張智燕，王彩虹

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.包頭市第三醫(yī)院內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010

粉塵顆粒誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化

張智燕1，王彩虹2

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.包頭市第三醫(yī)院內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014010

目的利用極差分析法和正交實(shí)驗(yàn)探究外周血分離白細(xì)胞的最佳條件。方法利用不同的轉(zhuǎn)速、時(shí)間分別分離外周血液中的白細(xì)胞，將所得的細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，在熒光倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)，再采用正交實(shí)驗(yàn)和極差分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果通過(guò)極差分析法發(fā)現(xiàn)，血量的極差最大，時(shí)間的極差最小，所以對(duì)分離白細(xì)胞最主要的影響因子為血量，最小的K值反映了最適宜的配比，該配比離心轉(zhuǎn)速為1 000 rpm、時(shí)間為20 min、血量為5 mL。結(jié)論外周血分離白細(xì)胞的最佳條件為離心轉(zhuǎn)速1 000 rpm、時(shí)間20 min、血量5 mL。

白細(xì)胞；塵肺；Fas基因；可變剪接

塵肺是工人工作過(guò)程中經(jīng)常吸進(jìn)大量的生產(chǎn)性粉塵，并且在肺內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間滯留而引起的一種全身性疾病[1]，主要是以肺組織纖維化為主。而塵肺病中矽肺發(fā)病率高并且嚴(yán)重[2]。矽肺是因?yàn)殚L(zhǎng)久吸進(jìn)大量 SiO2導(dǎo)致肺組織發(fā)生纖維化的一種疾病。它是塵肺病當(dāng)中最普遍的一種疾病。很多職業(yè)的日?；顒?dòng)中都會(huì)產(chǎn)生大量灰塵，而且接塵工人遍及各地，所以發(fā)病率特別高?，F(xiàn)今，人們已了解到矽肺的危害是其致纖維化作用，并對(duì)矽肺進(jìn)行了深入研究，研究還發(fā)現(xiàn)接塵工人的肺癌也是高發(fā)，肺癌也是矽肺病的主要死因之一[3]。

目前塵肺的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，而公認(rèn)的學(xué)說(shuō)有矽塵致纖維化學(xué)說(shuō)，脂質(zhì)過(guò)氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)，免疫學(xué)說(shuō)的觀點(diǎn)，細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)，細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)等來(lái)闡述它的病因[4-5]。國(guó)內(nèi)外研究顯示塵肺患者體內(nèi)細(xì)胞凋亡和壞死密切相關(guān)的Fas基因發(fā)生了可變剪接。為了更好地研究Fas基因發(fā)生可變剪接在塵肺發(fā)生發(fā)展中的作用，特對(duì)粉塵顆粒誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑、儀器

材料：來(lái)自包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院當(dāng)天體檢患者的抗凝（EDTA-K2）全血，要求無(wú)傳染病，無(wú)溶血。

主要試劑、儀器，見(jiàn)表1。

表1 主要試劑、儀器

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分離外周血液中的白細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟：①取一支15 mL離心管，加3 mL淋巴細(xì)胞分離液；②用移液槍小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，4℃，500 rpm，30 min離心，為分離白細(xì)胞得到最佳的效果進(jìn)分離條件優(yōu)化，條件如下：4℃、590 rpm、30 min；4℃，450 rpm、30 min； 4℃、500 rpm、30 min； 4℃、700rpm、30min；4℃、 800rpm、30min；4℃、 900rpm、30 min；4℃、1 100 rpm、30 min；③離心后，此時(shí)離心管中溶液由上往下分為3層，上層是血漿，中間層是乳白色淋巴細(xì)胞層，底層是紅細(xì)胞層；④用移液槍小心吸取第2層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞到新的15 mL離心管中，再加入10 mL清洗液（型號(hào)2010×1118）混勻清洗細(xì)胞；⑤4℃、250 rpm，離心10 min；⑥棄上清；⑦加入5 mL的清洗液（型號(hào)2 010×1 118）重懸所得細(xì)胞；⑧4℃、250 rpm，離心 10 min；⑨重復(fù)6，7，8后棄掉上清液，以0.5 mL含10%血漿完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；⑩把細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到60 mL一次性培養(yǎng)皿中，在熒光倒置顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2.2 正交試驗(yàn)

分離白細(xì)胞最佳工藝的確定是采用正交實(shí)驗(yàn)法，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是安排多因子的一種常用方法，通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可用少量的具有代表性的試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)，較快地取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)過(guò)之前的探究實(shí)驗(yàn)影響分離白細(xì)胞效果的主要因子是轉(zhuǎn)速、時(shí)間、血量，共3個(gè)因子，轉(zhuǎn)速和時(shí)間分別為離心的條件。每個(gè)因子取3個(gè)水平。所以本實(shí)驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下設(shè)計(jì)：由于是三因子、三水平，所以選用L9(34)，將轉(zhuǎn)速、時(shí)間、血量分別安排在第1、2、3列，共安排9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。 見(jiàn)表2、表3。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

K1(1)=(12＋4＋9.6)/3×107=8.5×107

K1(2)=(12＋2＋1.2)/3×107=5.06×107

K2(1)=(2＋26＋9.2)/3×107=12.4×107

K2(2)=(4＋26＋3.2)/3×107=11.07×107

K3(1)=(1.2＋3.2＋4)/3×107=1.6×107

K3(2)=(9.6＋9.2＋4)/3×107=6.4×107

K1(3)=(1.2＋3.2＋4)/3×107=15.7×107

K2(3)=(2＋4＋4)/3×107=2.1×107

K3(3)=(1.2＋26＋9.2)/3×107=2.1×107

表2 因子水平表

表3 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

極差分析法：首先分析因子1(轉(zhuǎn)速)，把因子1取1水平(800 rpm)的3次實(shí)驗(yàn)(1,4,7號(hào))的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值：K1(1)=(12＋4＋9.6)/3×107=8.5×107同理計(jì)算其他因子在一定水平的平均值。極差計(jì)算：極差=最大均值—最小均值R=K2(1)-K3(1)=(12.4-1.6)×107=10.8×107其他的極差計(jì)算以此類(lèi)推。經(jīng)計(jì)算結(jié)果依次為6×107與13.6×107。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 分離外周血液中白細(xì)胞正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

通過(guò)上述可知，初步探索從人外周血液中分離白細(xì)胞最佳離心條件為轉(zhuǎn)速1 000 rpm，時(shí)間20 min，血量5 mL。見(jiàn)圖1。

圖1 離心后血液的分層現(xiàn)象

3.2 分離白細(xì)胞最佳的條件結(jié)果分析

該實(shí)驗(yàn)外周血分離白細(xì)胞的最佳條件確定采用正交實(shí)驗(yàn)方法。見(jiàn)表4。

表4 9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的K值及極差

采用極差分析法實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：①通過(guò)比較各因子極差的大小。極差越大，說(shuō)明該因子的水平變動(dòng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變動(dòng)越大，即該因子對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大，從而可以按極差的大小來(lái)決定因子的主次順序。該實(shí)驗(yàn)為：血量＞轉(zhuǎn)數(shù)＞時(shí)間。所以對(duì)分離白細(xì)胞最主要影響因子為血量。②確定較適宜的配比。K1、K2、K3反映了因子各水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因而最小的K值對(duì)應(yīng)了最好的水平，對(duì)該實(shí)驗(yàn)較適宜的配比為：離心轉(zhuǎn)速為1 000 rpm，時(shí)間為20 min，血量為5 mL。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

采用正交實(shí)驗(yàn)法初步確定了最佳的分離條件，離心轉(zhuǎn)速為1 000 rpm，時(shí)間為20 min，血量為5 mL。影響最大因子為血量，其次是轉(zhuǎn)速，最后為時(shí)間。

中國(guó)是受粉塵顆粒影響最嚴(yán)重，污染最大的國(guó)家之一，塵肺患者數(shù)中無(wú)論是新發(fā)，還是現(xiàn)患?jí)m肺患者數(shù)均居全世界之首[6]。國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委疾病預(yù)防控制局在有關(guān)職業(yè)病預(yù)防治療工作情況的調(diào)查顯示塵肺病發(fā)病例報(bào)告的病例數(shù)占2012年全國(guó)職業(yè)病總例數(shù)的88.28%。

并且塵肺病發(fā)病率持續(xù)升高，而且患病患者出現(xiàn)工齡遞減趨勢(shì)，截止到 2016年，患有塵肺病的總?cè)藬?shù)已超 72萬(wàn)例。

有學(xué)者在研究RNA序列是否能夠編碼多個(gè)蛋白質(zhì)過(guò)程中，提出并運(yùn)用了可變剪接概念進(jìn)行解釋里面出現(xiàn)的現(xiàn)象。在前面很多對(duì)基因的科學(xué)研究中表明高等真核生物的基因序列存在可變剪接[7-8]，數(shù)量大約為5%?？梢?jiàn)，pre-mRNA的可變剪接在產(chǎn)生受體多樣性及生物生長(zhǎng)發(fā)育中有著重要的決定性作用[9]，同時(shí)也是控制基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制。許多疾病的發(fā)生都與可變剪接有關(guān)。

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R446.1

A

1672-5654（2017）10（b）-0047-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.29.047

張智燕（1982-），女，內(nèi)蒙古包頭人，碩士，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

2017-07-18）