張 莉，王 堯

(1 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢430074；2 中南民族大學(xué) 檢測與儀器校級工程中心，武漢430074)

基于STM32和LABVIEW的多通道DNA合成儀控制系統(tǒng)的設(shè)計

張 莉1,2，王 堯1,2

(1 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢430074；2 中南民族大學(xué) 檢測與儀器校級工程中心，武漢430074)

將合成DNA的固相亞磷酸酰胺法與自動控制技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計了一款基于STM32的96通道寡核苷酸長鏈的合成儀.該DNA合成儀以STM32F103ZET6 微控制器為主控芯片，接收、處理上位機(jī)發(fā)送的指令，并控制外圍的執(zhí)行單元.人機(jī)交互界面采用LabVIEW 開發(fā)，具有合成序列多通道輸入、工作狀態(tài)監(jiān)控、與主控系統(tǒng)實時通信等功能.該DNA合成儀控制系統(tǒng)可同時實現(xiàn)96 個獨立通道的寡核苷酸長鏈的合成，具有合成效率高、操作界面友好、操作方便等優(yōu)點,完全滿足中小型實驗室及社區(qū)醫(yī)院的堿基合成需求.

磷酸酰胺法；DNA合成儀 ；STM32微控制器

DNA合成技術(shù)在基因及調(diào)控組件的合成、基因回路和生物合成途徑的重新設(shè)計組裝，以及基因組的人工合成等方面都有重要的應(yīng)用[1].21世紀(jì)以來DNA合成技術(shù)發(fā)展迅速,在能源、重大疾病診斷與治療、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，具有巨大的社會效益及經(jīng)濟(jì)效益.

DNA合成儀是設(shè)計用于合成結(jié)構(gòu)上類似DNA的寡核苷酸的自動化儀器，目前高通量DNA合成廣泛采用固相亞磷酸酰胺法合成，它以多孔玻璃為固相載體，微升級體積的不同試劑經(jīng)脫保護(hù)、偶聯(lián)、帶帽和氧化四步反應(yīng)循環(huán)，將核苷酸單體耦合到核苷酸酸鏈上[2-5].該方法具有偶聯(lián)效率高、起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定等優(yōu)點，可用于固相合成并實現(xiàn)自動化.

DNA合成儀是實現(xiàn)DNA合成過程自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)手段.目前國內(nèi)進(jìn)行批量合成使用的多通道DNA合成儀均以少于96通道合成為主，產(chǎn)品更新?lián)Q代慢，且尚未有國產(chǎn)多通道高通量DNA合成儀問世[6].中國是世界自動化分析檢測儀器最重要的市場之一，對于高通量多通道的DNA合成儀還大量依賴進(jìn)口，而進(jìn)口DNA合成儀價格昂貴、維護(hù)成本高、維修周期長.進(jìn)口儀器合成過程繁雜，對于非專業(yè)的操作人員很難在短時間內(nèi)配置好所需參數(shù)，用戶無法根據(jù)需求靈活設(shè)置.為此，本文設(shè)計了一款操作界面簡單靈活，人性化的多通道高通量DNA合成儀，該合成儀可以在96孔反應(yīng)板的每一孔獨立實現(xiàn)寡核苷酸長鏈的合成.

1 系統(tǒng)總體設(shè)計

DNA合成儀主要由軟件系統(tǒng)、STM32中央控制器、傳動系統(tǒng)、氣路系統(tǒng)、液路系統(tǒng)五大部分組成.STM32中央控制器它是連接傳動系統(tǒng)、氣路系統(tǒng)、液路系統(tǒng)之間的橋梁，負(fù)責(zé)傳動系統(tǒng)在指定位置完成相應(yīng)的動作，控制氣路、液路的加壓排液和保證合成反應(yīng)所需的氣壓和環(huán)境，將反饋信息通過特定的通信協(xié)議傳送給控制軟件，接收控制軟件的命令并執(zhí)行；傳動系統(tǒng)負(fù)責(zé)把電磁閥板傳送到與合成版孔的相對位置；氣路系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)試劑瓶、堿基瓶精確壓力控制，氣路整體的加壓排液控制，合成反應(yīng)惰性環(huán)境的控制，各路電磁閥板加液時試劑所需壓強(qiáng)和不合成時對廢液及洗滌液的壓力控制等；液路系統(tǒng)的主要功能是把參與合成反應(yīng)的10種試劑分別一分為8路液體輸出管路；軟件系統(tǒng)是DNA合成儀的核心，是決定其合成效率、合成效果的關(guān)鍵因素，基于labview開發(fā)的控制軟件完成用戶對合成板指定板孔的選擇、對指定板孔的合成序列的輸入,輸入堿基序列參數(shù)解析后通過RS485通訊協(xié)議把相關(guān)電磁閥開關(guān)指令信息分步驟傳送給STM32控制系統(tǒng).其系統(tǒng)整體框圖如圖1所示.

圖1 系統(tǒng)整體框圖Fig.1 Overall system block diagram

2 控制系統(tǒng)設(shè)計

2.1 氣路控制系統(tǒng)的設(shè)計

DNA合成儀合成試劑需要保持內(nèi)外氣體隔絕且需要在一定壓強(qiáng)下才能達(dá)到更高的耦合率，因此氣路系統(tǒng)整體的密閉性、對氣壓控制優(yōu)劣性直接決定所需合成引物的合成效率.氣路系統(tǒng)設(shè)計主要包括合成試劑瓶精確壓力控制、合成反應(yīng)倉惰性環(huán)境控制、各分流氣路的加壓排液控制、對洗滌液和廢液外排氣路控制等.合成反應(yīng)試劑通過多級氣壓計和壓力開關(guān)的檢測，與多路高精度的微流體調(diào)壓閥相結(jié)合，保證了各氣路壓強(qiáng)穩(wěn)定在微小的波動范圍內(nèi).在合成反應(yīng)倉處我們配備了加壓和減壓的氣壓閥，保證合成所需壓強(qiáng)環(huán)境，當(dāng)合成完畢，反應(yīng)倉先排氣降壓再排液.其氣路系統(tǒng)設(shè)計如圖2所示.

2.2 液路控制系統(tǒng)的設(shè)計

固相亞磷酸酰胺法是目前最常用的DNA固相合成方法，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物穩(wěn)定等特點[3].該方法主要步驟是脫保護(hù)基、縮合反應(yīng)、帶帽反應(yīng)、氧化反應(yīng)，四個步驟循環(huán)完成DNA鏈的合成.該合成策略也是本文DNA合成儀設(shè)計的主要依據(jù)之一.在合成過程中會涉及到十種試劑(試劑1，試劑2，試劑3，試劑4，試劑A,試劑T,試劑G，試劑C,試劑5，試劑6)參與反應(yīng)，試劑的添加次序依次是：試劑1-4-所需堿基(A、T、G、C)-5-6.我們將每種試劑一分為8路，對應(yīng)96反應(yīng)孔板的8行，每一路連接一個電磁閥，這樣10種試劑被分成8×10路，由8×10個電磁閥組成了液路系統(tǒng).8×10電磁閥組中每個電磁閥開關(guān)都是獨立的，由控制器根據(jù)合成需要打開相應(yīng)的電磁閥開關(guān).本液路控制系統(tǒng)選用了密封型好、無內(nèi)部容積結(jié)構(gòu)、耐腐蝕的隔膜電磁閥為控制載體來保證每一路的液體流量的均一性.設(shè)計原理如圖3所示.

圖2 氣路系統(tǒng)設(shè)計Fig.2 Gas path system design

圖3 液路系統(tǒng)設(shè)計Fig.3 Fluid system design

2.3 傳動控制系統(tǒng)設(shè)計

合成DNA時，裝有10種合成試劑的8×10的電磁閥板在8×12的合成孔板上方來回運動，完成每個版孔的試劑添加.電磁閥板有10列，合成孔板有12列，電磁閥板從第一列與合成板孔第一列對齊，到電磁閥板第十列完全走出合成孔板需要22步，因此我們把步進(jìn)電機(jī)運動22步規(guī)定為一趟，而來回的趟數(shù)由用戶輸入的最長的堿基序列數(shù)決定.每一列的8路試劑出液口和96合成孔板具體某一列相對位置的定位精度是決定傳動系統(tǒng)是否滿足要求的最重要衡量標(biāo)準(zhǔn)，為提高傳動系統(tǒng)重復(fù)運動定位精度，我們在傳動系統(tǒng)運動的起點和終點處都設(shè)定了重復(fù)定位精度達(dá)到0.1mm光電傳感器，并設(shè)計了減少電機(jī)負(fù)載，每次合成前重新校準(zhǔn)原點位置等步驟.首先，傳動系統(tǒng)啟動前，氣路系統(tǒng)會在傳動系統(tǒng)兩端進(jìn)氣口加壓，一來趕走傳動系統(tǒng)內(nèi)部的空氣，保證合成所需惰性氣體的條件；二來傳動系統(tǒng)受氣壓反作用力處于半懸空狀態(tài)，減小電機(jī)來回運動時的阻力.然后，步進(jìn)電機(jī)搜尋起點光電開關(guān)定原點，待原點確定后，控制系統(tǒng)控制電機(jī)運動到第一步合成的位置，此時，電磁閥板的第一列和96孔板的第一列一上一下地對齊.第一步合成完后電機(jī)運動到第二步合成位置.第二步合成位置電磁閥板的第一列和96孔板的第二列、電磁閥板的第二列和96孔板的第一列一上一下地對齊.第二步合成完后電機(jī)運動到第三步合成位置,如此依次走完第一趟(22步)所有步數(shù)后，電機(jī)繼續(xù)向右運動到終點光電開關(guān)位置，表示第一趟合成完成，之后再重新回到原點位置等待合成指令.設(shè)計原理圖如圖4所示.

圖4 傳動系統(tǒng)設(shè)計Fig.4 Transmission system design

3 軟件系統(tǒng)設(shè)計

系統(tǒng)軟件與硬件電路密切結(jié)合是實現(xiàn)儀器精確穩(wěn)定運行的必要條件.本儀器是集機(jī)械自動化、計算機(jī)實時狀態(tài)監(jiān)控和數(shù)據(jù)存儲分析于一體的系統(tǒng)[7].要求系統(tǒng)軟件完成：用戶可以在人機(jī)界面的96孔板中任意選擇并輸入需要合成的DNA堿基序列、穩(wěn)定準(zhǔn)確執(zhí)行上位機(jī)發(fā)出的指令、實時處理收發(fā)數(shù)據(jù)、顯示下位機(jī)的運行狀態(tài)同時將與合成進(jìn)程相關(guān)的數(shù)據(jù)回傳給上位機(jī).為此，課題組提出軟件系統(tǒng)設(shè)計方案，軟件系統(tǒng)分為上位機(jī)軟件系統(tǒng)和下位機(jī)軟件系統(tǒng).

3.1 下位機(jī)軟件系統(tǒng)設(shè)計

在主控STM32上和在步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動板TMCM-351運行的軟件即為下位機(jī)軟件.STM32基于Keil MDK4的開發(fā)環(huán)境采用C語言編譯、TMCM-351采用TMCL語言開發(fā).下位機(jī)軟件根據(jù)功能可分為以下幾大模塊.

(1)參數(shù)設(shè)定.電機(jī)根據(jù)負(fù)載的情況和運行的速度需要設(shè)定其電機(jī)的參數(shù)，在TMCM-351軟件上我們需設(shè)定傳動系統(tǒng)步進(jìn)電機(jī)的細(xì)分參數(shù)、最大加速度、規(guī)定正負(fù)(正為右方向負(fù)為左方向)、電機(jī)來回運行的速度等參數(shù).

(2)歸零.儀器上電開始后，程序首先會搜索零點并置零.零點位置的確定說明儀器處于起始狀態(tài)，零點的確定對后面每一步合成的位置都有決定性的作用.

(3)定位流程.DNA合成儀每一趟分為22合成步驟，每一個合成步驟都有其具體的位置信息.當(dāng)步進(jìn)電機(jī)運行到當(dāng)前合成位置時，下位機(jī)會立刻將其位置信息反饋給上位機(jī)，然后上位機(jī)再發(fā)送當(dāng)前合成步驟電磁閥的開關(guān)指令給下位機(jī)處理.

(4)指令處理.下位機(jī)在合成過程中會處理上位機(jī)發(fā)送的三種指令：1) 合成開始指令，下位機(jī)收到開始指令后會立刻控制電機(jī)運動到合成開始位置并把位置信息反饋給上位機(jī)；2) 電磁閥開關(guān)指令，步進(jìn)電機(jī)每到達(dá)一次合成位置，上位機(jī)會發(fā)送相應(yīng)的電磁閥開關(guān)指令，主控會處理這些指令并轉(zhuǎn)換成高低電平信號控制電磁閥開閉和時間；3) 合成結(jié)束指令，下位機(jī)收到后會控制步進(jìn)電機(jī)走到終點位置，表示整個DNA合成過程結(jié)束.

3.2 上位機(jī)軟件系統(tǒng)設(shè)計

上位機(jī)開發(fā)基于LabVIEW 2015圖形化編程開發(fā)平臺，它由前面板和程序框圖組成.前面板用來設(shè)置用戶需要合成的堿基序列和顯示合成步驟，程序框圖用于編寫和顯示程序源代碼.

上位機(jī)軟件設(shè)計主要由以下6大模塊組成：(1)板孔選擇：用戶可以對96孔板任意選定.(2)序列輸入：當(dāng)用戶完成對板孔數(shù)的選擇后，需要對每個已經(jīng)被選擇的板孔進(jìn)行合成序列輸入(合成序列由A,T,G,C組成且每條序列長度不能超過30).(3)合成進(jìn)程設(shè)置：用戶完成輸入后，上位機(jī)會根據(jù)算法生成每一步的電磁閥開關(guān)指令.同時會根據(jù)步進(jìn)電機(jī)反饋的位置信息來判斷合成進(jìn)程.(4)流程指令存儲：DNA合成儀是分趟數(shù)分步驟來合成想要合成的序列，因此需要把還沒執(zhí)行到的指令代碼存儲起來.(5)串口通信、流程執(zhí)行模塊：用采用VISA串口通信的方式，上位機(jī)選擇串口實現(xiàn)與下位機(jī)連接通信，收發(fā)指令；流程的開始、結(jié)束指令根據(jù)下位機(jī)反饋的信息來決定.(6)狀態(tài)監(jiān)測：上位機(jī)會不斷根據(jù)下位機(jī)反饋的信息來監(jiān)測下位機(jī)的運行狀況.其上位機(jī)控制軟件界面如圖5所示.

圖5 上位機(jī)控制軟件界面Fig.5 Upper computer control software interface

上位機(jī)軟件主要實現(xiàn)以下功能：(1)串口通信功能:依據(jù)485通信協(xié)議經(jīng)由USB轉(zhuǎn)485串口與下位機(jī)進(jìn)行通信，上位機(jī)實時獲取下位機(jī)運行狀態(tài)，同時下位機(jī)回傳與合成進(jìn)程相關(guān)的數(shù)據(jù)給上位機(jī).(2)數(shù)據(jù)處理功能：當(dāng)用戶完成堿基序列輸入步驟后，第一步：上位機(jī)會提取出所有輸入版孔的第一個堿基組成一個新的堿基序列的二維數(shù)組，新組成的二維數(shù)組每一個元素保留其所在原來輸入版孔的行和列信息.再根據(jù)下位機(jī)反饋的位置信息提取出新組成的二維數(shù)組對應(yīng)的堿基列.到達(dá)第一個位置時提取二維數(shù)組中含有第一列信息的所有元素并按照一個元素對應(yīng)固定的十步指令分步驟把開關(guān)信息發(fā)送給下位機(jī)，到達(dá)第二個位置時提取二維數(shù)組中含有第一列信息和第二列信息的所有元素按照固定算法把開關(guān)信息發(fā)送給下位機(jī)……依次處理完所有信息.上位機(jī)根據(jù)不同的堿基序列輸入，完成對合成序列解析，再分步驟解析出相對應(yīng)的電磁閥開關(guān)指令并發(fā)送給下位機(jī).(3)指令的發(fā)送：電磁閥開關(guān)指令的發(fā)送是分躺數(shù)分不同位置信息的，趟輸由用戶最長堿基序列長度決定，第一趟發(fā)送的是所有輸入版孔中的首個堿基的開關(guān)信息.而每一趟又分為22步，就說明每一趟有22個位置信息，同一堿基不同位置信息會對應(yīng)不同的開關(guān)指令.其上位機(jī)軟件流程圖如圖6所示.

圖6 上位機(jī)軟件流程圖Fig.6 Upper computer software flow chart

4 結(jié)語

本文設(shè)計的DNA合成儀控制系統(tǒng)可同時實現(xiàn)96 個獨立通道的寡核苷酸長鏈的合成.基于LabVIEW開發(fā)的上位機(jī)軟件功能齊備，操作界面美觀友好，數(shù)據(jù)處理和轉(zhuǎn)換方便.基于STM32開發(fā)的下位機(jī)高效可靠，對上位機(jī)指令處理迅速準(zhǔn)確，控制電機(jī)和捕獲光電開關(guān)觸發(fā)信號及時穩(wěn)定.由于DNA合成儀的重復(fù)工作量大，長時間運行后定位系統(tǒng)的精確度和每次打開電磁閥組排出液體的均一性還需要不斷完善.

[1] 邢玉華，譚俊杰，李玉霞，等. 合成生物學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2012，7(5):357-363.

[2] 熊 燕，陳大明，楊 琛，等. 合成生物學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀與前景[J]. 生命科學(xué)，2011, 23(9):826-837.

[3] 馮 淼，王 璐，田 敬. 基因合成技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報，2013，29(8):1075-1085.

[4] 王 霞，趙 鵑，李炳志，等. DNA合成技術(shù)及應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)，2013，25(10):993-999.

[5] 高朝輝.基因合成方法的改進(jìn)與驗證 [D]. 長春: 吉林大學(xué)，2008.

[6] 梁曉會，黃傳偉，郭 劍. 多通道高通量DNA合成儀控制系統(tǒng)設(shè)計與實現(xiàn)[J]. 軍事醫(yī)學(xué)， 2015，39(8):571-576.

[7] 萬 娟，張 莉，張冰洋. 基于TMCM-6110和LabVIEW的全自動酶聯(lián)免疫前處理儀的設(shè)計[J]. 制造業(yè)自動化，2016, 38(10):1-6.

DesignofMulti-ChannelDNASynthesizerControlSystemBasedonSTM32andLabVIEW

ZhangLi1,2,WangRao1,2

(1 College of Biomedical Engineering,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China;2 Testing and Instrumentation Engineering Center,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China)

Combining solid phase phosphoramidite method of DNA synthesis with automatic control technology, a DNA synthesizer of 96 oligonucleotides long chain is designed based on STM32. The core of DNA synthesizer is STM32F103ZET6 microcontroller, who is used for receiving and processingrecinstruction from upper computer, and controlling peripheral circuit module.Based on LabVIEW development platform, application software ofupper computer is built, which has function of synthetic sequence multichannel input,working state monitoring and real-time communication with control system. The DNA synthesizer researched in this paper can achieve composition of 96 independent channel oligonucleotides long chain at the same time. It has many advantages, such as high synthetic efficiency, friendly operation interface, and easy operation mode. The DNA synthesizer can fully satisfy requirement of base composition of small and medium-sized laboratory and community hospital.

phosphoramidite；DNA synthesizer；STM32microcontroller

2017-02-27

張 莉(1972-)，女，教授，博士，研究方向：激光物理、非線性系統(tǒng)的隨機(jī)動力學(xué)、信號檢測與處理、光電檢測與醫(yī)療儀器相關(guān)技術(shù)研發(fā)，E-mail: Zhangli1996@163.com

國家自然科學(xué)基金資助項目(81101080)

TP273

A

1672-4321(2017)04-0078-06