張 蕊，司曉棠，白 蘭，何 輝，覃 瑞

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074；2 武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072)

白細(xì)胞介素32通過5′-LTR抑制HIV復(fù)制

張 蕊1，司曉棠1，白 蘭2，何 輝2，覃 瑞1

(1 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074；2 武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072)

目的：探討白細(xì)胞介素32(IL-32)抑制HIV病毒復(fù)制的機(jī)制.方法：利用熒光色素酶活性測定篩選抑制HIV復(fù)制最顯著的IL-32亞型，通過構(gòu)建HIV的LTR系列截?cái)噘|(zhì)粒和TAR莖環(huán)結(jié)構(gòu)的系列點(diǎn)突變質(zhì)粒，確定IL-32抑制HIV復(fù)制作用的位點(diǎn).結(jié)果：在Hela、Jurkat、293T三個(gè)細(xì)胞系中，IL-32γ和IL-32ε兩種亞型對HIV的抑制作用最顯著.在Hela細(xì)胞系中證實(shí)IL-32可通過抑制HIV 5′-LTR的活性抑制HIV復(fù)制，確定TAR形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在此過程中起重要作用.IL-32與TAR結(jié)構(gòu)相互作用的位點(diǎn)定位在TAR的環(huán)狀和半環(huán)狀處.結(jié)論：IL-32能抑制HIV復(fù)制，可作為HIV治療的潛在手段.

白細(xì)胞介素32；人免疫缺陷病毒 ；長末端重復(fù)序列

白細(xì)胞介素32(簡稱IL-32)，因在自然殺傷細(xì)胞(NK)內(nèi)大量表達(dá)而被命名為自然殺傷細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本4(NK4)[1].由美國科羅拉多大學(xué)健康科學(xué)中心醫(yī)學(xué)部的Kim等[2]于2005年在用基因芯片方法篩選IL-18可誘導(dǎo)基因時(shí)鑒定的一種白細(xì)胞介素.IL-32 為前炎癥細(xì)胞因子，可介導(dǎo)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)[3].在多種病毒感染性疾病中IL-32表達(dá)水平都相應(yīng)增高，而IL-32可抑制流感病毒和乙肝病毒的復(fù)制[4].IL-32基因含有8個(gè)小外顯子，由外顯子的選擇性拼接產(chǎn)生7類剪切亞型：IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、IL-32ζ和IL-32η[5](見圖1).各種剪接異構(gòu)體中只有IL-32γ具有一個(gè)長度為31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，為一種分泌型蛋白，與NK4的特征一致.多項(xiàng)研究均表明，IL-32γ在誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)和抗病毒方面具有比其他亞型更高的活性.

圖1 白細(xì)胞介素-32各亞型的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of IL-32 subtypes

人免疫缺陷病毒(HIV)是一種可以感染CD4細(xì)胞從而導(dǎo)致獲得性免疫功能喪失綜合癥(AIDS)的逆轉(zhuǎn)錄病毒. HIV 的5′端和3′端的長末端重復(fù)序列(LTRs)幫助病毒整合至宿主基因組，對病毒基因的表達(dá)和病毒的復(fù)制具有調(diào)節(jié)作用，結(jié)構(gòu)為U3-R-U5(見圖2).5′LTR區(qū)域從-454到+181，U3和R區(qū)包括4個(gè)功能域：遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)單位從-454到-104，其中包含負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)(NRE)從-340到-184；增強(qiáng)子單位從-105到-79；核心啟動(dòng)子單位從-78到-1；Tat反應(yīng)元件(TAR)從+1到+59.U5之后為gag引導(dǎo)序列(GLS).TAR反應(yīng)元件具有穩(wěn)定的莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括4段莖區(qū)，1個(gè)半環(huán)和1個(gè)環(huán)狀區(qū)，這樣的結(jié)構(gòu)對與病毒反式因子Tat蛋白結(jié)合非常關(guān)鍵.半環(huán)部被認(rèn)為是與Tat蛋白的結(jié)合部位，而環(huán)狀部結(jié)合其他細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，莖區(qū)也可結(jié)合少數(shù)細(xì)胞因子[6].

感染HIV后會(huì)引起感染人群的多種免疫缺陷，同時(shí)多種重要的免疫因子表達(dá)水平也發(fā)生了變化，這些細(xì)胞因子會(huì)引發(fā)體內(nèi)進(jìn)行自身免疫調(diào)節(jié)，導(dǎo)致自身的分泌增多、減少甚至于不分泌，如很多促炎癥因子TNF-α/IL-1、IL-6、IFN-α/β、INF-γ的表達(dá)均隨之升高[7-9].

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑和儀器

人宮頸癌細(xì)胞系Hela、人腎上皮細(xì)胞系293T和人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat均來源于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心.IL-32各亞型質(zhì)粒由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存.HIV突變型克隆PNL-4-3-

R-E-和HIV長末端重復(fù)序列pGL3-LTR-luc為Sahibzada T. Rasool博士饋贈(zèng).Renilla luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒(Promega)，KOD-plus polymerase(TOYOBO)，Lipofectamine2000(Invitrogen), 熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(Roche)，MluI和Hind III(TAKARA)，DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO). 熒光測定儀(Chemi Doc MP System, Bio-Rad),電轉(zhuǎn)儀(4D/II Nucleofector型, LONZA).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela與293T細(xì)胞均采用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)[10].Jurkat細(xì)胞采用含有10%FBS的1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng).

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建

HIV-LTR系列截?cái)噘|(zhì)粒均以pGL3-LTR-luc質(zhì)粒為模板，依據(jù)長度遞減通過以下引物進(jìn)行擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化和鑒定方法參考文獻(xiàn)[11]，再利用引入的MluI和Hind III構(gòu)建而來，具體設(shè)計(jì)見圖2和表1.

圖2 HIV的5′-LTR結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure of 5′-LTR of HIV

目的基因上游(5'-3')下游(5'-3')LTR-T1(-340～+60)5'-TCAACGCGTATCCACTGACCTTTG-3'5'-GCGAAGCTTTTTATTGAGGCTTAAG-3'LTR-T2(-184～+60)5'-CATACGCGTGCCTCCTAGCATTTCG-3'5'-GCGAAGCTTTTTATTGAGGCTTAAG-3'LTR-T3(-105～+60)5'-TATACGCGTGGGACTTTCCGCTGGG-3'5'-GCGAAGCTTTTTATTGAGGCTTAAG-3'LTR-T4(-78～+60)5'-TATACGCGTGAGGTGTGGCCTGGGC-3'5'-GCGAAGCTTTTTATTGAGGCTTAAG-3'LTR-T5(-1～+60)5'-CATACGCGTGGTCTCTCTGGTTAG-3'5'-GGGAGGTGTGGCCTGGGCGGGACTG-3'LTR-AC(-454～-1)5'-GCGAAGCTTTTTATTGAGGCTTAAG-3'5'-ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCA-3'

HIV-LTR中TAR莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)系列突變質(zhì)粒均以pGL3-LTR-luc質(zhì)粒為模板，利用保真度高的KOD-plus polymerase通過以下引物采用一步法進(jìn)行擴(kuò)增，具體設(shè)計(jì)見表2和圖3.

表2 TAR系列突變質(zhì)粒引物序列

圖3 HIV 5′-LTR中TAR莖環(huán)結(jié)構(gòu)的系列突變 Fig.3 A series of mutations in TAR hairpin structure in 5′-LTR of HIV

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測

Hela與293T采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染前1 d按40%～60%的密度接種到24孔板中，37℃培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)到80%～95%.每個(gè)24孔板的孔中轉(zhuǎn)染0.8 μg質(zhì)粒.轉(zhuǎn)染后將培養(yǎng)板放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，棄培養(yǎng)板中的液體，加入含血清和抗生素的全培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，48～72 h后檢測.Jurkat采用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染.熒光素酶活性采用熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒通過熒光測定儀進(jìn)行檢測，并以Renilla luciferase的報(bào)告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參基因保證實(shí)驗(yàn)的可靠性.

2 結(jié)果

2.1 IL-32各亞型對HIV復(fù)制的抑制作用

PNL-4-3-E-R-質(zhì)粒是HIV突變型質(zhì)粒，不具有感染性但保持了HIV復(fù)制的特性.本文利用PNL-4-3-E-R-在3種人源細(xì)胞系內(nèi)，對IL-32與HIV復(fù)制的關(guān)系進(jìn)行了觀察，結(jié)果見圖4.由圖4a、4c、4e可見，大部分IL-32亞型能抑制PNL-4-3-E-R-復(fù)制，但在不同細(xì)胞系抑制作用有差異.在Hela細(xì)胞系中IL-32γ和IL-32ε兩種亞型對HIV復(fù)制的抑制作用最為突出.在293T細(xì)胞系中抑制作用最顯著的是IL-32γ、IL-32ε和IL32-α.在Jurkat細(xì)胞中IL-32γ、IL-32ε和IL32-β三種亞型的作用非常顯著.綜上，IL-32亞型中活性最顯著的兩個(gè)亞型：IL-32γ和IL-32ε對HIV復(fù)制的抑制作用最為顯著.

a,b) Hela細(xì)胞;c,d) 293T細(xì)胞;e,f) Jurkat細(xì)胞圖4 IL-32各亞型對HIV PNL-4-3-E-R- 和5′-LTR活性的抑制作用Fig.4 Suppression effect of IL-32 subtypes on the activity of PNL-4-3-E-R- and 5′-LTR in HIV

HIV的LTR區(qū)在HIV復(fù)制過程中的作用與啟動(dòng)子類似，主要是各種轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合形成特殊結(jié)構(gòu)的復(fù)合物.推測IL-32可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子與LTR的相關(guān)作用來抑制HIV復(fù)制.用IL-32各亞型與pGL3-LTR-luc共轉(zhuǎn)染后，得到了與共轉(zhuǎn)染PNL-4-3-E-R-相類似的結(jié)果(見圖4b、4d、4f)，即IL-32各亞型均可抑制HIV的LTR活性，尤以IL-32γ和IL-32ε兩種亞型作用明顯.而IL-32γ是IL-32各亞型中活性最強(qiáng)的亞型[5].綜上，選取IL-32γ為研究對象，由于IL-32γ在Hela細(xì)胞系中抑制作用最為明顯，而Jurkat細(xì)胞的特性導(dǎo)致轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率特別低，后續(xù)試驗(yàn)均在Hela細(xì)胞系中進(jìn)行.

2.2 IL-32劑量對HIV5′-LTR活性的影響

選擇抗病毒活性最強(qiáng)的IL-32γ為研究對象的代表，在Hela細(xì)胞系中，在共轉(zhuǎn)染的pGL3-LTR-luc保持一定的情況下，依次增加IL-32的濃度，檢測其對HIV 5′-LTR活性的影響，結(jié)果見圖5.由圖5可見，隨著IL-32劑量的增加， HIV 5′-LTR活性依次降低，說明IL-32對HIV 5′-LTR 活性的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性.

圖5 Hela細(xì)胞系中不同劑量IL-32對HIV 5′-LTR活性的抑制作用Fig.5 Inhibition of HIV 5′-LTR activity by IL-32 with various doses in Hela cell lines

2.3 IL-32與5′-LTR的相互作用位點(diǎn)分析

HIV的5′-LTR結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，有多個(gè)功能區(qū)，如Modulatory，Enhancer，Core和TAR區(qū)(見圖2).先確認(rèn)IL-32對LTR作用的主要區(qū)域，再根據(jù)LTR的功能分區(qū)，依次對LTR進(jìn)行了截?cái)?，?gòu)建了一系列的截?cái)噘|(zhì)粒. IL-32對HIV 系列截?cái)?′-LTR片斷活性的影響結(jié)果見圖6.由圖6可見，與IL-32γ共轉(zhuǎn)染之后，每個(gè)區(qū)域在這個(gè)過程中都可能起到了一定的作用，但當(dāng)將TAR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)截?cái)嗪?，IL-32對LTR的抑制作用獲得了極大的回復(fù)，提示在IL-32與LTR相互作用的過程中，TAR的莖環(huán)結(jié)構(gòu)起到了極為關(guān)鍵的作用.

圖6 IL-32對HIV 系列截?cái)?′-LTR片斷活性的影響Fig.6 Effect of IL-32 on truncated mutants of HIV′ 5′-LTR

2.4 IL-32與TAR作用位點(diǎn)為環(huán)狀處和半環(huán)處

TAR的序列及形成的相應(yīng)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)的形成是由其中莖狀處的幾段互補(bǔ)序列的配對互補(bǔ)形成(見圖3).Vrolijk等[12]的研究確認(rèn)環(huán)狀處和半環(huán)處的幾個(gè)點(diǎn)突變對TAR的活性影響不大. IL-32對HIV的TAR結(jié)構(gòu)的各突變體活性的影響結(jié)果見圖7.由圖7可見，在同等的活性情況下，在環(huán)狀和半環(huán)狀處同時(shí)進(jìn)行點(diǎn)突變(TARm1)，IL-32對LTR的抑制作用得到了極大的回復(fù)，而僅僅在環(huán)狀處(TARm2)或者半環(huán)狀處(TARm3)進(jìn)行點(diǎn)突變，并不能削弱IL-32的抑制作用.同樣，在莖狀部位進(jìn)行一處或多處點(diǎn)突變也不能削弱IL-32對LTR的抑制作用.因此得到結(jié)論，IL-32作用于LTR時(shí)，TAR的環(huán)狀處和半環(huán)狀處在IL-32抑制HIV復(fù)制過程中不可缺少.而TAR的半環(huán)部是與Tat蛋白的結(jié)合部位，而環(huán)狀部結(jié)合其他細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子[6]，提示IL-32抑制HIV復(fù)制與抑制Tat蛋白與TAR的結(jié)合有關(guān).

圖7 IL-32對HIV的TAR結(jié)構(gòu)的各突變體活性的影響Fig.7 Effect of IL-32 on mutants of TAR structure in HIV

3 討論

Rasool等[13]發(fā)現(xiàn)HIV病人血清中IL-32表達(dá)水平明顯高于健康人群，平均高出78%，并且初步觀察到在用si-RNA將內(nèi)源性的IL-32表達(dá)水平降低后，HIV的復(fù)制水平顯著上升.提示IL-32與HIV復(fù)制有著密切相關(guān)性. IL-32具有抗流感病毒、乙肝病毒等多種病毒的作用，因此IL-32對HIV的抑制作用及其機(jī)理正是本文探討的方向.

IL-32具有多種亞型，本文先在三種人源細(xì)胞系中證實(shí)IL-32具有活性的亞型均能夠降低HIV的復(fù)制水平，而活性最強(qiáng)的IL-32γ和IL-32ε抑制作用最為顯著.同時(shí)，IL-32對HIV的5′-LTR活性的降低趨勢與IL-32抑制HIV復(fù)制的趨勢保持一致，推斷IL-32抑制HIV復(fù)制的一條途徑是通過抑制LTR活性.由于LTR結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，通過對每個(gè)功能區(qū)的截?cái)鄬?shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LTR中TAR 形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在此過程中起重要作用，沒有TAR結(jié)構(gòu)的存在，IL-32對LTR的活性增強(qiáng)了接近10倍.

進(jìn)一步對TAR結(jié)構(gòu)的不同部位進(jìn)行點(diǎn)突變時(shí)，證實(shí)是TAR的環(huán)狀和半環(huán)狀在IL-32抑制LTR活性中起著不可或缺的作用，且當(dāng)兩個(gè)部位同時(shí)進(jìn)行突變時(shí)才能將IL-32的抑制作用遏止，依然沒有TAR整個(gè)缺失的影響大，故推斷其他部位也參與了整個(gè)過程.所以IL-32通過與LTR的TAR的環(huán)狀和半環(huán)狀的相互作用抑制了LTR活性進(jìn)而降低了HIV復(fù)制水平.最近El-Far等[14]報(bào)道，在HIV慢性感染人群中IL-32可作為慢性感染控制失敗的標(biāo)志物，即IL-32的增多并不能抑制HIV復(fù)制，提示IL-32不直接抑制HIV復(fù)制，而是通過刺激合成更多的免疫細(xì)胞因子去抵抗HIV.在IL-32 與HIV的相互作用的過程中可能存在多種機(jī)制，在不同的情況下，兩者之間的關(guān)系甚至還會(huì)逆轉(zhuǎn)，這也是后續(xù)研究的方向.但I(xiàn)L-32在此進(jìn)程的作用不容置疑，也將是不容忽視的一個(gè)標(biāo)志物.

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SuppressionofHIVReplicatonbyInterleukin-32via5′-LTR

ZhangRui1，SiXiaotang1，BaiLan2，HeHui2，QinRui1

(1 College of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China；2 College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430074，China)

Objective: To investigate the mechanism of interleukin 32 (IL-32) inhibition of HIV replication. Methods: The most significant IL-32 subtype of HIV replication was screened by luciferase activity assays. By constructing a series of HIV plasmids containing LTR truncated mutations and point mutations of TAR hairpin,the site of IL-32 inhibition on HIV replication was determined. Results: In the three cell lines of Hela, Jurkat and 293T, IL-32γ and IL-32ε subtypes had the most significant inhibitory effects on HIV. In Hela cell line, it was confirmed that IL-32 could suppress HIV replication by inhibiting the activity of HIV 5′-LTR, with the hairpin structure formed by TAR playing an important role in this process. The action site of IL-32 interaction with TAR structure was located at the ring and the half ring of TAR. Conclusion: IL-32 can inhibit HIV replication as a potential means of HIV treatment.

interleukin-32(IL-32)；human immunodeficiency virus(HIV)；long terminal repeat(LTR)

2017-06-05

張 蕊(1982-)，女，工程師，博士，研究方向：微生物學(xué)、營養(yǎng)學(xué)，E-mail：Zhangrui@mail.scuec.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81402668)

Q932

A

1672-4321(2017)04-0040-05