楊 威，蔣 瑩，陳有君，閆 偉，李立民，霍 峰

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020 ）

環(huán)境pH對褐環(huán)粘蓋牛肝菌轉(zhuǎn)錄組的影響

楊 威，蔣 瑩，陳有君，閆 偉，李立民，霍 峰

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020 ）

為了探明環(huán)境酸堿條件對褐環(huán)粘蓋牛肝菌基因表達(dá)的影響，測序分析了生長在不同pH環(huán)境下的該菌轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生長在pH3環(huán)境下的菌絲相比，pH4、4.5、5、5.5、6、7、8條件下的菌絲，分別有743、870、1 177、1 512、1 628、3 135、2 902個基因發(fā)生了差異表達(dá)，這些差異表達(dá)基因在基因本體論數(shù)據(jù)庫中分別注釋到2 029、2 368、2 733、3 125、3 168、4 626、4 728個功能，在京都基因與基因組百科全書中分別定位到76、81、108、121、116、180、177個代謝途徑，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)的加工、泛醌和其他類萜醌的生物合成途徑、谷胱甘肽代謝途徑、ABC transporter途徑、色氨酸代謝途徑和抗生素生物合成途徑等途徑的富集程度較高。說明環(huán)境酸堿度對褐環(huán)粘蓋牛肝菌蛋白質(zhì)加工及物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等具有很大影響。

基因表達(dá)；代謝途徑；褐環(huán)粘蓋牛肝菌；酸堿條件

褐環(huán)粘蓋牛肝菌〔Suillus lutens（L.：Fr.）Gray〕是一種優(yōu)良的外生菌根真菌，其生命活動降低環(huán)境pH條件是其促進(jìn)植物生長的機(jī)制之一，因此，其與環(huán)境酸堿條件的相互作用引起學(xué)者們進(jìn)行大量研究。陳連慶等發(fā)現(xiàn)褐環(huán)粘蓋牛肝菌在環(huán)境pH4.0～4.5條件下，生長最為良好，并且隨著pH值的增大，菌絲的生長速率降低［3］。姚慶智等發(fā)現(xiàn)該菌生長最適的環(huán)境pH范圍為6～7［4］。張茹琴等研究表明該菌在環(huán)境pH4.0～7.0條件下均可生長，其生長的最適pH為5.3～6.7，菌絲生長一段時間后，培養(yǎng)液pH值均有不同幅度的下降［5］。劉淑清等發(fā)現(xiàn)褐環(huán)粘蓋牛肝菌生長的最適環(huán)境pH為4.5左右，在培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液pH改變量均與其生物量成正相關(guān)［6］。蔡楠楠發(fā)現(xiàn)該菌在環(huán)境pH4.5～6條件下生長情況良好，pH4.5和pH6條件下獲得的菌絲生物量高于pH5.0和pH5.5條件下的生物量，即生物量隨pH變化呈雙峰型；在pH3.0～6.0的培養(yǎng)條件下，隨著pH的升高，培養(yǎng)后培養(yǎng)基pH的下降幅度逐漸增大，在pH6.0條件下下降幅度最大，達(dá)到1.59個pH單位，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)在pH6.0條件下的草酸含量最多［7］。劉萌的研究表明，褐環(huán)粘蓋牛肝菌在pH5.0～6.0下生長情況最佳，分泌的有機(jī)酸最多，生長最為旺盛［8］。王明慧發(fā)現(xiàn)褐環(huán)粘蓋牛肝菌的草酸分泌量隨pH的升高而逐漸增加，從pH4.0～4.5及pH5.5～6.0范圍內(nèi)，草酸的分泌量升高較快；并且發(fā)現(xiàn)該菌蛋白質(zhì)含量隨著pH的升高而逐漸上升，在pH 5時上升速率加快，且在pH 6時達(dá)到最高，達(dá)到最高值后蛋白質(zhì)含量迅速下降［9］。但是關(guān)于pH對該菌基因轉(zhuǎn)錄影響，從而改變蛋白質(zhì)合成方面還缺乏研究。

不同環(huán)境pH生長下的擬南芥，其許多基因發(fā)生變化，涉及細(xì)胞壁修飾、Ca2+信號、病原體誘導(dǎo)、水楊酸，以及WRKY和NAC等轉(zhuǎn)錄因子［10］。環(huán)境pH影響藍(lán)莓的代謝途徑有RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬體、醚酯代謝、內(nèi)吞作用和甘油磷脂代謝等，并且ERF、bHLH、NAC和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子也發(fā)生改變［11］。環(huán)境pH能夠影響野大豆許多基因的表達(dá)，包括參與代謝過程、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)建成、蛋白質(zhì)合成和次生代謝的基因，乃至MRKY、MYB和SPL等轉(zhuǎn)錄因子［12］。藍(lán)藻在不同環(huán)境pH條件下?lián)碛胁煌幕虮磉_(dá)情況，乳酸發(fā)酵途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、雙組份調(diào)控體系、脂肪酸合成和戊糖磷酸途徑等均有顯著變化［13］。不同pH土壤處理下的平邑甜茶，其諸多基因的表達(dá)水平發(fā)生明顯改變，參與的生理過程主要包括氮代謝、光合進(jìn)程、植株病原互作、TCA循環(huán)、氧化磷酸化和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［14］。說明環(huán)境pH對基因表達(dá)水平有顯著的影響。但是褐環(huán)粘蓋牛肝菌基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律與pH之間的關(guān)系尚不清楚，因此，本研究利用RNA-Seq技術(shù)測定了不同pH 環(huán)境下褐環(huán)粘蓋牛肝菌的轉(zhuǎn)錄組序列，并對該菌在不同pH處理后基因的轉(zhuǎn)錄情況和不同環(huán)境pH之間基因的差異表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度揭示環(huán)境pH對褐環(huán)粘蓋牛肝菌基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為褐環(huán)粘蓋牛肝菌Sp9菌株，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究室提供。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Pachlewski（簡稱Pach）培養(yǎng)基，其組成參照蔡楠楠［7］文獻(xiàn)中的配方。

1.2 試驗方法

用打孔器打取直徑為5 mm、生長旺盛的平板菌落，接入Pach培養(yǎng)基生長6 d后，挑取整個菌落轉(zhuǎn)接到不同處理的液體培養(yǎng)基中，試驗設(shè)8個處理，分別為 pH3、4、4.5、5、5.5、6、7、8。在保證培養(yǎng)基pH不變的條件下，25℃恒溫培養(yǎng)5 d，進(jìn)行RNA測序。液體培養(yǎng)接菌量為12塊，裝液量為50/150 mL。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

將獲得的RNA建立文庫，在Illumina HiSeq測序儀上進(jìn)行測序，并使用Trimmomatic軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)（FP data），計算RPKM值（衡量基因表達(dá)量），RPKM是將map到基因的read數(shù)除以map到基因組上的所有read數(shù)（以million為單位）與RNA的長度（以KB為單位）。數(shù)據(jù)通過質(zhì)量評估后，對樣本間相關(guān)性檢測和聚類分析，以及基因本體論 （GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。RPKM計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)水平分析

通過測序，共獲得71.12 Gb堿基序列信息，過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)有61.62 Gb，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。堿基平衡性優(yōu)秀。數(shù)據(jù)可以進(jìn)行后續(xù)的分析。

本試驗主要針對基因組的蛋白編碼基因mRNA 進(jìn)行分析，對基因的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計、并以此評估組內(nèi)及組間樣品基因表達(dá)特征的相關(guān)性，以及差異表達(dá)的基因。通過RPKM值的分布圖（圖1）可以看出，pH3～8差異基因的log10RPKM最大值均在3.4左右，中值均在1左右，最小值均在-1.3左右。log10RPKM數(shù)值越高，表示基因表達(dá)量越高。

圖1 RPKM值分布情況的boxplot

2.2 表達(dá)水平相關(guān)性分析

樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)。相關(guān)系數(shù)越接近于1，表明樣品之間表達(dá)模式的相似度越高。如圖2所示，pH3～6皮爾森相關(guān)系數(shù)的平方皆大于0.83，并且pH3～6之間的log10RPKM數(shù)值大部分均勻的落在對角線上，表明樣品間的一致性較高，可能說明褐環(huán)粘蓋牛肝菌在pH3～6之間的生長環(huán)境中基因表達(dá)變化程度較小，而在pH7的中性環(huán)境和pH8的弱堿性環(huán)境中，皮爾森相關(guān)系數(shù)基本小于0.8，并且pH7和pH8與其他pH之間的log10RPKM數(shù)值大部分落在對角線的左上區(qū)域，基因表達(dá)變化程度較大。說明褐環(huán)粘蓋牛肝菌在酸性、中性以及弱堿的生長環(huán)境中，其基因存在不同的表達(dá)模式。通過樣本聚類距離（圖3），聚類分析結(jié)果同相關(guān)性散點圖的結(jié)果高度一致，其中，樣品pH7、8被聚到一類，而樣品pH3～6被聚到一類，其中樣品pH4.5、5、5.5、6被聚到一小類。

圖2 基因表達(dá)相關(guān)性散點圖

圖3 基因表達(dá)水平的層次聚類圖

2.3 差異表達(dá)基因分析

圖4 相鄰pH間差異表達(dá)基因數(shù)量

差異表達(dá)基因是指樣品間或者同一樣品經(jīng)過不同處理后，上調(diào)表達(dá)的基因和下調(diào)表達(dá)基因的匯總。本試驗篩選的閾值為：。獲得每相鄰組間的差異基因統(tǒng)計（圖4），其中pH4.5與pH4、pH5與pH4.5、pH5.5與pH5、pH6與pH5.5差異表達(dá)的基因數(shù)量較小，pH7與pH6、pH8與pH7差異表達(dá)的基因數(shù)量較大。獲得pH3下生長的菌絲與其他pH下生長菌絲的差異基因統(tǒng)計（圖5），上調(diào)、下調(diào)基因的數(shù)目均隨pH升高而逐漸增多，且上調(diào)基因一直多于下調(diào)基因。pH4、4.5、5、6與pH3相比的差異基因數(shù)目差異較小，平均pH差每變化1個單位，會有221個左右的差異基因；pH6、7與pH3相比的差異基因數(shù)目差異最大，達(dá)到1 507個。

圖5 pH3與其他pH間差異表達(dá)基因數(shù)量

2.4 差異表達(dá)基因GO注釋分析

將pH3下生長的菌絲轉(zhuǎn)錄組與其他pH下的轉(zhuǎn)錄組比較，差異表達(dá)基因在GO上注釋的功能數(shù)見圖6。從圖6可以看出，上調(diào)、下調(diào)基因的功能數(shù)均隨pH升高而逐漸增多，平均pH差每變化1個單位，會有730個左右的功能差異，尤其是pH3～5.5，幾乎是直線變化。pH8與pH7相比，注釋的功能數(shù)差異較小。

圖6 差異表達(dá)基因的GO注釋數(shù)量

表1歸納了7組pH中皆存在且差異表達(dá)基因較多的功能。從表1可以看出，在上調(diào)基因中，對化學(xué)物質(zhì)的響應(yīng)是富集程度最高的，平均差異基因數(shù)量有52個左右，占該功能基因總數(shù)的25%；其次是細(xì)胞對化學(xué)刺激，平均差異基因數(shù)量有47個左右，占該功能基因總數(shù)的31%；再次是對胞外刺激（外界刺激、營養(yǎng)水平）的響應(yīng)，在前5組pH中的平均差異基因數(shù)量有27個左右，占該功能基因總數(shù)的52%。在下調(diào)基因中，氧化還原酶活性是富集程度最高的，平均差異基因數(shù)量有60個左右，占該功能基因總數(shù)的22%；其次是金屬離子運(yùn)輸、過渡金屬離子運(yùn)輸和跨質(zhì)膜內(nèi)運(yùn)，平均差異基因數(shù)量分別有19、14和10個左右，占該功能基因總數(shù)的31%、49%和50%；再次是細(xì)胞脂類和甾醇類化合物的生物合成，平均差異基因數(shù)量有17個左右，占該功能基因總數(shù)的39%；最后是對胞外刺激（外界刺激、營養(yǎng)水平）的響應(yīng)，在后2組pH中的平均差異基因數(shù)量有37個左右，占該功能基因總數(shù)的71%。

2.5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

將pH3下生長的菌絲轉(zhuǎn)錄組與其他pH下的轉(zhuǎn)錄組比較，差異表達(dá)基因在KEGG pathway上注釋的途徑數(shù)見圖7。從圖7可以看出，上調(diào)、下調(diào)基因所涉及的途徑數(shù)均隨pH升高而逐漸增多，平均pH差每變化1個單位，會有19個左右的途徑差異。pH6、7與pH3相比，差異表達(dá)基因注釋的途徑數(shù)差異最大，達(dá)到64個。而pH7、8與pH3相比，差異表達(dá)基因注釋的途徑數(shù)差異較小。

圖7 差異表達(dá)基因的KEGG pathway注釋數(shù)量

表2歸納了7組pH中皆存在且差異表達(dá)基因涉及較多的途徑。從表2可以看出，在上調(diào)基因中，戊糖和葡萄糖醛酸酯互換和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白加工是富集程度最高的，平均差異基因數(shù)量分別有11、9個左右，占該途徑基因總數(shù)的53%和10%；其次是甘油酯代謝、泛醌和其他類萜醌的生物合成，平均差異基因數(shù)量分別有2、3個左右，占該途徑基因總數(shù)的18%和12%；最后是苯丙氨酸代謝，在后5組pH中平均差異基因數(shù)量有3個左右，占該途徑基因總數(shù)的22%。在下調(diào)基因中，谷胱甘肽代謝是富集程度最高的，平均差異基因數(shù)量有11個左右，占該途徑基因總數(shù)的36%；其次是ABC運(yùn)轉(zhuǎn)體、色氨酸代謝和抗生素合成，平均差異基因數(shù)量分別有3、5、24個左右，占該途徑基因總數(shù)的9%、20%和12%；最后是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成，在后6組pH中平均差異基因數(shù)量有5個左右，占該途徑基因總數(shù)的32%。

表1 集中程度最高的GO功能

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，在弱酸環(huán)境下，pH變化引起褐環(huán)粘蓋牛肝菌基因表達(dá)的變化較小；在中性或弱堿環(huán)境下，表達(dá)發(fā)生變化的基因數(shù)較多。pH3與其他pH比較的差異表達(dá)基因，在GO上注釋的功能數(shù)差值，隨著pH值的升高而增大；在KEGG中涉及的途徑數(shù)差值，也隨著pH值的升高而增加。

GO富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對化學(xué)刺激、營養(yǎng)水平、胞外刺激的和外界刺激的響應(yīng)方面，酸性條件和中性條件下的上調(diào)差異基因富集程度較高，而在弱堿條件下的下調(diào)差異基因富集程度較高。這可能暗示褐環(huán)粘蓋牛肝菌在酸性和中性條件下能夠通過分子調(diào)控更快更好地適應(yīng)環(huán)境并生長，而在弱堿性條件下對環(huán)境的適應(yīng)能力明顯下降，生長發(fā)育能力也隨之減弱。氧化還原酶活性、脂類生物合成和甾醇類化合物生物合成在7組pH下調(diào)差異基因中的富集程度也很高。氧化還原酶發(fā)生氧化或還原反應(yīng)需要電子作供體或受體，氧化還原系統(tǒng)就是電子傳遞鏈［15］。脂質(zhì)是生物體內(nèi)儲存能量的最佳物質(zhì)，是生物膜結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)，能夠作為生長因子和抗氧化劑，參與固醇類激素的信號傳遞和信號識別及免疫［16］，而且能夠參與膜內(nèi)電子的傳遞。甾醇類化合物是細(xì)胞膜的重要組成部分，能夠直接影響細(xì)胞膜的流動性，并且能夠參與細(xì)胞膜的識別和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能［17］。我們推斷在不同pH的生長環(huán)境下，褐環(huán)粘蓋牛肝菌的生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化，在調(diào)節(jié)電子的傳遞、細(xì)胞膜的流動性和識別上均有改變，從而使該菌自身能夠更快的適應(yīng)各種pH環(huán)境。

表2 富集程度最高的KEGG通路

研究發(fā)現(xiàn)，在pH3與其他pH的差異表達(dá)基因富集到的KEGG通路展示中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白加工通路是7組上調(diào)差異表達(dá)基因富集程度最高的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)的加工有糖基化、羥基化、酰基化、二硫鍵形成等，在這些加工中最主要的是糖基化［18-20］。其次是泛醌和其他類萜醌的生物合成通路、甘油酯代謝通路和苯丙氨酸代謝通路在上調(diào)差異基因中富集程度也較高。泛醌，屬維生素，作為生物體呼吸鏈中重要的遞氫體，能夠刺激跨膜電子運(yùn)輸［21-22］。萜類化合物是普遍存在的一類代謝產(chǎn)物，如赤霉素、脫落酸等植物激素、類胡蘿卜素、能夠組成細(xì)胞膜的甾體和涉及電子傳遞的醌類等；在調(diào)節(jié)植物與環(huán)境之間的關(guān)系上表現(xiàn)出相當(dāng)重要的生態(tài)功能［23-24］。甘油脂能夠提高膜的流動性，對激活一些結(jié)合在膜上的酶是相當(dāng)有意義的，對維持不同環(huán)境下的生物膜流動性也十分重要［25］。苯丙氨酸代謝途徑是重要的次生代謝途徑，能夠應(yīng)答傷害、病原菌等多種脅迫誘導(dǎo)［26］。在7組pH下差異表達(dá)基因中，谷胱甘肽代謝通路的富集程度最高。谷胱甘肽是重要的抗氧化劑和自由基清除劑，把機(jī)體內(nèi)的自由基，金屬離子轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)，排泄出體外，同時對細(xì)胞膜起到保護(hù)的作用［27］。ABC transporter通路、色氨酸代謝通路和抗生素生物合成通路在下調(diào)差異基因中的富集程度也較高。ABC transporter通路對細(xì)胞膜的發(fā)生和功能維護(hù)上具有重要意義，其最重要的功能是利用ATP水解產(chǎn)生的能量將與其結(jié)合的底物轉(zhuǎn)出質(zhì)膜［28］。色氨酸調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，并參與植物體內(nèi)眾多代謝反應(yīng)的調(diào)控，如激素響應(yīng)、滲透脅迫等［29］。抗生素能夠與細(xì)胞膜相互作用，從而提高細(xì)胞膜的通透性、打開膜上的離子通道，使菌體內(nèi)部的有用物質(zhì)漏出或者菌體電解質(zhì)平衡失調(diào)而死。可以調(diào)節(jié)生長發(fā)育的化學(xué)物質(zhì)，并且能夠作用于能量代謝系統(tǒng)，從而抑制菌絲體的生長發(fā)育［30-31］。由此，我們推測不同pH的生長環(huán)境可能會對褐環(huán)粘蓋牛肝菌的細(xì)胞膜造成一定的影響，而真菌自身通過調(diào)節(jié)位于膜上的ABC運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)、谷胱甘肽代謝系統(tǒng)、泛醌和其他類萜醌的生物合成系統(tǒng)和甘油酯代謝系統(tǒng)等相關(guān)基因的表達(dá)實現(xiàn)保護(hù)細(xì)胞膜以及排出由pH變化產(chǎn)生的不利物質(zhì)等。

在褐環(huán)粘蓋牛肝菌與環(huán)境pH的代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等途徑中，還檢測到很多代謝途徑，這些途徑的相關(guān)基因在不同pH環(huán)境中均存在不同程度的變化，還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of environmental pH on Suillus luteus transcriptome

YANG Wei，JIANG Ying，CHEN You-jun，YAN Wei，LI Li-min，HUO Feng

（ College of Life Science，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010020，China ）

In order to explore the influence of environmental acid-base conditions on gene expression of Suillus luteus，we sequenced the transcriptome of the strain grown in different pH environment. The result showed that，compared with the hyphae grown at pH 3，the hyphae at pH 4，4.5，5，5，5，6，7 and 8 had 743，870，1 177，1 512，1 628，3 135 and 2 902 genes differentially expressed respectively. These differential expressed genes were respectively annotated to 2 029，2 368，2 733，3 125，3 168，4 626 and 4 728 functions in gene ontology，and set to 76，81，108，121，116，180 and 177 metabolic pathways in the Kyoto Genome and Genome Encyclopedia. Among them，the degree of enrichment is higher in protein processing on endoplasmic reticulum，ubiquinone and other like terpene quinone biosynthetic pathway，glutathione metabolism pathway，ABC transporter pathway，tryptophan metabolic pathway，antibiotic biosynthetic pathway and other ways，indicating that environmental acid-base conditions have significant effects on protein processing and transmembrane transport of S. luteus.

expression of gene；metabolic pathway；Suillus luteus；acid and alkali conditions

S646.3

A

1004-874X（2017）08-0047-08

2017-05-31

楊威（1994-），女，在讀碩士生，E-mail：778329902@qq.com

楊威，蔣瑩，陳有君，等. 環(huán)境pH對褐環(huán)粘蓋牛肝菌轉(zhuǎn)錄組的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（8）：47-54.

陳有君（1961-），男，博士，教授， E-mail：cyoujun@sina.com

（責(zé)任編輯 楊賢智）