伍啟康，李小燕，吳奎海

(1.佛山市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 佛山528000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510182)

臨床分離16株耐碳青酶烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制初步研究

伍啟康1，李小燕2，吳奎海1

(1.佛山市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 佛山528000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510182)

目的了解佛山市第一人民醫(yī)院耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥情況和耐藥機(jī)制。方法2013年1月至2015年12月收集16株耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌，其中大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌4株，產(chǎn)酸克雷伯菌1株。利用VITEK2-compact微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)。采用改良Hodges和MEM(美羅培南)-EDTA(乙二胺四乙酸)-Na2雙紙片協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行耐藥表型篩選。采用PCR法檢測耐藥基因blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48。結(jié)果16株細(xì)菌對(duì)亞胺培南、美羅培南均耐藥。16株細(xì)菌Hodges均陽性，15株雙紙片協(xié)同試驗(yàn)陽性。在11株大腸埃希菌，9株攜帶blaNDM-5，2株攜帶blaNDM-1。4株肺炎克雷伯菌攜帶blaNDM-5，1株產(chǎn)酸克雷伯菌攜帶blaKPC-2。結(jié)論我院耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制以產(chǎn)blaNDM-5碳青霉烯酶為主。

耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌；碳青霉烯酶；NDM；耐藥性

(ChinJLabDiagn,2017,21:2129)

腸桿菌科細(xì)菌作為臨床常見的條件致病菌，其引起的重癥感染越來越引起重視。碳青霉烯類藥物抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)殺菌作用快的β-內(nèi)酰胺類藥物 ，其良好的細(xì)胞通透性、高度酶穩(wěn)定性及較低的毒性等特點(diǎn)已成為目前臨床治療嚴(yán)重革蘭陰性細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一 ，但隨著耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的出現(xiàn)及不斷的增多 ，使該類藥物的臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。本研究主要對(duì)臨床分離耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1菌株來源我院檢驗(yàn)科微生物室2013年1月至2015年12月分離的16株耐碳青霉烯類菌株，其中大腸埃希菌11株，肺炎克雷伯菌4株，產(chǎn)酸克雷伯菌1株。標(biāo)本來源包括痰液10例，尿液2例，血液2例，傷口1例，膽汁1例，同一患者只取第一次分離菌株。

1.2細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)利用法國生物梅里埃公司的VITEK2-compact儀器及其配套GN、AST-GN13卡進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)。美羅培南藥敏試驗(yàn)采用K-B法，藥敏紙片購自英國OXOID公司，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)2015年標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，美羅培南的耐藥標(biāo)準(zhǔn)都為R≤19 mm、敏感標(biāo)準(zhǔn)為S≥23 mm，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌A TCC27853。

1.3碳青霉烯酶表型檢測依據(jù)CLSI M100-S23進(jìn)行改良Hodges試驗(yàn)。MEM(美羅培南)-EDTA(乙二胺四乙酸)-Na2協(xié)同試驗(yàn)，配制0.1 mol/L EDTA-Na2，加10 μl至MEM紙片上，無菌條件下自然干燥備用。配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，均勻涂布于MH瓊脂平板，將MEM和MEM-EDTA-Na2的紙片貼于瓊脂表面。結(jié)果判定：含酶抑制劑紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑相差≥5 mm，提示該菌產(chǎn)生金屬 β-內(nèi)酰胺酶[2]。

1.4主要儀器和試劑德國Eppendorf公司的PCR擴(kuò)增儀器，Bio-Rad公司的凝膠儀,TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.5PCR擴(kuò)增細(xì)菌的DNA提取參考試劑盒說明書，-40℃保存。相關(guān)基因的PCR反應(yīng)體系均為20 μl體積,其中含Mg2+的10×buffer 2 μl，dNTP 200 μmol/L，上下游引物0.2 μmol/L，DNA模板1 μl，TaqDNA聚合酶1U，加入滅菌去離子水至20 μl。blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48等碳青霉烯酶陽性菌株由廣州醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院微生物室李小燕提供,PCR擴(kuò)增陽性并經(jīng)測序驗(yàn)證，具體引物序列見表1。

表1 PCR反應(yīng)的引物序列

1.6PCR產(chǎn)物序列分析產(chǎn)物送華大基因科技公司進(jìn)行純化并雙向測序，利用DNAstar軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行序列校正，在GenBank中用blastn進(jìn)行核酸同源性搜索，分析基因類型。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)16株腸桿菌對(duì)碳青霉烯類、頭孢三代、頭孢四代均耐藥，對(duì)氨曲南、阿米卡星、左旋氧氟沙星耐藥率分別為56.25%、25%、37.5%。

2.2碳青霉烯酶表型檢測16株腸桿菌科細(xì)菌改良Hodges試驗(yàn)均陽性，證明均產(chǎn)碳青霉烯酶。15株MEM-EDTA-Na2協(xié)同試驗(yàn)陽性，僅1株產(chǎn)酸克雷伯菌陰性。

2.3PCR擴(kuò)增在11株大腸埃希菌中，9株NDM-5基因陽性，2株NDM-1陽性。4株肺炎克雷伯菌均檢測出NDM-5，1株產(chǎn)酸克雷伯菌KPC-2陽性。具體分布見表2。

3 討論

本研究顯示CRE對(duì)氨基糖苷類、氨曲南耐藥率相對(duì)較低，但對(duì)多黏菌素和替加環(huán)素具有較高體外敏感性[1]。在臨床上治療此類感染可采取聯(lián)合用藥，如替加環(huán)素聯(lián)合多粘菌素或磷霉素或氨基糖苷類、加酶抑制劑復(fù)合制劑聯(lián)合氨基糖苷類或多黏菌素或氟喹諾酮類。

表2 16株腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因和主要抗生素MIC(μg /ml)分布

備注：CTX：頭孢曲松；CAZ：頭孢他啶；FEP：頭孢吡肟；ATM：氨曲南；IMP：亞胺培南；AK：阿米卡星；LVX：左旋氧氟沙星

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥主要機(jī)制有四種[5]：①外膜蛋白變異合并AmpC、ESBLs等酶高產(chǎn)；②藥物作用靶位的改變；③產(chǎn)生碳青霉烯酶；④外排泵作用。其中最主要的就是碳青霉烯酶，以A類和B類最常見，其中A類以KPC常見。B類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，如IM P、NDM-1、VIM。在我國報(bào)道大腸埃希菌的耐碳青酶烯類耐藥機(jī)制以產(chǎn)KPC-2和IMP-4碳青霉烯類酶為主。在本研究中，81.2%(9/11)大腸埃希菌中NDM-5陽性，僅2株NMD-1陽性。NDM基因至今有12個(gè)亞型，產(chǎn)NDM-5大腸埃希菌最早在英國發(fā)現(xiàn)。 NDM-5與NDM-1有兩個(gè)位點(diǎn)氨基酸序列差異(Val88Leu 和Met154Leu)[6]。我國分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，以產(chǎn)KPC-2酶為主，同時(shí)伴有外膜蛋白(Ompk35、Ompk36)缺失[7,8]。5株肺炎克雷伯菌均攜帶NDM-5，與我國大部分地區(qū)攜帶KPC-2不同。1株產(chǎn)酸克雷伯菌KPC-2酶，KPC酶已有11個(gè)亞型，KPC酶可通過克隆菌株播散，也可通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)性遺傳元件播散。產(chǎn)NDM-5腸桿菌科細(xì)菌最近幾年在我國和歐洲等地區(qū)逐漸有報(bào)道，LIU等[9]報(bào)道南昌一例患者分離于尿液標(biāo)本，屬于ST14型別。Bathoorn等[10]報(bào)道荷蘭分離與產(chǎn)NDM-5，屬于ST16型別。Zhang等[11]在上海發(fā)現(xiàn)2株大腸埃希菌、1株肺炎克雷伯菌、1株奇異變形桿均檢測NMD-5基因，而且四株菌DNM-5基因周圍的遺傳環(huán)境相同，可能與IncX3型質(zhì)粒水平傳播有關(guān)。

總之，我院CRE菌株存在NDM-5流行趨勢，今后要規(guī)范化使用碳青霉烯類抗生素，加強(qiáng)本院該類菌株的流行病學(xué)調(diào)查，制定切實(shí)有效的感控措施，減少產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的發(fā)生及播散，預(yù)防醫(yī)院感染的發(fā)生。

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Resistancemechanismof16carbapenem-resistantEnterobacteriaceaeisolatesfromclinicalspecimen

WUQi-kang1，LIXiao-yan2，WUKui-hai1.

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstPeople’sHospitalofFoshan,Foshan528000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,TheFourthAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

ObjectiveTo investigate the resistance mechanism of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates in the First People’s Hospital of Foshan.Methods16 carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolates were collected from January 2013 to December 2015,including 11Escherichiacolistrains,4Klebsiellapneumoniaestrains and 1Klebsiellaoxytocastrain.The identification and antimicrobial susceptibility of the isolates were analyzed by Vitek2-compact microorganism analysis system.The modified Hodge test and MEM-EDTA-Na2double-disk synergy test were screen out the carbapenem-resistant photypes.The genes of the carbapenemase,blaIMP,blaKPC,blaNDM,blaVIMandblaOXA-48were performed by PCR.Results16 isolates were all resistant to imipenem and meropenem.16 isolates and 15 isolates were positve for the modified Hodge test and MEM-EDTA-Na2 double-disk synergy test,respectively.Of 11Escherichiacolistrains,9 strains carriedblaNDM-5and 2 strains carriedblaNDM-1.4Klebsiellapneumoniaestrains all habouredblaNDM-5and 1Klebsiellaoxytocastrain habouredblaKPC-2.ConclusionThe resistance mechanism of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae in the hospital is mainly production ofblaNDM-5carbapenemase.

Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae;Carbapenemase;NDM;Resistance

廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目(201308103)

1007-4287(2017)12-2129-03

R372

A

2017-05-13)