劉春麗，張 潔，齊志偉，梁 媛，黃躍雁，張淑君

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻喉科， 河北 承德067000)

miR-130a-3p通過抑制CXCL12抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖與侵襲

劉春麗，張 潔，齊志偉，梁 媛，黃躍雁，張淑君*

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 耳鼻喉科， 河北 承德067000)

目的探討miR-130a-3p 對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1功能的影響及其可能的靶向基因。方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將miR-130a-3p 模擬物(實驗組)或?qū)φ漳M物(對照組)轉(zhuǎn)染CNE-1細(xì)胞，分別用CCK-8 法和Transwell 試驗檢測細(xì)胞增殖侵襲和遷移能力變化，Western Blot檢測趨化因子CXCL12蛋白表達。結(jié)果相較對照組，實驗組CNE-1 細(xì)胞的增殖,侵襲和遷移能力增強(P<0.05)，細(xì)胞中CXCL12蛋白表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論miR-130a-3p 可能通過調(diào)節(jié)CXCL12蛋白表達抑制人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

鼻咽癌；趨化因子；CXCL12； miR-130a-3p； CNE-1 細(xì)胞

(ChinJLabDiagn,2017,21:2168)

鼻咽癌原發(fā)于鼻咽黏膜上皮，常發(fā)于咽隱窩和頂前壁，常常起病隱蔽，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早。目前鼻咽癌治療以放療為主要手段，但因腫瘤容易復(fù)發(fā)和早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后往往不佳。因此，特異性分子標(biāo)記物及基因治療靶位的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)作用機制的研究，對降低鼻咽癌患者死亡率，提高預(yù)后具有重大意義。

本研究借助細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，采用脂質(zhì)2000介導(dǎo)使得miRNA-130a-3p 模擬物轉(zhuǎn)染入鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中，從而觀察并檢測其對CNE-1細(xì)胞增殖、侵襲以及CXCL12蛋白的表達情況的影響，對其在人鼻咽癌中可能的調(diào)節(jié)機制進行初步的探究。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株 CNE-1,從中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心獲得。CNE-1細(xì)胞接種于含10%FBS的 H1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長后胰酶消化處理后傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.2miR-130a-3p轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞miR-130a-3p 模擬物(miR-130a-3p mimics)和陰性對照模擬物miRNA-NC，miR-130a-3p NC inhibitor均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的CNE-1細(xì)胞密度增長到80%-90% 時，用胰酶消化后收集細(xì)胞以2.5×105個細(xì)胞/孔接種到6 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞單層密度達40%-50% 時，分別將miR-130a-3p摸擬物(實驗組)或miRNA-NC及miR-130a-3p NC inhibitor(對照組)轉(zhuǎn)染入CNE-1細(xì)胞。

1.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖將miR-130a-3p mimics和miRNA-NC兩組轉(zhuǎn)染后的CNE-1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并收集細(xì)胞吹散稀釋，調(diào)節(jié)濃度至3×105/ml，以3 000/孔均勻接種在96 孔板，每板2組，每組4個復(fù)孔。將孔板放置在培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，分別于24，48，72 h取出孔板，加入CCK-8 溶液10 μl/孔37℃，5%CO2溫箱中繼續(xù)孵育 2 h。用酶標(biāo)儀測定每孔細(xì)胞溶液在450 nm 波長處的光吸收值。重復(fù)3次。

1.4Transwell試驗檢測細(xì)胞的侵襲能力預(yù)先將Matrigel放置在4℃冰箱中24 h。 用H1640 培養(yǎng)基按 3:1 稀釋Matrigel膠，加入Transwell 小室上室(30 μl/孔)，37℃、5%CO2下培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h。吸出小室中殘留的液體，加入無血清H1640 培養(yǎng)基(50 μl/孔)后在37℃下孵育 30 min ，棄去培養(yǎng)基。向每個Transwell小室中接種200 μl 5×105/ml的細(xì)胞懸液，小室下方加入600 μl 含 20%血清的 H1640 培養(yǎng)基，將小室置于孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育36 h，棄培養(yǎng)液， PBS洗滌3次，吸出殘留液，固定，染色，再次PBS洗滌。拭去上室面細(xì)胞后使用倒置顯微鏡下進行拍照計數(shù)，每次隨機選取5個視野，每組進行3 次實驗。

1.5預(yù)測miR-130a-3p的靶基因利用 Target Scan、Pic Tar、mi Randa 生物信息學(xué)分析工具，預(yù)測hsa-miR-130a-3p可能的靶基因。預(yù)測結(jié)果顯示，hsa-miR-130a-3p 可以靶向結(jié)合CXCL12 -3'UTR。

1.6WesternBlot檢測CXCL12蛋白表達在冰上用預(yù)冷的PBS對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞洗滌2 次，離心，取上清液，裂解細(xì)胞。取少量蛋白樣用BCA 法測定蛋白濃度。將蛋白溶液以30 μg/孔加樣到孔板中， 10% SDS-PAGE上電泳分離，轉(zhuǎn)膜； 5% 脫脂奶粉溶液封閉孵育1 h，加入一抗PBST稀釋液4℃孵育過夜； 再次PBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗PBST稀釋液，密封，室溫下?lián)u床緩慢震蕩孵育2 h ； PBST洗膜3 次，每次10 min。在暗室中應(yīng)用雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1miR-130a-3p可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖相較對照組，CNE-1 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics后，細(xì)胞增殖減慢，而轉(zhuǎn)染 miR-130a-3p inhibitor后的細(xì)胞增殖加快。說明miR-130a-3p mimics可以抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，見圖1。

圖1 miR-130a-3p抑制CNE-1細(xì)胞增殖(P<0.001)

2.2miR-130a-3p抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲能力相較對照組，CNE-1 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics后，穿膜細(xì)胞數(shù)減少，而轉(zhuǎn)染miR-130a-3p inhibitor后細(xì)胞穿膜數(shù)增加，見圖2。證明miR-130a-3p抑制CNE-1細(xì)胞的侵襲能力。

2.3miR-130a-3p抑制鼻咽癌細(xì)胞上CXCL12蛋白的表達相較對照組，CNE-1 細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-130a-3p mimics后，細(xì)胞的CXCL12表達水平下降，說明miR-130a-3p可下調(diào)CXCL12蛋白的表達水平(t=4.256，P<0.05)，見圖3。

圖2 Transwell實驗提示： miR-130a-3p mimics可明顯減少CNE-1的侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.001)

圖3 miR-130a-3p 對CNE-1細(xì)胞CXCL12 蛋白表達的影響

3 討論

鼻咽癌是耳鼻喉科常見的頭頸部惡性腫瘤，其治療失敗的因素常常歸結(jié)為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。Micro RNA 是一類僅占基因組序列1%-3%的進化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，可通過與特定的mRNA完全或不完全堿基互補引導(dǎo)沉默體降解靶mRNA或阻礙其翻譯，在轉(zhuǎn)錄水平上對基因活動的各個層面進行調(diào)節(jié)，并調(diào)控靶基因的蛋白表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)miRNA處于染色體上與腫瘤相關(guān)的區(qū)域，越來越多的研究證實，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展的各個階段都有miRNA的參與，可在各種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤或引起腫瘤的生物學(xué)作用[6]。目前，已有研究顯示miR-130a-3p 在肝胰島素敏感性和肝脂肪變中發(fā)揮重要作用，并且在尿道膀胱癌中與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也密切相關(guān)[1]。Chen HC等[2]研究顯示，miR-130a-3p在鼻咽癌中低度表達，但其與鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系及作用機制尚未完全闡明。

趨化因子(CXCL12)是一類在多種腫瘤中高度表達的控制免疫細(xì)胞向炎癥定向遷移的細(xì)胞因子，與腫瘤的生長，侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[3-5]。已有研究顯示CXCL12的表達在鼻咽癌組織中存在與該腫瘤TNM分期呈正相關(guān)的現(xiàn)象，提示CXCL12可能與鼻咽癌細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)[5]。

在我們的實驗中，采用CCK-8 法檢測觀察到過表達miR-130a-3p后鼻咽癌細(xì)胞增殖能力降低，說明miR-130a-3p在鼻咽癌中可有效抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，應(yīng)用Transwell 試驗表明過表達miR-130a-3p 對鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有顯著抑制作用。綜合我們的實驗結(jié)果證明了 miR-130a-3p可在鼻咽癌中作為一種抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤的作用。 很多研究證實miR-130a-3p經(jīng)多種生物信息學(xué)軟件可以預(yù)測 microRNA靶位點[7-9]，因此我們在上百種靶基因中選取與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的CXCL12進行后續(xù)實驗。在本研究中，miR-130a-3p模擬物轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞CXCL12蛋白的表達量明顯地下降，提示過表達miR-130a-3p后可以下調(diào)CXCL12蛋白的表達水平，所以CXCL12是miR-130a-3p發(fā)揮抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的作用的相關(guān)因子。本研究仍需要后續(xù)實驗證實，miR-130a-3p與CXCL12間具體關(guān)聯(lián)機制有待進一步研究，為增加鼻咽癌生物學(xué)標(biāo)記物及鼻咽癌的診治提供新思路。

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TheeffectofmiR-130a-3ponfunctionofhumannasopharyngealcarcinomacells

CNE-1bydown-regulatingtheexpressionofCXCL12LIUChun-li,ZHANGJie,QIZhi-wei,etal.

(AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Objectiveto investigate the effect of miR-130a-3p on the function of human nasopharyngeal carcinoma cell CNE-1 and its possible target genes.Methodsusing liposome mediated method,analogue of miR-130a-3p (experimental group) or analogue control (control group) were transfected into CNE-1 cells,respectively using CCK-8 method and Transwell test for cell proliferation migration and invasion changes,Western Blot detection of chemokine CXCL12 protein expression.Resultscompared with the control group,the proliferation,invasion and migration ability of CNE-1 cells in the experimental group were increased (P<0.05),and the expression level of CXCL12 protein in the cells was significantly lower(P<0.05).ConclusionmiR-130a-3p may inhibit the proliferation,invasion and migration of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 by regulating the expression of CXCL12 protein.

nasopharyngeal carcinoma;chemokines;CXCL12;miR-130a-3p;CNE-1 cells

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2168-03

R739.6

A

2017-01-12)