冷迎慧

（青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院青海西寧810016）

膠原蛋白的重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)研究

冷迎慧

（青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院青海西寧810016）

膠原蛋白是一種所有的細胞生物都含有和動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，應用十分廣泛，近幾年，人們試圖用重組發(fā)酵技術生產(chǎn)膠原蛋白，本篇文章對膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及重組微生物發(fā)酵工藝等進行了綜述。

膠原蛋白；發(fā)酵；微生物

膠原蛋白被認為是動物體內(nèi)含量最高的一類蛋白質(zhì)，幾乎所有的細胞生物都含有膠原蛋白。膠原蛋白廣泛存在于皮膚、肌肉、骨骼中，應用廣泛。例如可以添加入化妝品、飼料中，可以用于整容手術、臨床止血，還可以作為醫(yī)學生物材料、組織支架材料等。目前膠原蛋白的需求量逐年增加，但是膠原蛋白的提取方法限制了它的大批量生產(chǎn)，采用基因工程的手段，使用發(fā)酵工程表達目的基因產(chǎn)物成為解決這一問題的有效措施。

1 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)功能及生產(chǎn)

1.1 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。膠原蛋白結(jié)構(gòu)為三股相互纏繞的多肽鏈組成的長且穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)膠原蛋白的三條氨基酸鏈組合的方式不同，膠原蛋白被分為I、II、III等多種類型，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)28種[1～3]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由于其初級結(jié)構(gòu)的組合方式不同導致其呈現(xiàn)不同的形態(tài)，進而表現(xiàn)出一些功能不同的生物學性質(zhì)。早在1951年，美國的Paining便已經(jīng)闡述了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。麻省理工學院的Buehler在2006年再一次在納米水平上詳解了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)[4，5]。據(jù)研究，膠原蛋白具有一定的生物活性且不溶于水，因此一般情況下不能被蛋白酶利用，而在酸、堿、高溫的條件下，會因為降解而發(fā)生性質(zhì)的改變[6]，明膠可以為蛋白酶所利用。

1.2 膠原蛋白的功能。膠原蛋白對哺乳動物來說十分重要且含量多，具有很多生理調(diào)節(jié)功能。主要包括：①免疫作用。調(diào)節(jié)人體的免疫力、抗氧化等。②保健作用。降血壓、防止貧血等。③美容作用。減肥、促進皮膚代謝等。④助吸收。保護胃黏膜、協(xié)助母乳分泌等。⑤其他作用。預防和治療骨質(zhì)疏松癥、緩解關節(jié)疼痛等。有些研究顯示，缺少膠原蛋白或蛋白分子缺失會導致人機體性能的改變，導致很多疾病的發(fā)生，比如血管基質(zhì)的動脈粥狀硬化、結(jié)締組織遺傳性疾病、血管和腎膠原性基底膜的糖尿病、軟骨發(fā)育不良、奧爾波特綜合癥、角膜和晶狀體異常等。

1.3 膠原蛋白的生產(chǎn)。膠原蛋白的生產(chǎn)一般是直接提取、純化自動物組織中，大體過程是先去除油脂，再去除雜蛋白，經(jīng)過析出、純化等得到膠原蛋白。在很多情況下，單一的提取方法往往得不到預期的效果。提取的方法有：①熱水提取法。熱水提取法是從動物組織中提取膠原蛋白的最常用的一種方法。②酸、堿、中性鹽提取法。酸、堿、中性鹽提取法是指原料在酸性、堿性或中性鹽環(huán)境中破壞其分子間的鍵和作用力，引起膠原纖維溶解的一種膠原蛋白提取方法。③酶提取法。酶提取法是采用不同的蛋白酶在一定的外界環(huán)境條件下對膠原蛋白進行降解，從而將末端肽切割下來，最終把膠原蛋白提取出來的一種方法。

用傳統(tǒng)的提取方法提純出的膠原蛋白存在動物源疾病的風險，制約了膠原蛋白的開發(fā)。且傳統(tǒng)的提取方法所得到的數(shù)量有限，雖然已經(jīng)有美國和日本依賴全化學合成的手段合成出類膠原蛋白，但因化學合成蛋白質(zhì)技術復雜、產(chǎn)量少、代價昂貴和難于標準化，目前還不能應用于工業(yè)化的生產(chǎn)中，因此，利用基因工程方法生產(chǎn)重組的膠原蛋白就越來越成為現(xiàn)在研究發(fā)展的趨勢。

2 膠原蛋白在重組系統(tǒng)中的表達

目前許多重組表達系統(tǒng)被應用于人膠原蛋白的重組表達，例如大腸桿菌、酵母、動物細胞、轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動物等，重組人膠原蛋白的表達情況見表2[7]。

表1 人膠原蛋白在各表達系統(tǒng)中的表達總結(jié)

2.1 大腸桿菌系統(tǒng)表達膠原蛋白。應用最廣泛的是大腸桿菌表達系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)在培養(yǎng)操作上較為簡單，菌種生長迅速，表達量較高且生產(chǎn)成本低廉，發(fā)酵周期較短，可規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)，抗污染能力也強，且該系統(tǒng)包含多種宿主菌和載體，可以適應不同的表達過程。但是，由于大腸桿菌表達屬于原核生物，在表達真核蛋白過程中目的蛋白常在胞內(nèi)形成不溶性的包涵體，不具有生物活性。另外，大腸桿菌表達系統(tǒng)還具有原核表達系統(tǒng)的翻譯后的加工修飾體系不完善、產(chǎn)生的致熱原使膠原蛋白難以應用于臨床等，也使得表達產(chǎn)物的生物活性較低。

2.2 酵母表達系統(tǒng)表達膠原蛋白。鑒于大腸桿菌表達系統(tǒng)的種種缺點，于是引入真核表達系統(tǒng)——酵母表達系統(tǒng)，它能保證膠原蛋白經(jīng)過工程菌足夠的翻譯后修飾，包括糖基化、羥基化等。分泌生產(chǎn)的膠原蛋白具有更好的性能，此研究在國內(nèi)外也已經(jīng)取得了許多突破性的成果。構(gòu)建酵母表達系統(tǒng)首先要選擇合適的宿主菌。較為常用的酵母表達類型有以下幾種：①釀酒酵母。雖然釀酒酵母是最早使用的性狀優(yōu)良的酵母表達系統(tǒng)，但是它存在著質(zhì)粒不穩(wěn)定、表達蛋白產(chǎn)量低等缺點。②乳酸克魯維婭酵母。乳酸克魯維婭酵母最大的特點就是它是一種安全的微生物表達宿主，可以用來大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)蛋白。③甲醇營養(yǎng)型酵母。甲醇營養(yǎng)型酵母生長所需的碳源及能源是甲醇，迄今為止應用最為廣泛。甲醇營養(yǎng)型酵母中，畢赤酵母表達系統(tǒng)是運用重組生產(chǎn)膠原蛋白的最多的一種。④解脂耶氏酵母。解脂耶氏酵母擁有大量分泌表達蛋白的能力，并且它分泌的蛋白糖基化程度低。⑤栗酒裂殖酵母。栗酒裂殖酵母表達系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是其表達產(chǎn)物形式更貼近于其天然的形式，適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)應用。

2.3 動植物細胞表達膠原蛋白。利用哺乳動物和昆蟲細胞來生產(chǎn)膠原蛋白，被認為是最早采用重組發(fā)酵的一種方式。然而，在哺乳動物細胞中的表達水平極低，不足以應用于商業(yè)化的生產(chǎn)中。除此之外，細胞發(fā)酵培養(yǎng)的生產(chǎn)成本會比大腸桿菌或者酵母表達系統(tǒng)的成本高5～10倍[8]。近十幾年的研究，有1998年Nokelainen等構(gòu)建兩株桿狀病毒表達系統(tǒng)，共感染昆蟲細胞后，成功表達具有穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的人膠原蛋白，表達量達到50mg/L。2009年，Eskelin等以大麥種子作為宿主成功表達人源I型膠原的全長α-1鏈和45-kDa片段，其中45-kDa片段的產(chǎn)量達到150g/hm2，該產(chǎn)量已具有商業(yè)應用前景。

3 發(fā)酵條件及工藝研究

3.1 重組大腸桿菌發(fā)酵研究

3.1.1 重組大腸桿菌發(fā)酵的培養(yǎng)方式?？晒┲亟M大腸桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)方式的主要有分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、連續(xù)分批發(fā)酵及透析發(fā)酵等。這些發(fā)酵方式一般情況下會相互結(jié)合使用。①分批發(fā)酵，是一種相對封閉的發(fā)酵方式，只有氣體流通，發(fā)酵液不流通。在發(fā)酵過程中，微生物生長符合細菌生長曲線。②補料—分批發(fā)酵，被認為是高密度發(fā)酵中效果最好的方法，是在分批發(fā)酵過程中添加新鮮料液，發(fā)酵過程中發(fā)酵液的體積在增加的一種方法。③連續(xù)發(fā)酵，在發(fā)酵過程中發(fā)酵液新進舊出，原來的體積保持不變。④透析培養(yǎng)，指的是通過半透膜濾去有害代謝產(chǎn)物，并向培養(yǎng)液中添加新的營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式。

3.1.2 影響重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的因素。①培養(yǎng)基成分。朱才慶等研究的實驗數(shù)據(jù)表明，在培養(yǎng)大腸桿菌DA19時，在基本培養(yǎng)基中添加混合微量元素更有益于菌體生長。②菌種的質(zhì)量及接種量。它們會影響菌種在發(fā)酵過程中的生長狀況。③培養(yǎng)溫度是影響細菌生長代謝的關鍵。一般大腸桿菌的最適生長溫度和質(zhì)粒穩(wěn)定溫度有所不同，故適當?shù)卣{(diào)整培養(yǎng)溫度有利于促進大腸桿菌的生長、提高重組產(chǎn)物的表達量、縮短培養(yǎng)周期[9]。④把pH控制在適宜范圍內(nèi)。在發(fā)酵過程中，大腸桿菌會產(chǎn)生有機酸等代謝產(chǎn)物，使發(fā)酵液酸度增加，這對大腸桿菌生長代謝和表達產(chǎn)物不利，因此必須及時調(diào)節(jié)pH。⑤溶解氧濃度也是一個重要的影響因素。發(fā)酵罐內(nèi)溶解氧濃度過低會抑制菌體生長，過高則會發(fā)生Crebtree效應。

3.2 重組酵母發(fā)酵研究。研究最多的是針對于畢赤酵母的高密度發(fā)酵。畢赤酵母高密度發(fā)酵分為兩個階段。第一階段為分批發(fā)酵階段，甘油為碳源，直到菌體生長到一定程度。第二階段是當生長到一定程度的菌體“饑餓”約半小時后開始的，此階段屬于補料—分批發(fā)酵階段，所補的料為甲醇。培養(yǎng)基的組成及各成分的含量直接影響高密度發(fā)酵的效果。①對于一些容易被蛋白酶降解的分泌型蛋白，為減少目的蛋白的降解，一般就要使用含有蛋白陳或者酵母粉的培養(yǎng)基。②培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的含量也需要保持在適當?shù)姆秶鷥?nèi)，基質(zhì)濃度過低菌體得不到充足營養(yǎng)，而達不到高密度發(fā)酵的效果，基質(zhì)濃度過高則有可能抑制目的產(chǎn)物的表達而導致生產(chǎn)效率下降。③優(yōu)化培養(yǎng)基中的組分及其配比可以滿足細胞生長對基質(zhì)的消耗。劉彥麗等的研究發(fā)現(xiàn)PTM1和0.05%的油酸(作消泡劑)能顯著提高外源蛋白的表達。④畢赤酵母雖然在pH值一定范圍內(nèi)均可生長，但控制pH值為5.0時菌體生長水平和表達外源蛋白水平都達到最高，pH值超過7時菌體量及表達量均不理想。一般BMM培養(yǎng)基自然狀態(tài)下的初始pH值為5.5，當pH值在5.0左右改變1個單位或以上，發(fā)酵第二階段目的蛋白的表達量就會受到很大的影響。對pH值的調(diào)控主要是通過補加氨水或者鹽酸。⑤發(fā)酵培養(yǎng)基中溶氧量對好氧菌生長來說也是非常重要的，在發(fā)酵過程中可以提供充足的氧氣供應，滿足生產(chǎn)菌對氧的需求，這也是提高菌體發(fā)酵表達量的重要因素之一。⑥溫度通過影響酶的活性從而影響發(fā)酵。研究表明，當溫度超過32℃，畢赤酵母表達膠原蛋白將受到嚴重影響。

4 發(fā)展前景

為了能充分利用膠原蛋白的作用，使膠原蛋白的應用更加廣泛，利用現(xiàn)代生物技術重組發(fā)酵生產(chǎn)制備膠原蛋白已成為目前的主流?，F(xiàn)在來看，雖然微生物發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白取得了一些進展，但還是存在很多問題。且對于產(chǎn)業(yè)化而言，優(yōu)化發(fā)酵工藝是一個永恒的話題。相信隨著技術的發(fā)展，膠原蛋白的生產(chǎn)也會逐步優(yōu)化。

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