黃曉林，宋戈，張麗宏，梁杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱 150028）

乳制品中單糖、雙糖和低聚果糖的同時(shí)測(cè)定

黃曉林，宋戈，張麗宏，梁杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱 150028）

建立了高效液相色譜同時(shí)分離測(cè)定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等7種糖的方法。通過(guò)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到1.7和4.5除去樣品中蛋白質(zhì)，采用氨基色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。7種糖質(zhì)量濃度在0.01～10.0 mg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回收率在95.0%～104.1%，精密度(RSD)為1.98%～4.56%，檢出限在0.04～0.17 mg/g。該方法可用于乳制品中單糖、雙糖和低聚果糖的日常檢測(cè)。

單糖；雙糖；低聚果糖；乳制品；高效液相色譜；蒸發(fā)光散射

0 引言

乳糖是奶粉中含量較高的一種糖，可以促進(jìn)鈣離子的吸收和有益菌的成長(zhǎng)；低聚果糖具有改善腸道功能，增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)鈣鎂鐵等礦物元素吸收和抗突變性等多種功效；果糖、葡萄糖、蔗糖也是常用的食品添加劑。糖使用都有相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[1-4]，目前文獻(xiàn)報(bào)道糖含量的檢測(cè)方法主要包括示差折光檢測(cè)法[5-7]、電化學(xué)檢測(cè)法[8-12]、質(zhì)譜法[13]和蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[14-18]等，但有的靈敏度較低，有的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較差，有的不適用于乳制品檢測(cè)。

本方法針對(duì)乳制品，通過(guò)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值除去樣品中蛋白質(zhì)，采用氨基色譜柱分離，用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，同測(cè)定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，靈敏度高，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單實(shí)用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Waters2695高效液相色譜儀，Alltech2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,2300TH型超聲波振蕩儀。

1.2 材料試劑

果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.000 mg/mL)；乙腈(色譜純)；實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水；亞鐵氰化鉀水溶液質(zhì)量濃度為109 g/L；乙酸鋅水溶液質(zhì)量濃度為219 g/L；鹽酸溶液濃度為1.0 mol/L，氫氧化鈉溶液濃度為1.0 mol/L；以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Shodex NH2P-50色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：25 ℃；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；漂移管溫度為90℃；氣流量為2.2 L/min；流動(dòng)相A為水；流動(dòng)相B為乙腈；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0→15 min,10%A線性升至30%A；15→30 min,30%A；30→35 min,30%A勻速降至10%A,保持5 min。

1.3.2 樣品處理

乳粉：準(zhǔn)確稱(chēng)量3～4 g到三角瓶中，用50℃以下的水25 mL超聲溶解；液奶和酸奶：準(zhǔn)確稱(chēng)量10～20 g到三角瓶中,加入10 mL水搖勻。然后用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到1.7后，放置一分鐘后再調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到4.5，用水轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中定容搖勻，濾紙過(guò)濾后用0.45 μm濾膜過(guò)濾,供分析測(cè)定果糖、葡萄糖和低聚果糖，取濾膜過(guò)濾濾液稀釋10倍供分析測(cè)定蔗糖、乳糖。

1.3.3 定量測(cè)定

標(biāo)樣、配方乳粉樣品和酸奶樣品測(cè)定的色譜圖如圖1所示。圖1中，峰1～峰7分別為1果糖，2葡萄糖，3蔗糖，4乳糖，5蔗果三糖，6蔗果四糖，7蔗果五糖。

圖1 7種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、配方乳粉樣品和酸奶樣品色譜

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

關(guān)于糖類(lèi)檢測(cè)，國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3-4]推薦的色譜柱是NH2柱，流動(dòng)相為乙腈與水，比例為70∶30。通過(guò)改變乙腈與水的比例發(fā)現(xiàn)各種糖的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生顯著變化，并且隨著水的比例的增加而保留時(shí)間不斷縮短。經(jīng)過(guò)優(yōu)化通過(guò)改變乙腈與水的比例，當(dāng)以乙腈與水的比例為75∶25等度洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)果糖葡萄糖二者保留時(shí)間接近，無(wú)法完全分離。當(dāng)乙腈與水比例為以80∶20等度洗脫時(shí)，這兩種物質(zhì)分離度有所改善。當(dāng)乙腈與水比例從80∶20漸變到90∶10，發(fā)現(xiàn)二者分離效果較好，但蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖這三種低聚果糖保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致響應(yīng)小，靈敏度低，而乙腈與水比例為70∶30時(shí)，這三種低聚果糖保留時(shí)間適當(dāng)，靈敏度惡較高。通過(guò)嘗試乙腈與水比例從90∶10漸變到70∶30，果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖被洗脫出來(lái)，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖這三種低聚果糖在色譜柱柱前富集，再維持乙腈與水比例70∶30一段時(shí)間，加快低聚果糖的洗脫，保證了低聚果糖峰形不拖尾和較高的響應(yīng)，縮短整體的分離時(shí)間。所以在保證各組分良好分離的前提下，加快了乙腈上升的速率，縮短了分析時(shí)間，提高了靈敏度，最終的梯度程序?yàn)?.3.1節(jié)所述。

2.2 檢測(cè)器參數(shù)的確定

載氣流速和漂移管溫度是蒸發(fā)光散射檢測(cè)器中可以調(diào)節(jié)的兩個(gè)重要參數(shù)，建立HPLC-ELSD分析方法需要對(duì)這兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。由于蔗果五糖靈敏度較低，出峰時(shí)間較晚，所以選擇蔗果五糖為代表確定蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的參數(shù)。在相同的載氣流速下，漂移管溫度從60℃增加，流動(dòng)相逐漸得到充分揮發(fā)，噪聲不斷降低，而蔗果五糖的響應(yīng)不斷增加，當(dāng)漂移管溫度的溫度為90℃時(shí)信噪比最高，漂移管溫度的溫度進(jìn)一步增加，噪聲大小基本維持不變，而蔗果五糖的響應(yīng)開(kāi)始大幅度降低，信噪比就降低了如圖2（a），所以漂移管溫度確定為90℃。在其它條件不變的情況下，載氣流速越小，形成的物質(zhì)粒子半徑越大，對(duì)激光的散射能力越強(qiáng)，相應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)越大。但并不是載氣流速越小越好，因?yàn)楫?dāng)載氣流速太小時(shí)，流動(dòng)相不能完全揮發(fā)，背景噪聲會(huì)增加，信噪比也會(huì)降低。最優(yōu)載氣流速應(yīng)是在可接受噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大檢測(cè)響應(yīng)值時(shí)的最低流速。在相同的漂移管溫度下，載氣流速?gòu)?.5 L/min增加，流動(dòng)相逐漸得到充分揮發(fā)，噪聲不斷降低，而蔗果五糖的響應(yīng)不斷增加，當(dāng)載氣流速為2.2 L/min時(shí)信噪比達(dá)到最高，載氣流速進(jìn)一步增加，噪聲略有降低，而蔗果五糖的響應(yīng)開(kāi)始大幅度下降，信噪比就變小了如圖2（b），所以載氣流速確定為2.2 L/min。

2.3 樣品提取條件的確定

圖2 OPO信噪比與檢測(cè)器參數(shù)的關(guān)系

由于乳制品中含有較多的蛋白質(zhì)和脂肪，如果不除去蛋白和脂肪，不利于提取分離。由于糖易溶于水，用乙腈或乙醇等有機(jī)試劑沉淀，加入的量少，沉淀效果不好，加入的量多，會(huì)有部分糖析出，都會(huì)給出的結(jié)果帶來(lái)影響。加堿或硫酸銅沉淀蛋白，會(huì)導(dǎo)致糖類(lèi)化合物發(fā)生化學(xué)變化，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3-4]使用的亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作復(fù)合沉淀劑，可除去樣品中絕大部分蛋白質(zhì)和脂肪，效果要比加乙腈或乙醇等有機(jī)試劑沉淀、加堿或硫酸銅沉淀等其他方法好。但如果亞鐵氰化鉀和乙酸鋅復(fù)合沉淀劑加入的少，蛋白沉淀不完全，會(huì)給提取和凈化帶來(lái)困難，影響測(cè)定，加的過(guò)多會(huì)造成提取不完全導(dǎo)致被測(cè)物的損失，復(fù)合沉淀劑的濃度和用量不好控制，此外對(duì)色譜柱傷害大，影響色譜柱使用壽命。通過(guò)試驗(yàn)，用鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到1.7后，再調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值到4.5，沉淀蛋白效果好，糖類(lèi)不易析出，提取效果好，沒(méi)有外加入大量的鹽有利于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，回收率較好，準(zhǔn)確度較高。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

散射光的響應(yīng)值與粒子質(zhì)量的關(guān)系為I＝kmb，m表示待測(cè)組分的粒子質(zhì)量和，I表示待測(cè)組分所產(chǎn)生的散射光光強(qiáng)，k,b為常數(shù)。通過(guò)使用雙對(duì)數(shù)方法產(chǎn)生線性曲線,即對(duì)待測(cè)組分的濃度和響應(yīng)同時(shí)取對(duì)數(shù),得到線性方程lgI＝blgm＋lgk。分別配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，在最佳色譜條件下，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，得到7種糖的回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍，并以3倍信噪比時(shí)的進(jìn)樣濃度計(jì)算出了方法的檢出限如表1所示。

2.5 回收率

以同一個(gè)配方奶粉樣品為實(shí)驗(yàn)材料，加入一定量的合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定3次，以平均測(cè)定值計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。

2.6 方法的精密度

以同一個(gè)配方奶粉樣品為實(shí)驗(yàn)材料，稱(chēng)取樣品后加入5 mg/mL的7種糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液1.0 mL，進(jìn)行平行8次重復(fù)性實(shí)驗(yàn),計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。這7種糖的RSD在 1.98%～4.56%。由此可以看出，測(cè)定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好。

表1 7種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍和檢出限

表2 7種糖的回收率（n=3）

3 結(jié)論

本文重點(diǎn)研究了樣品的提取條件、色譜分離條件和檢測(cè)參數(shù)的設(shè)定，建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)同時(shí)測(cè)定乳制品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等7種糖的方法。該方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)單易操作，適合乳制品中單糖、雙糖和低聚果糖的日常檢測(cè)。

[1]GB 10765-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品[S].

[2]GB 14880-2012食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3]GB 5009.8-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的測(cè)定[S].

[4]GB 5009.225-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中果聚糖的測(cè)定[S].

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Simultaneous determination of monosaccharides,disaccharides and oligosaccha?rides in dairy products

HUANG Xiaolin,SONG Ge,ZHANG Lihong,LIANG Jie
(National Dairy Testing Center,Northeast Agriculture University,Harbin 150028,China)

A method for simultaneous determination of monosaccharides,disaccharides and oligosaccharides(fructose,glucose,sucrose,lactose,1-kestose,nystose,1F-Fructofuranosyl nystose)in dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was established.Protein in dairy products were mostly eliminated by adjusted pH to 1.7 and 4.5,separated on NH2column with a mixed solution of acetonitrile-water as mobile phase by gradient elution,and detected with an evaporative light-scattering detector(ELSD).All the seven sugars had good linearities with 0.01～10.0 mg/mL.The recovery were 95.0%～104.1%,the relative standard deviations(RSD)were 1.98%～4.56%,the minimum detect?able values were 0.04～0.17 mg/g.The method can be used for the routine analysis of these sugars in dairy products.

monosaccharides;disaccharides;oligosaccharides;dairy products;HPLC;ELSD

TS252.7

A

1001-2230（2017）11-0037-03

2017-03-29

黃曉林（1982-），女，工程師，從事乳制品檢測(cè)與研究。