許 騰，張 玥，張海麗，辛鳳姣，王 艷，王鳳忠

(中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京 100081)

代謝組學技術在營養(yǎng)學研究中的應用

許 騰，張 玥，張海麗，辛鳳姣，王 艷，王鳳忠

(中國農業(yè)科學院農產品加工研究所，北京 100081)

代謝組學可以系統(tǒng)性地研究生物體受到擾動或干預后整體代謝水平的變化。文章概述了代謝組學技術的生物樣品采集與制備、分析技術、數(shù)據處理與統(tǒng)計分析、差異代謝物結構鑒定與代謝通路分析等方法與步驟及其在營養(yǎng)學研究領域中的應用，展望了代謝組學技術在營養(yǎng)學研究領域的應用前景，以期為下一步的研究提供參考。

營養(yǎng)學；代謝組學；核磁共振；氣相色譜-質譜；液相色譜-質譜

生物個體的各項生命活動以交織復雜的代謝網交互作用和影響，基于代謝組學的研究能夠反映出機體受到內外環(huán)境改變或擾動后相互協(xié)調的最終結果，而這個結果在代謝水平上得以放大，從而可以將宏觀的個體表征與機體內在的微觀因素聯(lián)系起來[1-2]。代謝組學起步相對較晚，近年來，高分辨率、高靈敏度的現(xiàn)代分析儀器和技術的進步推動了代謝組學的迅猛發(fā)展，目前，代謝組學已被廣泛應用到微生物學、動植物學、醫(yī)藥學、食品科學和環(huán)境科學等多個研究領域[3]。運用代謝組學技術建立起細胞與生物體小分子代謝產物復雜體系的研究模式，可以系統(tǒng)地研究食物的營養(yǎng)成分與機體的相互作用[4]，從而預防和干預一些慢性疾病和癌癥的發(fā)生與發(fā)展。

代謝組學是對基因組學、轉錄組學與蛋白質組學研究內容的擴展和延伸，因為小分子代謝物質才是生物體生命活動的表征和最終結果[5-8]，或者可以說代謝組學可作為探索機體內部信息機制的窗口。生物體內存在復雜、龐大的代謝網絡，承擔著機體內部物質、能量的產生與調節(jié)等生命活動[9-10]，這之中起調節(jié)作用的物質大部分是廣泛存在于體內的小分子代謝物質[2]。代謝組學技術通過非靶向的研究可以全景式地觀測到機體代謝輪廓的變化，而對小分子化合物進行定量靶向研究[11]，能盡可能多地掌握機體內部代謝化合物的上調與下調，及其變化對疾病、基因及外界環(huán)境因子的影響。

1 代謝組學研究的步驟與方法

代謝組學的研究步驟包括生物樣品采集與制備、分析技術、數(shù)據處理與統(tǒng)計分析、差異代謝物結構鑒定與代謝通路分析等幾個部分[12-13]。

1.1 生物樣品采集與制備

生物樣品的采集與制備是進行代謝組學分析和研究的初始步驟，也在一定程度上決定了能否獲得可靠的實驗結果。采集的樣本需要有一定的代表性，且應盡量避免因樣品本身存在的個體差異對后續(xù)的檢測分析結果產生的影響，同時在研究人類或動物組織樣品時，還需要考慮地域、年齡、性別、飲食及先天基因等多種因素的影響[14]。代謝組學的生物樣品一般為尿液、血液和組織等，組織樣品采集后，為避免代謝物改變，應迅速進行淬滅、預處理等操作，血液和尿液等體液樣品不需要猝滅，采集后應立即進行低溫離心，以除去細胞。處理后的樣品于-80℃或者液氮中保存，將樣品分裝成若干份，避免重復的凍結-解凍循環(huán)[15-16]。生物樣品不同，采集方法不同，其預處理方法也各異，應根據不同的化合物、不同的分析手段，選擇不同的提取條件和方法，進行方法優(yōu)化。代謝產物通常是利用“相似相溶原則”，把不同極性的物質分開，進行下一步分析[17]。在大規(guī)模非靶向代謝組學研究中，為保證分析數(shù)據的精密度和準確度，通常需要制備質控(QC)樣品，以監(jiān)測分析方法的穩(wěn)定性和可靠性。在采集與制備生物樣品過程中，原則上應盡量保證代謝產物信息的完整性。

1.2 分析技術

代謝組學的分析手段主要包括以核磁共振(NMR)和色譜-質譜(GC/LC-MS)為核心的兩大技術平臺[18]。目前，沒有任何一種技術能檢測分析一個細胞或者一個樣品中的全部代謝物，代謝組學的常用研究方法通常需要結合多種分析手段，將非靶向和靶向研究結合，實現(xiàn)優(yōu)勢互補。

1.2.1核磁共振技術—NMR NMR具有非選擇性和高通量的優(yōu)勢，可對待測化合物進行無偏向、無創(chuàng)性的分析檢測，結構解析準確，不需要繁瑣的前處理過程[19]。特別是1H NMR，因對含氫代謝物具有廣泛普適性而成為代謝組學分析的重要工具。NMR的缺點是靈敏度相對較低[20]，檢測線性范圍窄，所需樣品量相對質譜而言較多，且儀器的價格和維護費用比較昂貴，解決的辦法是提高磁場強度、使用超低溫探頭來提高靈敏度等[21]。此外，還可以與色譜、質譜聯(lián)用，如采用在線HPLC-NMR提高信號分辨率和對色譜峰的識別等[22]。

1.2.2氣質聯(lián)用技術—GC-MS 與代謝組學的其他分析方法相比，氣相色譜技術發(fā)展較為成熟，氣相色譜-質譜聯(lián)用分析技術廣泛用于多組分混合物中對未知組分的定性分析，具有高靈敏度、精密度及耐用性的特點[23]，且儀器購置價格較為低廉，其對應的代謝物數(shù)據庫較為完善和穩(wěn)定，是應用較為廣泛的一種代謝組學分析方法[24]。全二維氣相色譜/飛行時間質譜方法(GC×GC-TOF-MS)可以檢測到更多一維方法無法分離的色譜峰，具有更高的靈敏度和分辨效果，顯著提高了分析的效率[25]。不足之處是，GC-MS分析樣本準備工作比較繁瑣，生物樣品普遍需要衍生化處理才能檢測到足夠的代謝組分信息[26]，且難以充分有效地利用GC-MS得到的全部信息。

1.2.3液質聯(lián)用技術—LC-MS 相比于NMR靈敏度低、GC-MS樣品處理較復雜等問題，LC-MS可以實現(xiàn)對代謝產物的快速分析與鑒定，獲得精確分子量，其應用非常廣泛。與GC-MS相比較而言，LC-MS對樣本中代謝物信息的保留更加全面[27-28]。LC-MS常用的為電噴霧液質聯(lián)用技術(LC-ESI-MS)，特點是產生高電荷離子，使質荷比(m/z)降低到多數(shù)質量分析器可以檢測的范圍，擴展了分子量的分析范圍[29-30]。同樣，LC-MS也有缺陷，如在樣品制備過程中，來自生物樣本的低分子量代謝產物在有機溶劑萃取過程中將不可避免地丟失，目前其對應的代謝物庫仍然不健全，這給后期對代謝物的分析造成了一定的困難與挑戰(zhàn)。

1.3 數(shù)據處理與統(tǒng)計分析

利用代謝組學得到大量復雜、多維的信息后，如何正確分析和解釋代謝組學的數(shù)據，如何利用可視化分析工具揭示其潛在規(guī)律是代謝組學研究的關鍵。數(shù)據處理主要包括對原始大數(shù)據的處理和管理、多元變量標準化與統(tǒng)計、代謝網絡的模型構建和回歸擬合、標志物和通路鑒定與分析[9]。代謝組學的數(shù)據處理通常是對采集得到的數(shù)據進行分組、分類辨別，主要手段為模式識別技術，包括非監(jiān)督學習方法和有監(jiān)督學習方法[17]，進而研究機體受擾動后的代謝物變化規(guī)律及機制。其中，非監(jiān)督方法將非人為干擾得到的分組與樣品原始信息進行比較從而找出差異性物質，反映數(shù)據的原始狀態(tài)，獲得的結果與有監(jiān)督學習方法相比更為客觀，包括聚類分析、主成分分析和自組織圖等；有監(jiān)督學習方法是利用數(shù)學模型對樣品進行辨別和分組，包括辨別式功能分析、人工神經網絡、偏最小二乘法、偏最小二乘法-顯著性分析聯(lián)合法等[31]。近年來，支持向量機(SVM)方法表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)統(tǒng)計分析方法的預測精度，因此被廣泛應用到代謝組學數(shù)據的統(tǒng)計分析與處理中[8]。通過對獲得的多維復雜數(shù)據進行綜合定量、比較與考察，實現(xiàn)對信息的降維和挖掘，識別出差異性代謝物[32-33]。

1.4 差異代謝物結構鑒定與代謝通路分析

基于GC-MS和LC-MS等技術得到的代謝物信息可通過二級質譜確定差異代謝物的分子量和分子式，對比化合物結構數(shù)據庫、代謝物數(shù)據庫，得到可能的生物標記物及其相關生物信息[34-35]?；贜MR的代謝組學，通過解析代謝物的化學位移(一般是1H NMR)，結合數(shù)據庫和文獻對照對差異代謝物進行鑒定。識別機體中顯著性差異代謝物，確定代謝網絡中發(fā)生變化的關鍵信點及其影響的通路，最終闡明生物系統(tǒng)應對外界或機體內部相應刺激的調控機制。

2 代謝組學在營養(yǎng)學研究中的應用

代謝組學在營養(yǎng)學領域的應用稱為營養(yǎng)代謝組學，指在生物體不同的健康狀態(tài)與疾病狀態(tài)下，利用代謝組學的方法系統(tǒng)性地研究膳食與生物體代謝之間的交互作用及其對人體健康的影響[36]。目前，我國正面臨著營養(yǎng)缺乏與營養(yǎng)過剩的雙重問題，營養(yǎng)相關的慢性病的患病率逐年上升，如糖尿病、高血壓、肥胖等營養(yǎng)代謝病，嚴重威脅著國民健康[37]。研究表明，個性化膳食可使生物體內部代謝發(fā)生變化，進而影響生物體的健康狀態(tài)。隨著越來越多的人開始關注個性化營養(yǎng)的作用[38]，相關的研究報道也逐漸增多，附圖統(tǒng)計了Pubmed文獻數(shù)據庫中2002—2016年有關營養(yǎng)代謝組學研究的論文，從2010年開始，論文數(shù)目呈現(xiàn)指數(shù)趨勢增長，這也說明營養(yǎng)代謝組學研究將會是未來營養(yǎng)學研究的一大熱點。

附圖 pubmed數(shù)據庫營養(yǎng)代謝組學相關論文統(tǒng)計

代謝組學為營養(yǎng)學的研究提供了新的方向和平臺，現(xiàn)已廣泛應用到多個營養(yǎng)學研究領域中，如食物中生物活性成分作用機制研究、不同飲食和生理狀態(tài)下機體代謝差異研究、營養(yǎng)素量對機體代謝影響的研究、腸道微生物代謝的研究以及營養(yǎng)代謝病的研究。

2.1 食物中的生物活性成分對機體代謝的影響

食物能夠提供給人體所必需的大多數(shù)營養(yǎng)物質，也能提供一些調節(jié)人體機能的活性成分，這些活性物質在機體中的代謝調控機制也是營養(yǎng)學研究的一項重要任務[1]。Solanky等[39]利用動物模型對表兒茶酸的作用進行了研究，基于NMR的代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，表兒茶酸使SD大鼠內源代謝物水平發(fā)生了顯著改變，尤其二甲胺、肌酐、牛磺酸、檸檬酸鹽和α-酮戊二酸等，對差異性代謝物進行靶向分析，發(fā)現(xiàn)影響代謝通路的機制主要是通過表兒茶酸對腎臟功能的調節(jié)，使能量代謝從碳水化合物分解代謝轉變?yōu)橹舅岷桶被岱纸?。Zheng等[40]運用NMR代謝組學與多元統(tǒng)計相結合的方法研究補充低聚乳果糖對結腸炎大鼠氨基酸代謝的影響，通過血清代謝物的分析發(fā)現(xiàn)，補充低聚乳糖可使模型大鼠體內異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、檸檬酸、氧化三甲胺、?；撬釢舛冉档?，琥珀酸的濃度增加，影響了其全身的氨基酸代謝，將有助于機體免受氨毒性和氧化損傷。Fu等[41]運用代謝組學方法研究了綠茶多酚對D-半乳糖誘導衰老大鼠的保護作用機制，基于超高效液相色譜-質譜分析技術對其血漿樣品進行分析，結果表明，綠茶多酚可以通過干預卵磷脂、氨基酸和磷脂代謝途徑發(fā)揮抗衰老作用。這些研究通過對特定的生物活性成分進行代謝組學研究，分析其對機體代謝通路造成的影響，闡明了特定活性成分的作用機制，有利于進一步研究與實施相應的干預策略。

2.2 不同飲食、生理狀態(tài)下機體代謝差異的研究

代謝組學全組分的分析方法可以用來判斷不同營養(yǎng)物質組成、不同飲食習慣及生理狀態(tài)所對應的代謝表征。基于NMR的尿液代謝組學，Zheng等[42]研究了酪蛋白、乳清蛋白分別對肥胖青少年飲食干預的影響，為期12w的干預研究結果發(fā)現(xiàn)，酪蛋白脫脂牛奶干預后肥胖青少年尿中尿素排泄量顯著增加，而乳清蛋白脫脂牛奶干預后尿素排泄沒有顯著影響[42]。Lindsay等[43]通過代謝組學方法研究了健康孕婦在妊娠階段代謝的變化，結果表明，隨著妊娠過程的進展，母體血漿中的幾種必需和非必需氨基酸、長鏈多不飽和脂肪酸、左旋肉堿、乙酰肉堿、磷脂酰膽堿、神經鞘磷脂濃度均有明顯下降。Accardi等[44]通過基于高分辨質譜的代謝組學對軍事特定人員的營養(yǎng)狀況和健康指標進行分析，獲取軍事特定人群的血清樣本并研究其代謝差異，結果得到了61種代謝物可以作為生物標志物，用來評估特定軍隊機體的營養(yǎng)和健康狀況[44]。

2.3 營養(yǎng)素對機體代謝影響的研究

食物能夠為機體提供營養(yǎng)與能量，營養(yǎng)素缺乏或過量都會對機體代謝產生一定的影響。Toue等[45]基于代謝組學技術利用動物模型研究攝入過量的蛋氨酸對代謝的影響，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸攝入過多會導致大鼠腎上腺和睪丸的白細胞計數(shù)減少、胸腺萎縮、溶血性貧血等癥狀。早期的研究結果揭示高半胱氨酸是監(jiān)控蛋氨酸是否過量的良好標記物[46]。Kowalski等[47]運用代謝組學研究高脂肪日糧對小鼠骨骼肌葡萄糖代謝通路的影響，結果表明，過量的脂肪飲食可通過改變三羧酸循環(huán)導致肌肉葡萄糖代謝的缺陷。Matsuzaki等[48]通過血漿代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，尿素和α-酮異已酸可能是氨基酸過量攝入時的標志物。以上研究表明，代謝組學在監(jiān)控機體的營養(yǎng)素代謝方面有著獨到的優(yōu)勢，可以為營養(yǎng)素的適量、安全攝入提供科學依據與數(shù)據支撐。

2.4 腸道微生物代謝的研究

食物被人體攝入后，進入腸道首先會經過腸道微生物的作用。食物影響腸道微生物環(huán)境，而腸道微生物的狀態(tài)也會影響機體對食物成分的吸收與代謝[49-50]。Zheng等[51]研究了補充色氨酸對大鼠代謝的影響，基于代謝組學方法通過對大鼠肝組織、血清和糞便樣品的分析，發(fā)現(xiàn)色氨酸補充促進了大鼠體內的蛋白質合成，降低糞便中的三甲胺等含胺類物質，能夠調節(jié)腸道微生物代謝，降低大鼠體重。Takis等[35]基于NMR代謝組學研究白茶對人體尿液代謝譜的影響，發(fā)現(xiàn)高劑量攝入白茶對人體可能存在一定的危害，但是適量飲用白茶會提高機體腸道微生物菌群代謝物的濃度，如茶多酚、黃酮等具有高抗氧化能力的腸道菌群代謝物，引起代謝途徑中馬尿酸和檸檬酸上調、肌酐下降，增強機體腎功能。這些研究表明，腸道微生物代謝與人體代謝有著交互的作用和影響，代謝組學在腸道微生物相關研究的應用越來越廣泛。通過代謝組學的研究，可以深入了解機體代謝與微生物相互作用后的代謝變化。

2.5 營養(yǎng)代謝病的研究

營養(yǎng)代謝病是由于營養(yǎng)素如蛋白質、脂肪、碳水化合物在體內的代謝失衡，使得體內一個或多個代謝過程異常改變導致內環(huán)境紊亂而引起的疾病，如糖尿病、高血壓、肥胖、脂質代謝病等，嚴重危害人類健康，其發(fā)病機制及防治措施研究成為近幾年醫(yī)學研究的熱點和難點[52-53]。Onuh等[54]研究了雞皮蛋白水解肽飲食喂養(yǎng)原發(fā)性高血壓大鼠的尿液和血漿代謝組學，分析鑒定出多種可能參與血壓調節(jié)的生物標記物，且驗證了代謝物變化為通過精氨酸代謝途徑產生NO，從而達到血管舒張作用。Llorach等[55]通過HPLC-TOF-MS的代謝組學研究了20名有心血管疾病的志愿者在食用可可之后的代謝輪廓，揭示了可可與高血壓、心血管疾病之間的關系，表明適量范圍內食用可可，對心腦血管疾病有著積極的作用和影響。Men等[56]通過UHPLC-QTOF-MS代謝組學，從大鼠尿樣中成功鑒定了20個與肥胖相關的標志代謝物。此外，F(xiàn)iles等[57]采用代謝組學方法，揭示了老年急性肺損傷小鼠代謝譜與長鏈脂肪酸代謝相關。Gang等[58]發(fā)現(xiàn)脂質代謝和前列腺癌變有著密切的關系，研究表明，P300是調節(jié)脂肪酸合酶表達、脂質積累和前列腺癌細胞生長的關鍵因素[58]。以上研究表明，借助代謝組學能有效地闡明營養(yǎng)代謝病的發(fā)生、發(fā)展機制，為營養(yǎng)代謝病的預防和治療奠定理論基礎。

3 代謝組學在營養(yǎng)學研究中的挑戰(zhàn)和展望

綜上所述，代謝組學的研究方法從整體的角度評估不同的飲食、營養(yǎng)素、食物活性成分等對機體代謝的影響，探索生物體內代謝通路的改變，為營養(yǎng)學相關研究帶來新的突破。近年來，隨著分析儀器的發(fā)展與升級，NMR、MS等儀器分析能力的日益增強，代謝組學分析技術結合多維統(tǒng)計分析的方法在營養(yǎng)學研究中的作用日益凸顯。當然，代謝組學分析技術也存在一些難題，如質譜和核磁數(shù)據解析必須依靠專業(yè)知識和技能，歸納出有用的信息，而且得到分析結果尚需得到進一步確認等。在未來的研究中，代謝組學方法將會更加完善和便捷，能更有效地應用于機制研究、營養(yǎng)干預及診斷中。同樣，基于代謝組學的特點，對具有不同代謝表型的個體進行個性化的營養(yǎng)指導，可能成為今后營養(yǎng)代謝組學的重要研究方向。◇

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Applications of Metabonomics in Nutriology Research

XU Teng，ZHANG Yue，ZHANG Hai-li，XIN Feng-jiao，WANG Yan，WANG Feng-zhong

(Institute of Agro-products processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)

Metabonomics mainly investigates the quantitative detection of endogenous metabolites of biological system that is stimulated or disturbed，so as to study the dynamic metabolism changes induced by both internal and external factors.This review not only summarized the experimental methods and steps of metabonomics which included biological sample preparation，detection and analysis，data processing，differential metabolites identification and metabolic pathways analysis，but also summed up the application of metabonomics in nutriology research.In addition，the prospect and challenge of metabonomics technology in nutriology research were discussed，presented with a desire to be helpful for further study.

nutriology；metabonomics；NMR；GC-MS；LC-MS

農業(yè)部“948”項目(項目編號：2016-X31)；中國農業(yè)科學院創(chuàng)新工程(項目編號：125161015000150013)；北京市糧經作物產業(yè)創(chuàng)新團隊(項目編號：BAIC09-2017)；農產品質量安全監(jiān)管(風險評估)項目(項目編號：GJFP2017011)；西藏自治區(qū)科技重大專項(項目編號：Z2016B01N04)。

許 騰(1992— )，女，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)代謝組學。

王鳳忠(1972— )，男，博士，研究員，研究方向：功能食品與生物活性物質；王 艷(1985— )，女，博士，助理研究員，研究方向：功能食品與生物活性物質、營養(yǎng)代謝組學。

(責任編輯 李婷婷)