楊 芳，王中興，王克剛，田 野，崔高超，魏騰飛

(1.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，陜西安康725000； 2.陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康725000；3.安康學(xué)院電子與信息工程學(xué)院，陜西安康725000)

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚果酒發(fā)酵工藝

楊 芳1，王中興1，王克剛3，田 野2，崔高超1，魏騰飛1

(1.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，陜西安康725000； 2.陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西安康725000；3.安康學(xué)院電子與信息工程學(xué)院，陜西安康725000)

通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚果酒發(fā)酵工藝。選擇發(fā)酵溫度、蔗糖添加量、接種量為自變量，桑葚果酒總殘?zhí)恰⒖偹?、總黃酮、乙醇、感官綜合評(píng)分作為因變量，對(duì)自變量各因素水平進(jìn)行多元線性回歸和多項(xiàng)式擬合。經(jīng)design expert 7軟件處理后得到的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度為15.3℃，接種量為8.00 g/L，蔗糖加入量為12.80 g/100 g。桑葚果酒預(yù)測(cè)值分別為：總殘?zhí)?.18 g/L、總酸6.82 g/L、總黃酮410.49 mg/L、乙醇14.12%vol、感官綜合評(píng)分81.91。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵桑葚果酒共3份，各項(xiàng)指標(biāo)實(shí)測(cè)值分別為：總殘?zhí)?.27 g/L、總酸6.61 g/L、總黃酮405.21 mg/L、乙醇14.21%vol、感官綜合評(píng)分82.33。實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值間的偏離率分別為-2.8%、3.1%、1.3%、-0.6%、-0.5%。根據(jù)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，平行制備3份樣品，所得桑葚果酒各指標(biāo)實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值接近，表明建立的回歸方程預(yù)測(cè)性良好。

桑葚； 果酒； 發(fā)酵工藝； 優(yōu)化； 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法

藥食同源的桑葚因其果肉多汁，色澤艷麗，香氣幽雅，色素含量高且穩(wěn)定，是釀酒的極佳原料[1]。桑葚中黃酮類(lèi)化合物具有增強(qiáng)毛細(xì)血管強(qiáng)度、抗自由基、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等生物學(xué)活性[2-8]。文獻(xiàn)報(bào)道桑葚水解物（含槲皮素-3-O-蕓香苷、槲皮素己糖苷、槲皮素鼠李糖基己糖苷、山奈酚、鼠李糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷和花青素-3-O-蕓香苷）具有抑制膳食丙烯酰胺誘導(dǎo)的活性氧過(guò)度產(chǎn)生，恢復(fù)細(xì)胞線粒體膜電位，抑制線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化和谷胱甘肽毒，增加冠動(dòng)脈流量，抑制腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化等作用。桑葚中有機(jī)酸以檸檬酸為主[10]。

有機(jī)酸同時(shí)也是決定果酒口感的重要風(fēng)味物質(zhì)。果酒中有機(jī)酸含量的高低與果酒的品質(zhì)有著密切的關(guān)系[11]。前期的實(shí)驗(yàn)表明，桑葚果酒中有機(jī)酸含量過(guò)高，容易造成酒味酸澀，酒體粗糙，難以入口，直接影響桑葚果酒的感官綜合評(píng)分。桑葚果酒發(fā)酵是將桑葚中葡萄糖、果糖、纖維素等多糖進(jìn)行酵解的過(guò)程。桑葚果酒殘存的總殘?zhí)呛块g接反映了酵解的程度。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化法是一種新型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。較均勻設(shè)計(jì)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化法能更靈敏地考察各因素間的交互作用，實(shí)驗(yàn)精確度更高，近些年逐漸被用于食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)[12-13]。本研究主要是通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化法來(lái)對(duì)桑葚果酒發(fā)酵條件進(jìn)行設(shè)計(jì)，選擇發(fā)酵溫度、蔗糖添加量、接種量為自變量，桑葚果酒總殘?zhí)?、總酸、總黃酮、乙醇、感官綜合評(píng)分作為因變量，對(duì)自變量各因素水平進(jìn)行多元線性回歸和多項(xiàng)式擬合，通過(guò)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)最佳桑葚果酒發(fā)酵工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：“大十”新鮮桑葚，產(chǎn)自陜西省安康市漢濱區(qū)張灘鎮(zhèn)。接種酵母菌為安琪活性干酵母。

試劑及耗材：30～60目聚酰胺、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化銨、無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、石油醚、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙醇、乙酸均為分析純，甲醇、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純。

儀器設(shè)備：上海光譜SP-723分光光度計(jì)、Agilent 7890A氣相色譜儀、四川優(yōu)普UPT-II超純水機(jī)、賽多利斯ALC-210.4微量分析天平、Thermo Legend Micro17R微量冷凍高速離心機(jī)、上海雷磁PHS-3C pH計(jì)、0.22 μm濾膜、Agilent DB-5氣相毛細(xì)管色譜柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定方法

1.2.1.1 桑葚釀造果酒總殘?zhí)呛康臏y(cè)定——3，5-二硝基水楊酸法（DNS法）[14]

1.2.1.2 桑葚釀造果酒總酸含量的測(cè)定

用鄰苯二甲酸氫鉀作基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定NaOH溶液。桑葚果酒以12000 r/min離心10 min后，移取上清液2 mL至離心管。用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，利用pH計(jì)來(lái)調(diào)節(jié)終點(diǎn)電位與預(yù)控電位。滴定終點(diǎn)電位是8.3[15]。記錄此時(shí)消耗的氫氧化鈉的體積。按下列公式計(jì)算桑葚果酒總酸含量：

總酸含量（g/L）=C×Vk×V1/V2。

其中：C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度g/mL，Vk為檸檬酸系數(shù)[10]，V1為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積（mL），V2為桑葚果酒上清液取樣體積（L）。

1.2.1.3 桑葚釀造果酒總黃酮——聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法[16]

1.2.1.4 桑葚釀造果酒乙醇含量測(cè)定——?dú)庀嗌V法[18]

GC條件：DB-5氣相毛細(xì)管色譜柱（30m×320μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度220℃；分流進(jìn)樣，分流比為20∶1；程序升溫，40℃保持4 min，然后以3.5℃/min升至50℃，再以25℃/min升至200℃；檢測(cè)器FID，檢測(cè)器溫度220℃，氫氣流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量11.5 mL/min；恒流模式，流速0.5 mL/min。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取乙醇標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?zhuān)節(jié)?度 分 別 成 為 0.02%vol、0.05%vol、0.1%vol、0.2%vol、0.3%vol的系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為1 μL，測(cè)定峰面積，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

每個(gè)果酒樣品取200 μL，用純水稀釋至10 mL后過(guò)濾上樣，進(jìn)樣量1 μL。故計(jì)算時(shí)的稀釋體積為50倍，每個(gè)樣品處理2次分別進(jìn)單針得到結(jié)果。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法（RSM）對(duì)影響桑葚果酒釀造的主要因素以發(fā)酵溫度（A，℃）、接種量（B，g/L）、蔗糖加入量（C，g/100 g）3個(gè)因素為響應(yīng)因子進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)因素設(shè)計(jì)5個(gè)水平，分別用代碼-α、-1、0、1、α（在本實(shí)驗(yàn)中α=1.682）表示，設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。以桑葚果酒總殘?zhí)?、總酸、總黃酮、乙醇、感官綜合評(píng)分為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)安排。

表1 設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.3 桑葚釀造果酒感官綜合評(píng)價(jià)

發(fā)酵型桑葚果酒制備完成，從果酒的色澤、香氣、滋味、風(fēng)格4個(gè)方面對(duì)桑葚果酒進(jìn)行評(píng)分，桑葚釀造果酒感官綜合評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇的測(cè)定線性關(guān)系考察

精密量取乙醇稀釋?zhuān)節(jié)舛确謩e為0.02%vol、0.05%vol、0.1%vol、0.2%vol、0.3%vol的系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定。以乙醇體積百分比（X）對(duì)峰面積積分值（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=2669.8192770x+1.4042169，R2=0.9999781。乙醇標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面分析

依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法試驗(yàn)方案進(jìn)行3因素5水平試驗(yàn)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排與桑葚果酒總殘?zhí)?、總酸、總黃酮、乙醇、感官綜合評(píng)分5個(gè)響應(yīng)值結(jié)果見(jiàn)表2。桑葚果酒樣品氣相色譜圖見(jiàn)圖2。

2.3 模型擬合及工藝優(yōu)化

以桑葚果酒總殘?zhí)?、總酸、總黃酮、乙醇、感官綜合評(píng)分分別為因變量，使用Design-Expert軟件采用二次多項(xiàng)式非線性模型對(duì)各影響因素和指標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，其方程如下：

圖1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.4 響應(yīng)曲面圖與等高值線圖

采用design expert 7軟件繪制二次多項(xiàng)式模型中A，B，C中任意2因素對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)的三維效應(yīng)曲面圖（其余自變量設(shè)為中心點(diǎn)值），見(jiàn)圖3—圖7。通過(guò)響應(yīng)面三維圖，可直觀地反映各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，有助于確定最佳釀造工藝參數(shù)范圍。

圖2 桑葚果酒色譜圖

圖3 發(fā)酵溫度和蔗糖加入量對(duì)桑葚果酒總殘?zhí)怯绊懙娜S曲面圖和等高線圖

圖4 發(fā)酵溫度和蔗糖加入量對(duì)桑葚果酒總酸影響的三維曲面圖和等高線圖

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)design expert 7軟件處理后得到的最佳條件為：發(fā)酵溫度為15.3℃，接種量為8.00 g/L，蔗糖加入量為12.80 g/100 g。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵桑葚果酒共3份，按照“1.2”各項(xiàng)方法進(jìn)行試驗(yàn)，模型預(yù)測(cè)值、桑葚釀造果酒檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)實(shí)測(cè)值、與模型預(yù)測(cè)值間的偏離率見(jiàn)表3。

圖5 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)桑葚果酒總黃酮影響的三維曲面圖和等高線圖

圖6 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)桑葚果酒乙醇含量影響的三維曲面圖和等高線圖

圖7 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)桑葚果酒感官綜合評(píng)分影響的三維曲面圖和等高線圖

表3 優(yōu)化發(fā)酵工藝驗(yàn)證

3 討論

黃正勇[19]的研究指出桑葚果酒發(fā)酵過(guò)程質(zhì)量控制的3個(gè)要素分別為蔗糖添加量、酵母菌的選擇及接種量、發(fā)酵溫度及時(shí)間控制。桑葚果酒乙醇產(chǎn)生的影響因素依次為發(fā)酵溫度＞接種量＞蔗糖添加量[20]。分析不同發(fā)酵工藝條件下，將桑葚果酒中總殘?zhí)?、總酸、總黃酮、乙醇4個(gè)因子與桑葚果酒的相關(guān)性，分析結(jié)果表明，乙醇(0.72266)與感官綜合評(píng)分呈正相關(guān)，總酸(-0.59133)與感官綜合評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，是影響果酒感官綜合評(píng)分的兩個(gè)重要因素。將桑葚果酒發(fā)酵工藝條件中發(fā)酵溫度、接種量、蔗糖添加量3個(gè)因子與桑葚果酒中乙醇、總酸的相關(guān)性，接種量(0.41813)、蔗糖添加量(0.57499)作為正向影響因素；發(fā)酵溫度(-0.04528)作為負(fù)向影響因素，影響程度輕。接種量（-0.57338）與總酸的負(fù)向相關(guān)性較高。發(fā)酵溫度在一定范圍內(nèi)偏低，酵母菌的代謝活動(dòng)相對(duì)較弱，發(fā)酵變得緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，對(duì)醇類(lèi)物質(zhì)的積累有負(fù)向作用。接種量的大小也直接影響發(fā)酵周期，直接決定生產(chǎn)菌種在發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)繁殖的速度和乙醇的產(chǎn)生速度。在本次試驗(yàn)中，當(dāng)接種量為0時(shí)，發(fā)酵完全依賴(lài)桑葚所含的天然酵母菌發(fā)酵，發(fā)酵溫度偏低，在短期內(nèi)無(wú)法形成優(yōu)勢(shì)菌，感染雜菌的機(jī)率增大，24 d總發(fā)酵時(shí)間相對(duì)該條件偏長(zhǎng)，導(dǎo)致桑葚果酒在24 d時(shí)總酸高出其他組。高濃度的初糖由于阻遏了乙醇脫氫酶產(chǎn)生，對(duì)果酒發(fā)酵有抑制作用。同時(shí)，高濃度糖導(dǎo)致高滲透壓、低水分均不利于酵母菌的生長(zhǎng)[20]。蔗糖添加量作為乙醇產(chǎn)生的正向影響因素應(yīng)該在一定的范圍內(nèi)發(fā)揮作用。

根據(jù)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，平行制備3份樣品，所得發(fā)酵型桑葚果酒各指標(biāo)實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值接近，表明建立的回歸方程預(yù)測(cè)性良好。在生產(chǎn)過(guò)程中，發(fā)酵溫度可設(shè)為15℃。

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Optimization of the Fermentation Process of Mulberry Wine by Central Composite Design-Response Surface Method

YANG Fang1,WANG Zhongxing1,WANG Kegang3,TIAN Ye2,CUI Gaochao1and WEI Tengfei1
(1.School of Modern Agriculture and Biotechnology,Ankang University,Ankang,Shaanxi 725000;2.Key Lab of Sericulture,Ankang,Shaanxi 725000;3.College of Electronic and Information Engineering,Ankang University,Ankang,Shaanxi 725000,China)

To optimize the fermentation process of mulberry wine,fermenting temperature,cane sugar adding level,and inoculating quantity were used as dependent variables,and residual sugar content,total acids,total flavonoids,ethanol content,and sensory comprehensive score were used as independent variables.On the basis of single-factor experiments,3-factor and 5-level central composite design was adopted,then validation test was conducted.The optimal fermentation parameters were summed up as follows through design expert 7 processing:fermenting temperature was at 15.3℃,inoculating quantity was 8.00 g/L,and cane sugar adding level was 12.80 g/100 g.The predicted values of mulberry wine were as follows:total residual sugar content was 3.18 g/L,total acids content was 6.82 g/L,total flavonoids content was 410.49 mg/L,ethanol content was 14.12%vol,and comprehensive sensory score was 81.91.The validation test demonstrated that,total residual sugar content was 3.27 g/L,total acids content was 6.61 g/L,total flavonoids content was 405.21 mg/L,ethanol content was 14.21%vol,and comprehensive sensory score was 82.33.The bias ratio of predicted values and real values were-2.8%,3.1%,1.3%,-0.6%,and-0.5%respectively.On the basis of the optimized fermentation parameters,3 wine samples were prepared and their predicted values and real values were very close,which proved the good predictability of the established regression equation.

mulberry;fruit wine;fermentation technology;optimization;central composite design-response surface method

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）12-0021-06

10.13746/j.njkj.2017258

陜西省教育廳科技專(zhuān)項(xiàng)（15JS003），安康市科技專(zhuān)項(xiàng)（2016AKZDCY001）。

2017-09-19

楊芳（1974-），女，陜西旬陽(yáng)人，講師，碩士，主要從事食品功能評(píng)價(jià)研究，E-mail：akxyyf@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-11-01；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20171101.1314.007.html。