(xì)胞密度(OD600)為5.7，而B0013和B2198分別為0.8和0.4，不同菌株在M9木糖培養(yǎng)基中的生長速率差異顯著。

2.2 表達(dá)E. coli K12木糖高效運(yùn)輸系統(tǒng)可顯著改善E. coli B0013和B2198木糖利用

采用分子克隆技術(shù)，分別從E.coliK12、B0013以及B2198菌株的染色體中克隆出含有木糖運(yùn)輸(xylFGH)和分解代謝(xylBA)的兩個(gè)相鄰操縱子，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒pTH-xylB-H。將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒以及pTH18Kr轉(zhuǎn)化E.coliK12、B0013或B2198。轉(zhuǎn)化子分別在M9木糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，監(jiān)測其利用木糖生長的狀況，結(jié)果如圖1所示。

1-E. coli K12; 2-E. coli K12(pTH18Kr); 3-E. coli K12(pTH-K12xylB-H); 4-E. coli B0013; 5-E. coli B0013(pTH18Kr); 6-E. coli B0013(pTH-B0013xylB-H); 7-E. coli B0013(pTH-K12xylB-H); 8-E. coli B2198; 9-E. coli B2198(pTH18Kr); 10-E. coli B2198(pTH-B2198xylB-H); 11-E. coli B2198(pTH-K12xylB-H)圖1 M9木糖培養(yǎng)基中大腸桿菌重組菌及對照菌株的生長Fig.1 Growth properties of the E. coli recombinants in M9-xylose medium

很顯然，E.coliK12、B0013和B2198表達(dá)自身xylB-H對于菌株在M9木糖培養(yǎng)基中的生長沒有明顯影響。然而，在緩慢生長菌株B0013和B2198中表達(dá)快速生長菌株K12的xylB-H，重組菌比原始菌株和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTH18Kr的對照菌株利用木糖生長明顯加快。在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，表達(dá)pTH-K12xylB-H的B0013和B2198細(xì)胞密度(OD600)分別達(dá)到4.7和4.1，而相應(yīng)的原始菌株分別為0.6和0.3 (圖1)。B0013(pTH-K12xylB-H)和B2198(pTH-K12xylB-H)的平均比生長速率μ分別為0.32 h-1和0.31 h-1，顯著高于原始菌株B0013(μ=0.15 h-1)和B2198(μ=0.091 h-1)。

為了確定E.coliK12木糖操縱子中何種組分，對提高B0013生長速率起主要作用，將K12中負(fù)責(zé)木糖運(yùn)輸(xylFGH)和分解代謝(xylBA)的2個(gè)操縱子在B0013中單獨(dú)表達(dá)和同時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明，在B0013中僅表達(dá)K12的木糖運(yùn)輸組分與同時(shí)表達(dá)木糖運(yùn)輸和分解代謝組分，對于重組菌在M9木糖培養(yǎng)基中的生長具有相似的影響(圖2)。

◇B0013(pTH18Kr); □B0013 (pTH-K12xylBA); △B0013 (pTH-K12xylFGH);B0013 (pTH-K12xylB-H)圖2 E. coli B0013重組菌在M9木糖培養(yǎng)基中的生長Fig.2 Growth properties of E. coli B0013 recombinants in M9-xylose medium

在37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，重組菌B0013(pTH-K12xylB-H)和B0013(pTH-K12xylFGH)生長進(jìn)入穩(wěn)定期。而相同條件下，B0013(pTH-K12xylBA)和B0013(pTH18Kr)尚處于生長遲滯期，B0013(pTH-K12xylBA)比B0013(pTH18Kr)生長稍快。因此，菌株B0013利用木糖緩慢的可能原因是其木糖運(yùn)輸途徑出現(xiàn)問題。

2.3 E. coli B0013和B2198木糖利用緩慢的原因是其木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)編碼基因發(fā)生無義突變

對B0013、B2198的xylFGH基因進(jìn)行測序，并與K12的xylFGH序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，B0013的xylH基因第126個(gè)密碼(Trp密碼TGG)、B2198的xylG基因第241個(gè)密碼(Arg密碼CGA)發(fā)生點(diǎn)突變。B0013的xylH基因中，G突變?yōu)锳導(dǎo)致Trp密碼TGG無義突變?yōu)榻K止密碼TAG(Trp126*)，B2198的xylG基因中，C突變?yōu)門導(dǎo)致Arg密碼CGA無義突變?yōu)榻K止密碼TGA(Arg241*)。無義突變導(dǎo)致讀框中斷，相應(yīng)的木糖運(yùn)輸?shù)鞍捉M分不能正確表達(dá)，影響了木糖的正常運(yùn)輸。

進(jìn)一步考察了其他因子，如另一種木糖運(yùn)輸載體xylE或轉(zhuǎn)錄因子xylR，對B0013菌株利用木糖的影響，構(gòu)建了質(zhì)粒pTH-B0013xylR和pTH-B0013xylE，轉(zhuǎn)化B0013菌株。結(jié)果表明，增加xylE和xylR的表達(dá)，能夠適當(dāng)提高B0013的生長速率，且過量表達(dá)xylR的效果略低于過量表達(dá)xylE(圖3)。這一結(jié)果進(jìn)一步說明增加B0013菌株的木糖運(yùn)輸可以改善其利用木糖生長的速率。

由于高親和力D-木糖運(yùn)輸載體XylFGH缺陷而導(dǎo)致的緩慢生長表型不能夠僅僅通過過量表達(dá)XylE而顯著改善，因?yàn)閄ylE作為D-木糖運(yùn)輸載體，親和力較低。HASONA等[4]曾報(bào)道，XylE不是木糖運(yùn)輸?shù)闹饕d體，即便在兩種運(yùn)輸載體都飽和的情況下，XylFGH運(yùn)輸體系仍是主要的木糖運(yùn)輸系統(tǒng)。

進(jìn)一步在B0013中表達(dá)K12的XylFGH，B0013菌株利用木糖的起始生長速率明顯得到改善，但是到達(dá)穩(wěn)定期的細(xì)胞密度(OD600=4.7)低于其他 B0013重組菌(OD600=6.0, 6.5, 7.0)(圖3)。過量表達(dá)XylFGH可能增加了B0013菌株中生物合成的負(fù)擔(dān)，因而限制了穩(wěn)定期的細(xì)胞密度。

2.4 xylH基因回復(fù)突變重建了E. coli B0013利用木糖快速生長表型

構(gòu)建含有E.coliK12的xylH基因部分序列的重組質(zhì)粒pTH18Ks1-K12xylH′，并轉(zhuǎn)化B0013，用木糖平板篩選快速生長菌株。將平板上所獲得的4株快速生長菌株進(jìn)一步在M9木糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果表明有4株B0013突變株利用木糖的快速生長表型恢復(fù)(細(xì)胞密度達(dá)到OD600=5.0)，而對照菌株的細(xì)胞密度(OD600)為0.6。突變株的平均比生長速率μ為0.33 h-1，是對照菌株B0013(μ= 0.15 h-1)的2倍多(圖4)。

1-E. coli B0013; 2,3,4,5,6-xylH reverse mutants B0013H*1-74, 2-68, 3-8, 3-9, 3-75圖4 M9木糖培養(yǎng)基中菌株B0013及其回復(fù)突變株B0013H*的生長Fig.4 Growthproperties of E. coli CICIM B0013 and its reverse mutants B0013H* grown in xylose M9 medium overnight

將突變株在42 ℃連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，去除溫度敏感型質(zhì)粒pTH18Ks1-K12xylH′，質(zhì)粒丟失后突變株在添加50 μg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基上不再生長。對B0013突變株的xylH基因進(jìn)行序列測定和分析，xylH基因第126個(gè)密碼從TAG回復(fù)突變?yōu)門GG，跨膜蛋白xylH正確表達(dá)，能夠高效運(yùn)輸木糖，因而菌株恢復(fù)快速生長表型。該xylH回復(fù)突變株記為B0013H*。

3 討論

盡管大量研究揭示，菌株E.coliB0013具有優(yōu)良的工業(yè)應(yīng)用性能并成功應(yīng)用于多個(gè)重要工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)[13-18]，但在開發(fā)其利用木質(zhì)纖維素資源時(shí)發(fā)現(xiàn)，其木糖代謝存在缺陷。本研究基于實(shí)驗(yàn)菌株E.coliK12在M9木糖培養(yǎng)基中的生長速率明顯快于工業(yè)生產(chǎn)菌株E.coliB0013和B2198的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株利用木糖生長緩慢的原因可能是其木糖運(yùn)輸途徑缺陷。對木糖運(yùn)輸載體基因xylFGH進(jìn)行測序和比對分析，發(fā)現(xiàn)B0013的xylH基因和B2198的xylG基因發(fā)生了無義突變，導(dǎo)致讀框中斷，相應(yīng)的木糖運(yùn)輸?shù)鞍捉M分不能正確表達(dá)，影響了木糖的運(yùn)輸和利用。

本研究通過探索造成不同大腸桿菌菌株利用木糖生長速率差異的遺傳本質(zhì)，確證了高親和力運(yùn)輸載體XylFGH突變對菌株利用木糖生長的速率具有顯著降低效應(yīng)。通過分子重組回復(fù)突變，B0013利用木糖的快速生長表型得以恢復(fù)，為菌株后續(xù)的代謝工程改造與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

自然界中一些微生物本身可以利用木糖而很多微生物不能利用。為了賦予或提高目標(biāo)微生物的木糖利用能力，人們通過遺傳工程引入戊糖利用途徑[19]，或者采用馴化培養(yǎng)的方法(適應(yīng)性進(jìn)化)改善天然菌株或遺傳改造菌株的木糖利用特性[6,20-21]。本研究在已知影響大腸桿菌菌株木糖利用的原因后有針對性地誘導(dǎo)回復(fù)突變，提高菌株的木糖利用能力。木糖的高效利用對于充分利用木質(zhì)纖維素水解糖類生產(chǎn)燃料或其他化學(xué)品具有重要意義，有利于降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

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GeneticnatureofxylosemetabolismdiversityofdifferentEscherichiacolistrains

SUN Jin-feng1,3, TIAN Kang-ming2, SHEN Wei1,CHEN Xian-zhong1, WANG Zheng-xiang2*

1(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)3(School of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huaian 223003, China)

It was found that growth rate of differentEscherichiacolistrains differed evidently when incubated in xylose minimal medium. Expression of two reversely adjacent xylose metabolism operons (xylBA-xylFGH) from rapid growingE.coliK12 in slow growingE.coliB0013 and B2198 increased their growth rates on xylose. Results showed that expression of xylose transporter genexylFGHalone also significantly increased initial growth rate of the recombinants. DNA sequencing and analysis ofxylFGHin K12, B0013 and B2198 indicated that the 126thcodon TGG changed to TAG (Trp126*) inxylHof B0013 and the 241stcodon CGA changed to TGA (Arg241*) inxylGof 2198 which caused interrupted reading frames and therefore deficiency in xylose transporters and was responsible for the slow growth phenotype. Overexpression of its own another xylose transporter genexylEor regulator genexylRslightly increased the growth rate of B0013. However, slow growth on xylose due to the deficiency inxylFGHcannot be significantly improved by overexpression ofxylEalone because XylE is a relatively low-affinity xylose transporter. Reverse mutation ofxylHin B0013, verified by DNA sequencing (the 126thcodon TAG changed back to TGG), restored its rapid growth phenotype.

Escherichiacoli; xylose transporter; growth difference analysis; reverse mutation; genetic nature

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013596

博士研究生，副教授(王正祥教授為通訊作者,E-mail: zx.wang@tust.edu.cn)。

2016-12-12，改回日期：2017-06-13