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        人胎盤間充質干細胞條件培養(yǎng)基對急性缺血再灌注腎損傷的修復作用

        2017-12-21 02:59:28潘勇軍
        創(chuàng)傷外科雜志 2017年12期
        關鍵詞:模型

        汪 娟,潘勇軍,張 杰

        ·論 著·

        人胎盤間充質干細胞條件培養(yǎng)基對急性缺血再灌注腎損傷的修復作用

        汪 娟,潘勇軍,張 杰

        目的觀察尾靜脈注射人胎盤間充質干細胞條件培養(yǎng)基(human placenta-mesenchymal stem cell conditional medium,MSCs-CM)對急性缺血再灌注腎損傷(acute renal ischemia reperfusion injury,IR)的修復作用。方法健康雄性SD大鼠(n=30)分為3組:空白對照組(sham組),模型組(IR組)和治療組(IR+MSCs組),每組10只。制備大鼠缺血再灌注腎損傷模型,建模24h后以尾靜脈注射MSCs條件培養(yǎng)基,并連續(xù)跟蹤4d監(jiān)測血清及尿液的肌酐含量,隨后取腎臟組織行過碘酸雪夫反應(PAS)染色檢查觀察腎臟損傷及修復狀況;經2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)法檢測腎組織內活性氧含量;Western Blot法檢測腎臟組織內血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1,HO-1)及磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1(NAPDH quinineoxidoreductase-1,NQO-1)的相對表達水平。結果模型組大鼠的血、尿肌酐含量相對于空白正常組明顯升高,出現(xiàn)腎損傷;而治療組大鼠的血、尿肌酐含量與IR組相比有明顯改善且與Sham組指標相似;PAS染色觀察顯示,模型組大鼠存在腎小管損傷,而治療組大鼠腎小管損傷明顯輕于模型組;Western blot分析顯示治療組細胞抗氧化標志物NQO-1和HO-1的蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.05)。結論MSCs-CM經尾靜脈移植后,對缺血再灌注所致的腎損傷具有明顯的修復作用,其修復腎臟損傷機制可能與抗氧化應激有關。

        腎損傷; 干細胞; 培養(yǎng)基; 缺血灌注

        急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是臨床中常見的高發(fā)病率、高病死率的疾病。腎缺血再灌注損傷(acute renal ischemia reperfusion injury,IRI)是AKI 發(fā)生的主要病因之一,其病理改變?yōu)榧毙阅I小管上皮細胞凋亡和壞死[1-2]。臨床上,對AKI的處理一直停留在腎臟替代治療和支持治療水平,急性期高病死率和后期演變?yōu)槁阅I臟疾病的現(xiàn)象多年來未得到改善。近年間充質干細胞治療腎缺血再灌注損傷成為研究熱點,間充質干細胞具有增殖分化能力,研究表明間充質干細胞可以分泌多種細胞因子,這些細胞因子在調節(jié)炎癥反應、參與修復損傷、抑制細胞凋亡等方面起到重要作用。目前已有研究表明間充質干細胞可以改善腎臟缺血再灌注所致的腎損傷[3-4],然而間充質干細胞移植也存在一定的問題,如間充質干細胞能否持續(xù)性生存在損傷環(huán)境中、如何解決歸巢率低等問題。

        本實驗利用間充質干細胞可以通過旁分泌途徑對腎臟損傷起到保護和治療作用的特性,擬通過人胎盤血間充質干細胞條件培養(yǎng)基的制備,利用條件培養(yǎng)基來治療腎缺血再灌注損傷,觀察缺血再灌注的腎臟功能恢復情況,以證明胎盤間充質干細胞條件培養(yǎng)基對大鼠腎臟IR損傷有修復作用,期望為臨床治療提供新的思路和實驗依據(jù)。

        材料與方法

        1材料

        1.1動物模型 動物模型:雄性SD大鼠(購于武漢大學動物中心)共30只,體重200g左右,按照隨機分配的原則進行分組:正常組(Sham組) 、模型組(IR組)和治療組(IR+MSCs組)。

        1.2主要試劑 低糖-DMEM、EDTA-胰蛋白酶、胎牛血清、血紅素氧化酶-1(HO-1)及磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1(NQO-1)抗體及流式細胞儀檢測表面標記的所有抗體全部購自Sigma公司。

        2人胎盤間充質細胞條件培養(yǎng)基的制備

        健康產婦(無艾滋病、梅毒、乙型肝炎、丙型肝炎及其他傳染性疾病,無病理妊娠)獲得知情同意。在無菌條件下收集足月正常分娩的胎盤,采用貼壁培養(yǎng)法分離胎盤間充質干細胞,胎盤間充質干細胞傳代到第3代,通過倒置顯微鏡觀察細胞貼壁良好、融合度達80%時,經流式細胞儀檢測細胞表型鑒定,更換無血清培養(yǎng)基,24h后收集培養(yǎng)上清液,離心3 000g/10min,收集上清(在顯微鏡下觀察是否有細胞及碎片)即為人胎盤帶間充質干細胞條件培養(yǎng)基,分裝后-80℃儲存。

        3IR建模與注射

        術前12h對大鼠禁食,2%戊巴比妥(40mg/kg)麻醉,取腹部正中切口,逐層分離皮膚、皮下組織、腹膜,然后進入腹腔,找到腎蒂,用無創(chuàng)性動脈夾迅速夾閉雙側腎蒂,1h后去掉動脈夾,讓血流恢復灌注??瞻讓φ战M只進行剖腹。造模后24h,治療組大鼠尾靜脈注射1mL間充質干細胞條件培養(yǎng)基,模型組及空白對照組在相同時間點每只大鼠注射1mL無血清低糖-DMEM培養(yǎng)基。

        4標本的收集與檢測

        造模后每隔24h如潘景業(yè)等[5]所述方法剪尾取血0.1mL,4℃,3 000rpm/min離心,取上清液。取24h尿液,并記錄體積。以全自動生化檢測儀檢測血清肌酐(blood creatinine,B-Cr)及尿液肌酐(urine creatinine,U-Cr),連續(xù)收集并檢測4d,隨后處死大鼠,取腎臟組織進行過碘酸雪夫反應(PAS)染色,并采取Millar[8]法評分。

        5腎臟組織損傷形態(tài)學評分

        在放大倍數(shù)200X顯微鏡下觀察大鼠腎臟組織病理性變化,根據(jù)細胞壞死、腎上皮細胞刷狀緣破壞丟失、空泡化和腎小管擴張等情況對各組大鼠腎臟組織進行評分,每個大鼠取2張切片,每張切片至少20個連續(xù)視野,采取雙盲法分別由研究人員和病理醫(yī)師對腎臟組織進行評分,取雙方評分的平均值作為衡量腎小管損傷的指標。

        6腎臟組織內活性氧水平的測定

        2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)法:將腎臟組織稱重,按1∶20的比例置于4℃的的平衡緩沖液中勻漿得到5mg/mL的混合液,12 000rpm/min 離心,取上清液上全自動酶標儀檢測熒光值(488nm),得到熒光值后以空白對照組的數(shù)值為基準,其他組數(shù)值與其的比值即為組織內相對活性氧水平。

        7Western blot分析

        取等量的腎臟蛋白提取物(100μg)上樣,10%聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。電泳后,分離的蛋白電泳轉移到聚二氟乙烯膜上。把膜放置在封閉液(含5%脫脂牛奶和0.05% Tween 20的T-TBS)中孵育1h,室溫下膜和HO-1(1∶1000,Sigma)及NQO-1(1∶1000,Sigma)孵育1h,再辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3000,Sigma)室溫下和膜孵育1h,洗滌3次,電化學發(fā)光(ECL)反應檢測信號。

        8統(tǒng)計學分析

        結 果

        1實驗動物數(shù)量分析

        30只SD大鼠全部存活,均納入結果分析。

        2MSCs-CM對IR大鼠腎功能的影響

        血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)是評價腎功能的重要指標,其數(shù)值的高低反映腎臟損傷程度。根據(jù)前期實驗結果,發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比,模型組大鼠在缺血再灌注96h后腎功能惡化明顯;而與模型組相比,治療組BUN、血清肌酐S-Cr明顯降低(P<0.01)、尿肌酐U-Cr升高(P<0.01),這也與前期觀察到的大鼠一般情況的改善相對應。見圖1。

        3組織學分析

        在普通光學顯微鏡下觀察每組大鼠腎臟切片,行PAS染色,可見模型組造模后4d腎小管上皮細胞廣泛壞死,刷狀緣脫落明顯,小管呈空泡狀;而治療組光鏡下觀察到染色圖片與空白對照組結果相似,未現(xiàn)明顯的腎小管細胞脫落凋亡,刷狀緣完好。以特定標準評分得到治療組評分為2.899±0.023,IR組評分為3.798±0.055,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

        a b c

        圖1 移植MSCs-CM后急性腎損傷大鼠腎功能的變化。a.血尿素氮(BUN)的改變:對照組vs.模型組:**P<0.01;模型組vs.治療組:**P<0.01;b.血肌酐的改變:對照組vs.模型組:**P<0.01;模型組vs.治療組,**P<0.01;c.尿肌酐的改變:對照組vs.模型組,*P<0.05;模型組vs.治療組,**P<0.01

        a b

        圖2 造模后第4天大鼠腎臟組織形態(tài)(PAS染色 ×200)。a.空白對照組、模型組及治療組腎臟組織PAS染色;b.空白對照組、模型組及治療組病理評分,與空白對照組相比,模型組評分明顯增高(P<0.01);與模型組相比,治療組評分明顯降低(P<0.01)

        4IR損傷后腎臟組織內活性氧水平。見圖3。

        5IR損傷后腎實質中抗氧化物質蛋白質表達

        HO-1和NQO-1是抗氧化標志物,在IR損傷后96h,治療組腎臟組織中HO-1和NQO-1的蛋白水平表達明顯高于模型組。見圖4。

        圖3 DCFH-DA法檢測顯示腎臟缺血再灌注損傷各組腎臟組織內活性氧水平(n=5;*P<0.05)。與空白對照組相比,模型組活性氧水平明顯增高(P<0.05);與模型組相比,治療組評分明顯降低(P<0.05)

        a b c

        圖4 經尾靜脈注射間充質干細胞條件培養(yǎng)基96h后,各組大鼠抗氧化標志物HO-1和NQO-1的蛋白表達水平比較,以GAPDH為內參蛋白,比較目的蛋白條帶灰度值與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)條帶灰度值的比值。a.建模96h后,空白對照組、模型組及治療組HO-1、NQO-1的表達水平;b.HO-1表達水平比較:空白對照組vs.模型組,**P<0.01;模型組vs.治療組:**P<0.01;c. NQO-1表達水平比較:空白對照組vs. 模型組,**P<0.01;模型組vs.治療組:**P<0.01

        討 論

        近年來,多項研究闡明骨髓、脂肪、臍帶、胎盤組織等來源的間充質干細胞對腎臟損傷有治療作用[6-8],然而其機制尚未明確。Caplan和Dennis[9]提出間充質干細胞通過其內分泌作用機制修復腎臟損傷,同時Du等[10]報道人臍帶間充質干細胞也是通過內分泌機制保護和修復缺血再灌注所致的腎臟損傷,提示間充質干細胞內分泌或旁分泌機制的重要性。然而間充質干細胞的移植也存在一定的問題,如體內生存時間、歸巢率低、細胞移植的不良反應等。相比之下,條件培養(yǎng)基的獲取難度、操作性、安全性及有效性均優(yōu)于間充質干細胞移植。

        本研究通過利用人胎盤來源間充質干細胞條件培養(yǎng)基治療大鼠缺血再灌注急性腎損傷,觀察其對缺血再灌注腎損傷的修復作用及機制,以驗證間充質干細胞是通過旁分泌途徑對腎缺血再灌注損傷起到保護作用。實驗結果顯示,大鼠在缺血再灌注96h后,血肌酐、尿素氮明顯升高,尿量減少,而通過尾靜脈注射人胎盤間充質干細胞來源的條件培養(yǎng)基能顯著降低腎臟損傷;同時PAS染色均證實間充質干細胞條件培養(yǎng)基對缺血性急性腎功能衰竭造成的嚴重的腎小管病變,包括腎小管上皮細胞的大面積死亡均有十分良好的修復作用,表明人胎盤間充質干細胞來源的條件培養(yǎng)基對缺血再灌注腎臟損傷有修復作用。

        腎損傷的機制研究發(fā)現(xiàn),氧化應激是諸多腎臟疾病模型的發(fā)病機制。本研究應用目前檢測活性氧最有效的方法-DCFH-DA法檢測缺血再灌注后受損的腎臟組織中活性氧的水平,結果顯示模型組腎臟組織內活性氧水平明顯升高,而治療組腎臟組織活性氧水平明顯降低,說明人胎盤間充質干細胞來源的條件培養(yǎng)基可以降低缺血再灌注所致的受損腎臟組織的活性氧水平,從而降低氧化應激水平。

        為進一步闡明其機制,轉錄因子NF-E2相關因子2/抗氧化反應元件(Nrf2-ARE)是研究氧化應激機制中最重要的信號通路之一,HO-1和NQO-1是Nrf2-ARE信號通路中重要的下游靶基因[11]。本研究檢測了各組腎臟組織中HO-1及NQO-1的表達水平,HO-1可催化形成膽綠素、膽紅素、鐵離子。膽綠素和膽紅素是體內強有力的自由基清除劑,具有廣譜抗氧化能力,而鐵蛋白是細胞內抗氧化損傷能力的保護劑[12];NQO-1借助煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate reduced tetrasodium salt,NADPH)作為電子供體,催化醌類物質發(fā)生還原反應,降解醌類及其衍生物,阻止其進一步參與氧化還原反應和ROS活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生,發(fā)揮抗氧化應激作用[13]。結果顯示IR建模96h后,HO-1和NQO-1蛋白的表達在缺血再灌注所致的受損腎臟組織中明顯下降,而經過條件培養(yǎng)基治療后HO-1和NQO-1蛋白表達水平明顯增高,其與腎損傷生物學指標和組織學結果一致,提示為應對IR損傷后一系列腎臟損傷過程,MSC-CM通過誘導HO-1和NQO-1蛋白表達增多來增強了大鼠的抗氧化能力及抗損傷能力,與Wu 等[14]所報道的結果一致。

        綜上所述, 本實驗驗證了間充質干細胞條件培養(yǎng)基通過抗氧化應激保護可以治療急性缺血再灌注所致的腎損傷,且間充質干細胞條件培養(yǎng)基可以避免間充質干細胞帶來的不良反應,取材容易,給藥方便,安全性高;同時也驗證間充質干細胞可能是通過旁分泌途徑對腎臟缺血再灌注起保護作用,但間充質干細胞條件培養(yǎng)基如何調控HO-1及NQO-1的表達尚未知曉,需待進一步研究探討。

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        Themechanismofmesenchymalstemcellsconditionalmediumderivedfromhumanplacentarepairingtheacutekidneyischemia-reperfusioninjury

        WANGJuan1,PANYong-jun2,ZHANGJie3

        (1.Emergency Medicine,Huangshi Central Hospital,Edong Healthcare,Huangshi,Hubei 435000,China;2.Intensive Care Unit,Huangshi Traditional Chinese Medicine Hospital,Edong Healthcare,Huangshi,Hubei 435000,China;3.Edong Healthcare Group,Huangshi,Hubei 435000,China)

        ObjectiveTo observe the protective effect of tail vein injection of human placenta mesenchymal stem cell conditional medium(MSCs-CM) repairing ischemia reperfusion injury (IRI).MethodsTotally 30 healthy SD male rats were randomly divided into 3 groups,sham group,renal ischemia reperfusion model group(IR group) and MSCs conditional medium injection group(IR+MSCs group) with ten rats in each group. The rodent model of ischemia-reperfusion (IR) injury of kidney was established,MSCs conditional medium were administrated into caudal vein at 24h after IR. The Cr in serum and urine with consecutive 4 days were detected,and then kidney specimens were performed by PAS staining after rats were sacrificed,DCFH-DA was used to detect the content of active oxygen in renal tissue,and the relative expression of HO-1 and NQO-1 were detected by Western Blot.ResultsCompared with IR group,the creatinine from serum and urine in MSCs treated group (IR+MSCs group)were ameliorated apparently after MSCs-CM injection. The pathological histology results demonstrated that the morphological damage of the renal tubule was observed in IR group,and amelioration was observed in MSCs treated group(IR+MSCs group). PAS showed that rats in the sham group had renal tubular injury,which was more severe than that of the MSCs treated group(IR+MSCs group). Western Blot showed notably higher NAPDH quinone oxidoreductase 1(NQO1) and HO-1 protein expression,the two indicators of anti-oxidative capacity,in MSCs treated group(IR+MSCs group) than in sham group.ConclusionMSCs-CM transplanted after caudal vein is helpful for the repair of acute kidney injury induced by ischemia reperfusion injury. The repair mechanism might relate to the anti-oxidative stress.

        kidney injury; stem cells; medium; ischemia-reperfusion

        1009-4237(2017)12-0924-05

        R 692

        A

        10.3969/j.issn.1009-4237.2017.12.011

        435000 湖北,鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院急診醫(yī)學科(汪娟); 435000 湖北,鄂東醫(yī)療集團黃石市中醫(yī)院重癥醫(yī)學科(潘勇軍); 435000 湖北 黃石,鄂東醫(yī)療集團(張杰)

        張杰,E-mail:zhangjie888@sina.com

        2017-07-18;

        2017-08-01)

        秦 楠)

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