□ 張 磊 中山市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所

PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用

□ 張 磊 中山市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所

PCR是近些年來提出的一種以生物技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)，其具有快捷、靈敏、高效等優(yōu)點，隨著技術(shù)研究水平的不斷提升，其應(yīng)用的范圍也在不斷地擴大，其中，對食品中的微生物進行檢測就是PCR技術(shù)最常應(yīng)用的方式之一。

PCR技術(shù)；食品微生物；檢測

1 PCR技術(shù)及其在食品微生物檢測中的作用

1.1 PCR技術(shù)簡介

PCR技術(shù)是以單鏈DNA模板，在DNA聚合酶作用下發(fā)生特異性擴增的DNA片段技術(shù)，由變性、退火、延伸3個步驟組成。該技術(shù)應(yīng)用原理首先是將雙鏈DNA變性，使其成為單鏈DNA，然后將引物與單鏈的DNA結(jié)合，在DNA聚合酶的作用，促使單鏈DNA向3’末端合成延伸，進而使新的雙鏈合成。新合成的雙鏈作為模板重復(fù)以上反應(yīng)，不斷形成新的DNA雙鏈，一般經(jīng)過35個循環(huán)重復(fù)拷貝。多重PCR可以擴增某個物質(zhì)的單個片段，也可以同時擴增多個片段。

1.2 熒光定量PCR技術(shù)分析與介紹

熒光定量PCR技術(shù)就是基于熒光能量傳遞的技術(shù)，熒光定量PCR，可以較好地利用受體發(fā)色團之間的偶極-偶極，產(chǎn)生相互的作用關(guān)系，使能量進行一個轉(zhuǎn)移，供體發(fā)色基團-受體發(fā)色基團。在這個過程中，受體熒光染料所發(fā)出的實際熒光強度，和DNA的產(chǎn)量呈正比關(guān)系,在此基礎(chǔ)上要掌握靶序列的初始濃度，就可以利用監(jiān)測反應(yīng)過程中熒光的實際濃度來求得。具體的檢測原理如圖1所示。

2 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用方法

由于食品的質(zhì)量問題造成人們身體受到傷害的事件頻頻發(fā)生。食品的質(zhì)量安全問題近些年來受到人們的廣泛關(guān)注，PCR技術(shù)在食品微生物檢測中應(yīng)用，可以有效保障食品安全。

2.1 常規(guī)PCR檢測

常規(guī)的檢測工作中運用的原理比較簡單，就是在DNA模板和相應(yīng)引物的混合物當(dāng)中加入適量的聚合酶。經(jīng)過催化之后對DNA片段進行擴增。主要是依靠DNA模板來完成，其中經(jīng)歷多個不同的周期。每一個周期都會產(chǎn)生相應(yīng)的DNA片段，可以直接作為循環(huán)的模板，可見聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物在逐漸增加。早在二十年前，研究人員利用沙門氏菌的相應(yīng)基因來對引物進行設(shè)計，在研究的工程中主要也是采用PCR技術(shù)來進行。

圖1 熒光定量PCR技術(shù)的檢測原理

2.2 多重PCR檢測

這種檢測方法和常規(guī)的檢測方法之間存在著一定的相似性。不同的是，在整體的反應(yīng)體系中需要加入更多的引物。如果混合物中存在著呈現(xiàn)互補關(guān)系的引物，就可以在反應(yīng)管中增設(shè)不同的DNA片段。這種方式的優(yōu)勢是：不僅保留了常規(guī)檢測方式的優(yōu)越性，還可以減少相應(yīng)的檢測步驟，達到預(yù)期的檢測目標(biāo)。另外，在采用多重PCR檢測方法的過程中，可以直接對多個基因進行檢測。但是，這種檢測方式本身也或多或少地存在著不足之處，例如：檢測效率相對較低，以及敏感度等方面都需要不斷改進和完善。

2.3 RT-PCR檢測

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)的原理是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RTPCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。在Yee等的研究中，對16條河流樣品和183份動物糞便樣進行了檢測，使用了涂布有鼠傷寒沙門氏菌WG49和WG25的兩種平板。這兩種平板可以區(qū)別出male-specific和SC（somaticphages）型噬菌體。

3 PCR技術(shù)的發(fā)展方向

PCR技術(shù)原理是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在無細(xì)胞條件下進行克隆。PCR技術(shù)在進行微生物檢測的過程中，第一步是進行細(xì)菌細(xì)胞的富集，在獲取微生物細(xì)胞之后對細(xì)胞進行裂解，將其中的DNA完全釋放，再按照微生物的實際特性選擇合適的引物，最后再使用電泳法，對其中的DNA序列進行嚴(yán)格的檢測。PCR技術(shù)的特點就是檢測速度以及檢測精度高，可以對食品中的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、以及金黃色葡萄球菌等進行準(zhǔn)確的測量。因此，PCR技術(shù)在食品的檢測過程中將發(fā)揮極為關(guān)鍵的作用和效果。傳統(tǒng)自動化檢測技術(shù)下，微生物檢測通常需要2～5天不等，較長時間可達1周或1周以上，因檢測時間過長，往往出現(xiàn)食品已投向市場流轉(zhuǎn)而檢測結(jié)果尚未出來的情況，體現(xiàn)了傳統(tǒng)自動化檢測具有費時的弊端，對我國食品行業(yè)實際生產(chǎn)運作造成嚴(yán)重影響，進而影響我國社會穩(wěn)定與經(jīng)濟的發(fā)展。而高自動化檢測技術(shù)PCR完全規(guī)避了費時這一弊端，在較短時間之內(nèi)便能得出檢測結(jié)果，通常幾小時，較長時間僅為1天，因此，高自動化檢測技術(shù)PCR對我國食品行業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。