劉 芳，李凈洋，邱 燁，許妍姬

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，吉林 延吉133002)

刺五加皂苷對(duì)淀粉樣前體蛋白APP酶解通路的影響

劉 芳，李凈洋，邱 燁，許妍姬*

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，吉林 延吉133002)

目的研究刺五加皂苷對(duì)APP(Amyloid Precursor Protein，APP)酶解通路的影響。方法(2015.9-2016.5)用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷處理胚鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)γ-分泌酶活性；另用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染構(gòu)建APP695高表達(dá)CHO細(xì)胞系,用G418(500 mg/L)進(jìn)行篩選獲得APP695-CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷處理穩(wěn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中Aβ1-40含量，用Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中APP-N端片段蛋白的表達(dá)。結(jié)果在胚鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞與對(duì)照組相比，25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷能夠抑制內(nèi)源性γ-內(nèi)切酶的活性，而且隨著濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)；在APP695-CHO穩(wěn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，Aβ1-40的分泌量增高，APP-N端片段的蛋白表達(dá)水平減少，不同劑量刺五加皂苷能緩解這些變化。結(jié)論刺五加皂苷能抑制內(nèi)源性γ-內(nèi)切酶減少Aβ1-40的生成，對(duì)APP酶解起到一定的影響，對(duì)阿爾茨海默病的發(fā)病及進(jìn)展有一定的保護(hù)作用。

刺五加皂苷；β淀粉樣蛋白；γ-內(nèi)切酶；阿爾茨海默?。籄PP-N端片段

(ChinJLabDiagn,2017,21:2173)

1 材料與方法

1.1材料

CHO細(xì)胞株來(lái)自于上海良一醫(yī)藥科技有限公司。APP695是由韓國(guó)首爾醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教室徐裕憲教授饋贈(zèng)。刺五加皂苷購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、LB培養(yǎng)基、DAPT(γ-內(nèi)切酶抑制劑)、G418、青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素(Amp)、DH-5α購(gòu)于碧云天生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素、氨芐青霉素(Amp)、胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清(Corning，N.Y,14831，USA)；NDiff Neuro-2(N2)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑購(gòu)于德國(guó)默克密理博公司； QIAGEN Plasmid Maxi Kit 購(gòu)于QIAGEN; Lipofectin2000從invitrogen公司購(gòu)買；人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)酶聯(lián)免疫分析、大鼠γ-分泌酶(γ-Secretase)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)(mlbio)生物公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱、低速容量離心機(jī)、電泳儀、立式壓力蒸汽滅菌器、冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、恒溫振蕩器、紫外分光光度計(jì)等均由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1質(zhì)粒的擴(kuò)增和抽提

把含有重組質(zhì)粒V-Flag-APP695和空載體V-Flag的菌種放入含氨芐青霉素(Amp)的固體培養(yǎng)基中，先經(jīng)過(guò)小培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入到大培養(yǎng)。根據(jù)質(zhì)粒抽提試劑盒來(lái)提取質(zhì)粒，并測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度。

要形成以學(xué)生為主體的教學(xué)課堂，使學(xué)生作為課堂知識(shí)的主要吸收者和接受者。通過(guò)課堂教學(xué)發(fā)表自身的意見(jiàn)和看法，并從每節(jié)課的學(xué)習(xí)中不斷積累自身的知識(shí)儲(chǔ)備。語(yǔ)文作為一門從小就接觸的學(xué)科，對(duì)學(xué)生的成長(zhǎng)成才起著關(guān)鍵的作用。因此，學(xué)生在學(xué)習(xí)語(yǔ)文的過(guò)程中要擺正自身的姿態(tài)，積極主動(dòng)地去學(xué)習(xí)和探索語(yǔ)文的知識(shí)。例如，關(guān)于作文的寫作方面，在寫到關(guān)于人文素養(yǎng)題材的作文時(shí)，教師可以引用一些有關(guān)此題材的故事，或優(yōu)秀作文，讓學(xué)生自主進(jìn)行討論，從中汲取此類題材的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行構(gòu)思和框架的構(gòu)建，這也是提升個(gè)人人文素養(yǎng)的一個(gè)途徑。

1.3.2CHO細(xì)胞培養(yǎng)

把CHO細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

依照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書，把APP695基因轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，用G418(500 mg/L)篩選陽(yáng)性克隆，再用Western-blot檢測(cè)APP-N端片段蛋白的表達(dá)。

1.3.4胚鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)

取懷孕16-18 d的SD大鼠，乙醚麻醉取出胚胎，放入D-hank’s液中，將胎鼠斷頭取大腦皮層組織，將其剪碎消化分解后，終止消化，離心去上清，再用DMEM培養(yǎng)液吸打靜止后，接種到六孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日換成有1%N2的DMEM培養(yǎng)液，第四天再換成含有10%胎牛血清、5%馬血清的DMEM培養(yǎng)液，7 d后給予續(xù)處理。

1.3.5放射免疫法測(cè)定Aβ1-40含量

空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷和γ-內(nèi)切酶抑制劑5 μmol/L DAPT分別處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，依照人β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1-40)酶聯(lián)免疫試劑盒的要求測(cè)定Aβ1-40的含量。

1.3.6ELISA法測(cè)定γ-內(nèi)切酶活性

分別向胚鼠神經(jīng)元細(xì)胞中加入12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷，48 h后收集培養(yǎng)液，按照γ-分泌酶ELISA試劑盒的說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算得出γ-內(nèi)切酶的濃度。

1.3.7APP-N端片段蛋白水平檢測(cè)

采用蛋白印跡法測(cè)定蛋白水平。細(xì)胞獲取蛋白后進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，以β-tubulin作為內(nèi)參照，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.3.8統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較，采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Aβ1-40含量比較轉(zhuǎn)染APP695-V-Flag模型組與轉(zhuǎn)染空載體V-Flag對(duì)照組比較，Aβ1-40的含量明顯增加(P<0.05，表1)；DAPT處理組、刺五加皂苷低、中、高劑量組與模型組相比，Aβ1-40含量明顯降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 刺五加皂苷對(duì)CHO/APP695細(xì)胞中Aβ1-40含量的影響

與對(duì)照組比較，△代表P<0.05；與模型組比較，*代表P<0.05

2.2刺五加皂苷對(duì)γ-內(nèi)切酶活性的影響胚鼠皮層原代培養(yǎng)細(xì)胞DAPT處理組跟空白對(duì)照組比較，γ-內(nèi)切酶活性明顯下降；刺五加低、中、高劑量組γ-內(nèi)切酶活性與空白對(duì)照組比較明顯降低(P<0.05,表2)。

表2 刺五加皂苷對(duì)胚鼠神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)源性γ-內(nèi)切酶活性的影響

與正常對(duì)照組比較，*代表P<0.05

2.3APP-N端片段蛋白表達(dá)水平測(cè)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒V-Flag-APP695組比轉(zhuǎn)染空載體V-Flag組蛋白表達(dá)水平明顯增加，DAPT+APP695處理組比APP695處理組蛋白表達(dá)水平有所增加，刺五加皂苷(低、中、高)+APP695處理組與APP695模型組相比較，APP-N端蛋白表達(dá)水平升高,具有顯著性差異(P<0.05，圖1)。

*代表與模型組比較P<0.05,#代表與對(duì)照組比較P<0.05

3 討論

阿爾茨海默病(AD)是β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)積累的結(jié)果，是淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)β和γ-分泌酶水解而產(chǎn)生[6]，而γ-分泌酶切割A(yù)PP產(chǎn)生的疏水性Aβ40是形成Aβ的主要原因，所以γ-內(nèi)切酶是APP水解產(chǎn)生Aβ的關(guān)鍵酶，是防治阿爾茨海默病很有潛力的靶點(diǎn)。γ-分泌酶是產(chǎn)生Aβ的限速酶，直接關(guān)系到AD的發(fā)病與否，能切割各種Ⅰ型跨膜蛋白,包括 APP 和 CD44等[7,8]。

γ-分泌酶抑制劑(GSIS)已用于臨床研究,但如DAPT或其他γ-分泌酶抑制劑和β-分泌酶抑制劑，由于藥物用藥的安全性以及其長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)的副作用，不適于長(zhǎng)期使用。所以我們必須找到長(zhǎng)期比較安全使用的一些組分，這些保護(hù)成分可以來(lái)自從中草藥或微量元素或食品。因此，本次研究我們觀察了刺五加皂苷對(duì)APP的酶解途徑的影響。結(jié)果顯示，刺五加皂苷可以抑制γ-內(nèi)切酶的活性，進(jìn)而減少Aβ1-40的產(chǎn)生，其APP-N端蛋白表達(dá)水平升高。在HT22細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)Sweidish 突變型APP的SH-SY5Y細(xì)胞中，Shi Chung等人報(bào)道人參皂甙Rg1促進(jìn)APP非淀粉樣酶切通路，增加α-分泌酶的活性以及細(xì)胞外的Aβ1-40和分泌型sAPP(α)的含量，闡明了人參皂甙Rg1對(duì)老年性癡呆酶解通路的干預(yù)作用[9]。Koivisto等人報(bào)道魚油含EPA和DHA，可以緩解老年性癡呆模型APPswe/PS1dE9 轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知障礙和腦部淀粉樣蛋白的沉積，其機(jī)制為降低β-分泌酶和γ-分泌酶的活性減少Aβ1-42的含量[10]。我們的研究結(jié)果與這些結(jié)果保持一致性，刺五加皂苷抑制γ-內(nèi)切酶的活性，進(jìn)而減少Aβ1-40的產(chǎn)生，干預(yù)老年性癡呆酶解通路，可以起到預(yù)防和治療老年性癡呆有保護(hù)作用。

刺五加皂苷具有調(diào)控心腦血管系統(tǒng)，抑制癌細(xì)胞增殖，降低糖尿病，抗炎，增強(qiáng)免疫力，抗疲勞等藥理作用[11]。刺五加含有超氧化物歧化酶復(fù)合物，具有很好的抗氧化功能，可增強(qiáng)免疫力和抗自由基的作用[12]。刺五加皂苷E 和異秦皮啶對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的軸突和樹(shù)突的萎縮具有明顯的保護(hù)作用[13]。刺五加皂苷能顯著抑制α-synuclein誘導(dǎo)的毒性[14]。刺五加提取物可提高紋狀體多巴胺(DA)含量，平衡紋狀體的行為激活和抑制作用，保護(hù)DA神經(jīng)元凋亡，減輕帕金森病小鼠的死亡率[15]。之前，我們研究組通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明了刺五加對(duì)老年性癡呆的保護(hù)作用，刺五加皂苷對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的有較好的保護(hù)作用[16]。刺五加提取液對(duì)半衰老模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退及腦組織MDA 、SOD、膽堿酯酶(TchE)、單胺氧化酶(MAO)活性變化有較好的保護(hù)作用[17,18]，提示刺五加可能的保護(hù)機(jī)制是其抗氧化作用。這些報(bào)道均提示刺五加對(duì)神經(jīng)變性疾病如老年性癡呆或帕金森病有保護(hù)作用。

APP是跨膜蛋白，APP經(jīng)過(guò)β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下產(chǎn)生Aβ1-40或Aβ1-42，可以被a-分泌酶的作用下產(chǎn)生分泌型APP(SAPP)，最近報(bào)道也可以被ε-,δ-,η分泌酶的作用下產(chǎn)生不同的C-端片段[19]。此次研究我們就測(cè)定了γ-內(nèi)切酶的活性和Aβ1-40的含量以及APP-N端蛋白表達(dá)水平，今后我們想繼續(xù)對(duì)APP酶解相關(guān)的其他酶和相關(guān)基因進(jìn)行更深層次研究，對(duì)β-分泌酶、α-分泌酶的活性以及各分泌酶的相關(guān)基因如PS1(γ-)、PS2(γ-)、BACE1(β-)、AMDM10(α-)的蛋白質(zhì)和mRNA水平的表達(dá)。綜上所述，刺五加皂苷對(duì)老年性癡呆有較好的保護(hù)作用，其保護(hù)作用的分子生物學(xué)機(jī)制可能是對(duì)APP酶解通路的干預(yù)作用，其更深的分子生物學(xué)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究和探討。

[1]Mhatre SD,Michelson SJ,Gomes J,et al.Development and characterization of an aged onset model of Alzheimer’s disease in Drosophila melanogaster[J].Exp Neurol，2014，261:772.

[2]Fargo K,Bleiler L.Alzheimer’s Association report[J].Alzheimers Dement，2014，10:147.

[3]Choi SJ,Jung SS,You YS,et al.Prevalence of Alzheimer’s dementia and its risk factors in community-dwelling elderly Koreans[J].Psychiatry Investig，2008，5:78.

[4]王 蒙，唐迪瑩，李欣欣，等.β淀粉樣蛋白及tau蛋白相關(guān)機(jī)制在阿爾茨海默病中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2017,37(12)：3101.

[5]周 珂，譚 勇，劉忠第，等.刺五加治療血管性癡呆的機(jī)制和前景[J].世界中醫(yī)藥，2017，12(3)：704.

[6]Marcus O.W.Grimm,Janine Mett,Christoph P.Stahlmann,et al.APP intracellular domain derived from amyloidogenic β-and γ-secretase cleavage regulates neprilysin expression[J].Front Aging Neuroscience,2015,7 :77.

[7] Beel AJ，Sanders CR.Substratespecificity of γ- secretase and other intramembrane proteases[J].Cell Mol Life Sci ,2008，65(9):1311.

[8]韋 云，劉美霞，梁曉東，等.還腦益聰方提取物含藥血清對(duì)APP/PS1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞γ分泌酶活性及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33(3):417.

[9] Hennariikka Koivistoa,Marcus O.Grimmb,c,Tatjana L.Rothhaarb,et al.Special lipid-based diets alleviate cognitive deficits in the APPswe/PS1dE9 transgenicmouse model of Alzheimer's disease independent of brain amyloid deposition[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2014，25：157.

[10]Shi C,Zheng DD,Fang L,et al.Ginsenoside Rg1 promotes nonamyloidgenic cleavage of APP via estrogen receptor signaling to MAPK/ERK and PI3K/Akt[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820(4):453.

[11]黃曉巍，劉玥欣，張嘯環(huán).刺五加葉化學(xué)成分、藥理作用及現(xiàn)代臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥，2017,37(6):611.

[12]袁曉勇，趙 陽(yáng).刺五加注射液對(duì)抑郁大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其作用機(jī)制[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017,34(6)：469.

[13]Y.Bai,C.Tohda,S.Zhu,et al.Active components from Siberian ginseng (Eleutherococcus senticosus) for protection of amyloid beta (25-35)-induced neuritic atrophy in cultured rat cortical neurons[J].J Nat Med,2011,65,417.

[14]See comment in PubMed Commons belowLi XZ,Zhang SN,Lu F,et al.Microarray Expression Analysis for the Paradoxical Roles of Acanthopanax senticosus Harms in Treating α-Synucleinopathies[J].Phytother Res,2016,30:243.

[15]Shu-min Liu,Xu-zhao Li ,Yan Huo,et al.Protective effect of extract of Acanthopanax senticosus harms on dopaminergic neurons in Parkinson's disease mice[J].Phytomedicine,2012,19,631.

[16]元紅花，程 琳，許妍姬.刺五加皂苷對(duì)Aβ25-35誘發(fā)PC12細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2014，3(34)：1570.

[17]許妍姬.刺五加對(duì)癡呆模型小鼠記憶障礙及MDA含量、SOD和乙酰膽堿脂酶活性的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，9(30)：1238.

[18]許妍姬.刺五加對(duì)癡呆模型小鼠記憶障礙及腦組織單胺氧化酶活性改變的保護(hù)作用[J].中成藥,2009,31(8):1290.

[19]María-Salud García-Ayllón,Inmaculada Lopez-Font,Claudia P.Boix,et al.C-terminal fragments of the amyloid precursor protein in cerebrospinal fluid as potential biomarkers for Alzheimer disease[J].Sci Rep,2017,7:2477.

EffectofAcanthopannxSenticoususSaponinsonprocessingPathwayofAmyloidprecursorprotein

LIUFang，LIJing-yang，QIUYe,etal.

(DepartmentofPreventiveMedicine,YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China)

ObjectiveTo study the effects of Acanthopannx Senticousus Saponins(ASS) on processing pathway of amyloid precursor protein(APP).Methods(2015.9-2016.5)12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to primary culturedrat cortical neuron cells， the activity of γ-secretase was measured by ELISA analysis;The APP695 gene was transfected into CHO cells using Lipper 2000 reagent.Stably transfected cells were sclected by G418(500 mg/L).12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to stably transfected cellsfor 48 hours,ELISA assay was used to detected Aβ1-40concentration in the supernatant of cell culture medium.Western-blot analysis were used to detected the APP-N terminal fragment protein expression from cell lysate.ResultsIn the primary cultured cortical neuron cells,25 mg/L,50 mg/L ASS inhibited the activity of γ-secretase compared with control group,and,the effect of inhibition were enhanced as the concentration increased.The concentration of Aβ1-40was incresedand the expression of APP-N terminal fragment protein were decreased in APP695-CHO stably transfected cells,which all changes were alleviated by different dose of ASS.ConclusionASS could inhibit the activity of endogenousγ-secretase to decreasing Aβ1-40production and influence APP processing may have an protective effect on Alzheimer’s disease pathology.

Acanthopannx Senticousus Saponins；β-amyloid protein; γ-secretase; Alzheimer’s disease；APP-N terminal fragment

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字2016-279號(hào))

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2173-04

R285

A

劉 芳(1990-)，女，碩士，研究方向?yàn)樯窠?jīng)毒理學(xué);許妍姬(1973-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯窠?jīng)毒理學(xué)。

2017-08-01)