聶 群,董 晶,聶李平,周 宇,謝聞悅,李建新*

(1.深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院 檢驗科，廣東 深圳518120；2.北京大學深圳醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳518036)

標本溶血對常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結果的影響

聶 群1,董 晶2,聶李平2,周 宇2,謝聞悅2,李建新2*

(1.深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院 檢驗科，廣東 深圳518120；2.北京大學深圳醫(yī)院 檢驗科，廣東 深圳518036)

目的探討標本溶血對常規(guī)凝血試驗(包括PT、APTT和Fbg)和纖溶標志物(包括D-dimer和FDP)測定結果的影響。方法對48例溶血標本和2 h內(平均65 min)重新采集的未溶血配對標本分別進行常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定；另對30例未溶血標本體外機械誘導溶血，分別于溶血前后進行常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定。結果對于臨床溶血和未溶血配對標本，PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP在兩者間均無顯著性差異；對于誘導溶血標本，誘導溶血前后PT、APTT、Fbg和FDP均無顯著性差異；誘導溶血后較溶血前D-dimer降低(361.10±493.40 VS 396.37±494.47 μg/L，P< 0.001)。以上參數(shù)結果在溶血和未溶血標本之間，Pearson相關分析均呈高度相關(r均>0.97，P均<0.001)，Bland-Altman圖均顯示一致性良好。以上參數(shù)改變值和溶血程度均不相關(P均>0.05)。結論標本溶血對常規(guī)凝血試驗和FDP的測定結果無明顯影響，體外機械誘導溶血對D-dimer測定結果造成較小的負性影響，但不影響臨床決定。應對拒收溶血標本用于常規(guī)凝血測試的規(guī)定進行再評估。

溶血；常規(guī)凝血試驗；D-dimer；FDP

(ChinJLabDiagn,2017,21:2115)

常規(guī)凝血試驗[包括凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)和纖維蛋白原(fibrinogen,Fbg)]是臨床血凝實驗室執(zhí)行得最多的測試，廣泛用于篩選檢測遺傳性和獲得性凝血缺陷、抗凝和溶栓治療監(jiān)測、術前患者止凝血功能評估、彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)的篩選診斷、凝血抑制物篩選、靜脈血栓篩查等[1，2]。纖溶標志物D-二聚體(D-dimer)和纖維蛋白(原)降解產物(fibrin/fibrinogen degradation products,FDP)也是臨床頻繁地申請的止血檢測項目，在輔助排除診斷靜脈血栓形成(venous thromboembolism,VTE)、判斷VTE再發(fā)風險、評估抗凝治療持續(xù)時間、DIC的診斷和管理方面具有非常重要的意義[3，4]。FDP和D-dimer聯(lián)合檢測還可以鑒別診斷原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶[5]。

凝血試驗易被一些分析前技術變量影響，如采血裝置、標本收集管、標本運送和儲存條件等等[6，7]。在送達臨床實驗室的凝血試驗標本中，溶血是較常見現(xiàn)象[7]。溶血可能導致凝血因子活化和干擾測量終點判讀，因此，美國臨床實驗室標準化研究院(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)H21-A4指南規(guī)定，對于常規(guī)凝血試驗如PT和APTT，應拒收肉眼可見的溶血標本[6]。Laga AC等[7]報道，標本溶血雖然影響PT和APTT測試結果，但影響程度較輕，似乎對臨床決定無重要意義。但Lippi等[8]根據(jù)他們以凍融法誘導溶血的實驗結果認為，僅輕微溶血標本可供凝血測試，中度以上的溶血標本會影響常規(guī)凝血試驗結果的可信度?；谶@些，在CLSI新的H21-A5指南[9]中，無明確規(guī)定應拒收溶血標本用于常規(guī)凝血試驗。

關于標本溶血對纖溶分子標志物D-dimer和FDP測定的影響，相關報道較少。本文從兩個方面前瞻性研究標本溶血對常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結果的影響：首先研究臨床送檢的溶血的凝血測試標本和2小時內重新采集的非溶血配對標本的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結果差異，再研究標本在機械誘導溶血前后的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物測定結果差異。

1 材料與方法

1.1 臨床溶血標本

患者靜脈血采集于2 ml 109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝真空管(廣州陽普公司)，血液與抗凝劑的比例為9∶1。溶血定義為標本經(jīng)2 500×g離心15 min后，血漿以裸眼觀察呈粉紅色到紅色。接收到溶血標本后，立即通知臨床重新采集非溶血標本送檢。時間間隔在2 h內的溶血和非溶血配對標本才納入本研究。常規(guī)凝血試驗在標本接收后2 h內以Sysmex CA 1500和Stago Compact血凝儀完成測試，每對溶血和非溶血配對標本只在一臺血凝儀上測試。Sysmex CA 1500血凝儀常規(guī)凝血試驗所用試劑由德國Siemens公司提供，PT試劑為Thromborel-S，APTT試劑為Actin和0.025 mol/L氯化鈣，F(xiàn)bg試劑為Thrombin Reagent (100NIH)。Stago Compact血凝儀采用其配套試劑，PT試劑為STA○RNeoplastine○RCI Plus 10，APTT試劑為STA○RPTT Automate 5，F(xiàn)bg試劑為STA Fibrinogen 5。D-dimer和FDP測定也在標本接收后2 h內完成，所用儀器為Sysmex CA 1500。D-dimer測定采用Siemens公司的D-dimer Assay PLUS試劑，該試劑采用D-dimer單克隆抗體，特異性強，不受纖維蛋白原和其他纖維蛋白降解產物的影響；采用乳膠增強型免疫比濁法進行檢測，最低檢測限值為50 μg/L，檢測線性范圍為50-9999 μg/L，CV < 5%。FDP測定也采用乳膠增強型免疫比濁法試劑，生產廠家為日本第一化學株式會社。

1.2 體外機械誘導溶血標本

隨機收集未溶血凝血測試標本30例，先作常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP測試，再蓋上蓋子，在混旋器上強力混旋30 min，人為機械劇烈震蕩誘導標本溶血，2 500 × g離心15min后再作常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP測試。所有測試在3 h內完成。

1.3 血漿游離血紅蛋白(free hemoglobin,fHgb)測定

采用鄰-甲聯(lián)苯胺法，按操作規(guī)程[10]測定。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 臨床溶血標本

一共48對溶血和非溶血配對標本納入研究。34對標本來自ICU，4對來自CCU，其它來自產科、神經(jīng)內科、內分泌科、神經(jīng)外科、消化內科等。溶血和非溶血配對標本的采集時間間隔平均為65 min。32對標本的常規(guī)凝血試驗在Stago Compact血凝儀上完成，另外16對標本在Sysmex CA 1500血凝儀上完成。溶血標本的血漿fHgb為2.01±1.37 g/L，覆蓋了臨床常見標本溶血的血漿fHgb范圍。

溶血和未溶血配對標本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結果均無顯著性差異(P均>0.05，表1)，且均呈高度相關(r均>0.97，P均<0.001)。Bland-Altman圖顯示，溶血和未溶血配對標本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結果差值均較小，大于95%的差值位于一致性界限內，也即溶血和未溶血配對標本的結果一致性良好。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP改變值與fHgb不相關，r分別為-0.176、-0.032、0.131、0.030和-0.160，P分別為0.232、0.829、0.375、0.840和0.277。

表1 溶血和重采未溶血配對標本的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物結果

2.2 體外機械誘導溶血標本

14對標本的常規(guī)凝血試驗在Stago Compact血凝儀上完成，另外16對標本在Sysmex CA 1500血凝儀上完成。誘導溶血標本的血漿fHgb為1.71±1.29 g/L。

誘導溶血前后的PT、APTT、Fbg和FDP結果均無顯著性差異(P均>0.05)，但誘導溶血后較溶血前D-dimer降低(P< 0.001)(表2)，溶血前后的結果均呈高度相關(r均>0.98，P均<0.001)。Bland-Altman圖顯示，誘導溶血前后的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結果差值均較小，大于95%的差值位于一致性界限內，也即誘導溶血前后的結果一致。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP的結果差值與fHgb不相關，r分別為0.068、-0.084、0.108、0.010和-0.160，P 分別為0.722、0.657、0.5705、0.398和0.958。

表2 體外機械誘導溶血前后的的常規(guī)凝血試驗和纖溶標志物結果

3 討論

標本溶血往往是因為采集、運輸過程中方法不當引起的。針頭過細、抽入氣泡、止血帶扎的時間過長以及運輸過程中的不當?shù)仍蚨伎稍斐蓸吮救苎?。標本溶血是較常見現(xiàn)象，約占送達臨床實驗室標本的3%左右[7,11]，約占標本不合格原因的40%-70%[11]。標本體外溶血通過一系列機制影響臨床化學測試結果[11]。標本溶血導致帶負電荷的紅細胞膜磷脂暴露，可能會加速凝血激活，或者與凝血活酶試劑競爭結合因子VII而減慢凝血過程；另一方面，標本溶血會干擾凝血儀對反應終點的測量，從而影響凝血試驗測試結果[6,7]。

Laga AC等[7]的結果表明，溶血標本所釋放的基本上為游離形式，而非結合于微囊形式的血紅蛋白，對凝血系統(tǒng)的活化作用有限；標本溶血可導致外源凝血途徑活化輕度增高(FVIIa和F1+2水平輕度增高)，使臨床溶血標本和機械誘導溶血標本的PT和APTT測試結果縮短，但影響程度較輕，對臨床決定似乎無重要意義。Tang N等[12]報道，雖然機械誘導的溶血會干擾血栓彈力圖的測定，但對常規(guī)凝血試驗(PT、APTT和Fbg)的結果影響甚微，偏差低于美國臨床實驗室修正法案的允許范圍。D'Angelo G等[13]也報道，即使嚴重溶血，對PT和APTT的測定影響很小，但導致Fbg的降低和D-dimer增高，這可能與他們制備溶血液時間過長以及采用凍融程序導致凝血激活有關。

Lippi G等[14]和La'ulu SL等[15]報道，機械誘導的溶血對D-dimer測定造成較小的負性影響。Lippi G等[14]認為，大多數(shù)輕度溶血樣本的D-dimer測定結果可以發(fā)向臨床。

我們的實驗結果表明，臨床溶血和重采未溶血配對標本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結果均無顯著性差異，且均呈高度相關，Bland-Altman圖顯示以上指標的結果差值均較小，也即兩者間的結果一致性良好；體外機械誘導溶血與臨床溶血標本的結果類似，雖然對D-dimer測定造成較輕的負性影響(約降低10%)，但誘導溶血前后D-dimer結果高度相關，Bland-Altman圖顯示結果一致。這可能與機械誘導溶血對凝血系統(tǒng)的活化作用較弱[7]，以及溶血干擾比色法吸光度測定有關。同時也說明體外運輸?shù)葯C械因素導致的標本溶血對常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP的測定結果影響有限，不影響臨床決定。

由于標本溶血是臨床實驗室的較常見現(xiàn)象，對溶血標本重新采集需耗費大量的人力、物力以及時間成本。基于標本溶血對常規(guī)凝血試驗、D-dimer和FDP的測定結果影響有限，應對拒收溶血標本用于常規(guī)凝血測試的規(guī)定進行再評估。

[1]王鴻利.實驗診斷學[M].第2版.北京: 人民衛(wèi)生出版社,2010.

[2]Marlar RA,Clement B,Gausman J.Activated Partial Thromboplastin Time Monitoring of Unfractionated Heparin Therapy: Issues and Recommendations[J].Semin Thromb Hemost, 2017,43(3):253.

[3]Tripodi A.D-dimer testing in laboratory practice[J].Clin Chem,2011,57(9):1256.

[4]Asakura H,Takahashi H,Uchiyama T,et al.DIC subcommittee of the Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis.Proposal for new diagnostic criteria for DIC from the Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis[J].Thromb J,2016,14:42.eCollection 2016.

[5]王鴻利,張利偉,丁秋蘭,等.原發(fā)性纖溶癥的診斷和鑒別診斷[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2008,26(1):2.

[6]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Collection,Transport,and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays,Approved Guideline[S].4th ed.H21-A4; Wayne,PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards,2003,23.

[7]Laga AC,Cheves TA,Sweeney JD.The effect of specimen hemolysis on coagulation test results[J].Am J Clin Pathol,2006,126(5):748.

[8]Lippi G,Montagnana M,Salvagno GL,et al.Interference of blood cell lysis on routine coagulation testing[J].Arch Pathol Lab Med,2006,130(2):181.

[9]Clinical and Laboratory Standards Institute.Collection,Transport,and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline[S],5th ed.H21-A5; Wayne,PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008;28.

[10]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].第3版.南京: 東南大學出版社,2006.

[11]Lippi G,Blanckaert N,Bonini P,et al.Haemolysis: an overview of the leading cause of unsuitable specimens in clinical laboratories[J].Clin Chem Lab Med,2008,46(6):764.

[12]Tang N,Jin X,Sun Z,et al.Effects of hemolysis and lipemia interference on kaolin-activated thromboelastography,and comparison with conventional coagulation tests[J].Scand J Clin Lab Invest,2017,77(2):98.

[13]D'Angelo G,Villa C,Tamborini A,et al.Evaluation of the main coagulation tests in the presence of hemolysis in healthy subjects and patients on oral anticoagulant therapy[J].Int J Lab Hematol,2015,37(6):819.

[14]Lippi G,Avanzini P,Zobbi V,et al.Influence of mechanical hemolysis of blood on two D-dimer immunoassays[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2012,23(5):461.

[15]La'ulu SL,Dominguez CM,Roberts WL.Performance characteristics of the AxSYM D-dimer assay[J].Clin Chim Acta,2008,390(1-2):148.

Theeffectofspecimenhemolysisonroutinecoagulationtestandfibrinolyticmarkerresults

NIEQun,DONGJing,NIELi-ping,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,DapengNewDistrictMaternalandChildrenHealthHospital,Shenzhen518120,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of specimen hemolysis on routine coagulation test (including PT,APTT and Fbg) and fibrinolytic marker (including D-dimer and FDP) results.MethodsRoutine coagulation test and fibrinolytic marker were executed for 48 consecutive hemolyzed patient samples and paired re-collected (within 2 hours) nonhemolyzed specimens,and for randomly collected 30 nonhemolyzed specimens before and after mechanically induced hemolysis.ResultsIn 48 paired patients,there were no statistically significant differences in PT,APTT,Fbg,D-dimer and FDP results between hemolyzed and nonhemolyzed specimens,respectively.In 30 randomly collected specimens,significant differences were not seen in PT,APTT,Fbg and FDP values before and after induced hemolysis.Dimer decreased (361.10±493.40 vs 396.37±494.47 μg/L,P<0.001) after induced hemolysis.Pearson correlation analysis showed high correlation (allr>0.97,P<0.001),and Bland-Altman plot exhibited good agreement,in results of above-mentioned tests between hemolyzed and nonhemolyzed specimens.Differences in the results of above tests were not correlated with the degree of hemolysis (allP>0.05).ConclusionThere was no significant effect of specimens hemolysis on the results of routine coagulation test and FDP.Minor negative effect on D-dimer determination was seen in mechanically induced hemolyzed specimens in vitro,which is unlikely to be considered clinically meaningful.A policy of rejecting hemolyzed specimens for coagulation tests should be reevaluated.

hemolysis;routine coagulation test;D-dimer;FDP

深圳市科技創(chuàng)新委基礎研究資助項目(JCYJ20150403091443282)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2115-04

R331.1

A

2017-06-15)