劉玉芝 殷松樓 殷寒秋 王 凱

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，徐州 221002)

嗎替麥考酚酯對(duì)肺成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及功能影響①

劉玉芝 殷松樓 殷寒秋 王 凱

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，徐州 221002)

目的通過(guò)嗎替麥考酚酯(MMF)對(duì)體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞(LF)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)過(guò)程的干預(yù)，觀察MMF對(duì)LF轉(zhuǎn)化及CTGF、FN蛋白表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)新生大鼠來(lái)源的LF，加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為MF,分別加入終濃度為0 μmol/L(對(duì)照組)、0.1 μmol/L(低濃度組)、1 μmol/L(中濃度組)、10 μmol/L(高濃度組)的MMF進(jìn)行干預(yù)；倒置顯微鏡下觀察LF和MF形態(tài)，并用細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，分析MMF對(duì)LF轉(zhuǎn)化的影響；ELISA方法檢測(cè)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和纖維連接蛋白(FN)的水平。結(jié)果LF經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)96 h后轉(zhuǎn)化成MF，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示MMF能夠抑制α-SMA 的表達(dá)，但對(duì)已分化的肌成纖維細(xì)胞表型變化無(wú)影響;ELISA結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，MMF組CTGF和FN分泌水平均顯著下降(P<0.05),并呈一定的濃度依賴。結(jié)論MMF能夠抑制肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和 CTGF、FN表達(dá)，提示MMF有抗纖維化作用，影響CTGF和FN表達(dá)可能是作用途徑之一。

TGF-β1;嗎替麥考酚酯;結(jié)締組織生長(zhǎng)因子;纖維連接蛋白; 肺成纖維細(xì)胞；肌成纖維細(xì)胞

間質(zhì)性肺病(Interstitial lung disease,ILD)是結(jié)締組織病中常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，預(yù)后差、目前治療方法有限。ILD主要的病理改變是肺泡、肺間質(zhì)、支氣管不同程度的炎癥反應(yīng)及纖維組織增生。早期是以滲出性病變?yōu)橹鞯姆闻菅祝S后在大量細(xì)胞因子的刺激作用下如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)成纖維細(xì)胞病理性增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(Myofibroblast，MF)，后者具有更強(qiáng)的分泌功能致細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)異常積聚,導(dǎo)致不可逆性的肺間質(zhì)纖維化[1]。目前，ILD以糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療為主，但部分患者效果欠佳，有時(shí)因副作用大不能耐受，給治療帶來(lái)困難。嗎替麥考酚酯(Mycophenolat mofetil，MMF)是一種較為新型的免疫抑制劑， 有研究表明MMF有抑制肺成纖維細(xì)胞(Lung fibroblasts，LF)增殖和抗纖維化作用，但也有爭(zhēng)議的報(bào)道[2，3]。本研究旨在觀察MMF對(duì)LF轉(zhuǎn)化及分泌功能影響,探討MMF抗纖維化作用可能性。

1 材料與方法

1.1材料 新生SD大鼠購(gòu)自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰酶，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；TGF-β1重組細(xì)胞因子溶解稀釋液套裝購(gòu)自聯(lián)科生物公司；兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體、兔抗波形蛋白抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購(gòu)自微科曼得生物工程有限公司；大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor，CTGF)、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)perkinelmer公司；CKX-3倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；研究級(jí)正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1大鼠LF的原代培養(yǎng)和傳代 將新生SD大鼠置于75%酒精消毒，無(wú)菌條件下取肺，PBS反復(fù)沖洗后將肺組織剪成1 mm3大小再均勻接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱4 h，組織塊貼壁后加入完全培養(yǎng)基3 ml繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d換液，待LF接近鋪滿皿底時(shí)胰酶消化傳代，取第4～5代生長(zhǎng)良好的LF用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)化前(Before-differentiation) 將LF以1×105/孔接種于6孔板中， 24 h后分別加入MMF(0、0.1、1、10 μmol/L)設(shè)為對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組，共培養(yǎng)96 h；另取接種在6孔板中的LF加入0、低、中、高濃度MMF，同時(shí)分別給予5 μg/L的 TGF-β1共培養(yǎng)96 h，此為轉(zhuǎn)化過(guò)程中(During-differentiation)；轉(zhuǎn)化后(After-differenti-ation)：制備以上相同LF四組，分別給予5 μg/L的 TGF-β1培養(yǎng)96 h后，再分別加入0、低、中、高濃度MMF共培養(yǎng)48 h。達(dá)到作用時(shí)間后收集各階段實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液備用。

1.2.3LF和MF形態(tài)觀察 普通倒置顯微鏡下觀察LF和MF的形態(tài)。

1.2.4LF和MF的鑒定及分析MMF對(duì)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LF接種于含有小圓玻片的6孔板中，并按照上述轉(zhuǎn)化前、轉(zhuǎn)化中及轉(zhuǎn)化后的方法處理各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，分別達(dá)到作用時(shí)間后，取出圓玻片到12孔板，用PBS洗滌(3 min×3次)；甲醇固定30 min后洗滌(3 min×3次)；加入500 μl封閉液37℃條件下30 min后洗滌(3 min×3次)；加入1∶250稀釋兔抗波形蛋白抗體300 μl(加入1∶290稀釋兔抗α-SMA抗體300 μl)4℃過(guò)夜；復(fù)溫37℃30 min后洗滌(3 min×3次)；加入400 μl 1∶50稀釋TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(加入400 μl 1∶150稀釋Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗)，室溫避光孵育1 h后洗滌(3 min×3次)；加入DAPI 3～5 min后洗滌(3 min×3次)；取出圓玻片加熒光淬滅劑，立即熒光顯微鏡下觀察拍照,轉(zhuǎn)化中及轉(zhuǎn)化后各實(shí)驗(yàn)組每組隨機(jī)取3張片，應(yīng)用軟件Image-Pro plus 6.0分別計(jì)算每組每張片的熒光強(qiáng)度，再計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組平均熒光強(qiáng)度。

1.2.5ELISA方法檢測(cè)CTGF、FN的水平 對(duì)于收集到的各階段細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照大鼠CTGF 和FN ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定，每組3復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1LF和MF形態(tài) 普通倒置顯微鏡下可見大鼠LF貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、條索狀，也有少數(shù)不規(guī)則三角形，胞漿豐富，部分細(xì)胞融合成片，部分細(xì)胞之間邊界清晰。大鼠的肺MF增殖明顯,由長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形、細(xì)胞之間邊界清楚的LF轉(zhuǎn)化為扁平狀、體積較大且邊界不清的MF。MF形態(tài)變化明顯說(shuō)明經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)96 h后，分化顯著。

2.2大鼠LF和MF的鑒定 如圖1為培養(yǎng)的第三代LF，DAPI表示著染的細(xì)胞核，Vimentin表示成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)記胞漿波形蛋白染色陽(yáng)性，Merge為合成后的細(xì)胞；圖2 LF經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)96 h轉(zhuǎn)化成的MF，DAPI表示著染的細(xì)胞核，α-SMA表示肌成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)記α-平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陽(yáng)性，Merge為合成后的細(xì)胞。

2.3MMF對(duì)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

2.3.1MMF對(duì)轉(zhuǎn)化中成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響 細(xì)胞免疫熒光顯示MMF對(duì)LF表型轉(zhuǎn)化的影響如圖3所示，TGF-β1刺激組(對(duì)照組)與加入低濃度的MMF組α-SMA熒光信號(hào)較強(qiáng)，而中濃度及高濃度MMF組α-SMA熒光信號(hào)逐漸減弱；各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度分別為TGF-β1刺激組(對(duì)照組)(86.35±1.25)、低濃度MMF組(71.96±12.02)、中濃度MMF組(61.85±13.11)、高濃度MMF組(44.04±9.51)，與TGF-β1刺激組比較，中高濃度MMF組均可抑制α-SMA表達(dá)(分別為P<0.05，P<0.01)，見圖4。

2.3.2MMF對(duì)已分化MF表型的影響 如圖5所示，與對(duì)照組比較，各濃度MMF組α-SMA熒光信號(hào)變化不明顯；各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)分別為對(duì)照組(117.72±13.79)、0.1 μmol/L MMF組(116.73±14.01)、1 μmol/L MMF組(113.96±14.15)、10 μmol/L MMF組(110.62±15.39)，各濃度MMF組分別與對(duì)照組比較，均不能抑制肌成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)(P>0.05)，見圖6。

2.4CTGF、FN的表達(dá) ELISA方法定量檢測(cè)可見，MMF對(duì)成纖維細(xì)胞分泌CTGF和FN有明顯的抑制作用。轉(zhuǎn)化前 MMF可抑制肺成纖維細(xì)胞分泌CTGF、FN，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中高濃度組更明顯(P<0.01)；轉(zhuǎn)化中 MMF對(duì)轉(zhuǎn)化中成纖維細(xì)胞分泌CTGF呈濃度依賴性抑制，而低濃度的MMF就可顯著降低FN的表達(dá)(P<0.01)； 轉(zhuǎn)化后：與對(duì)照組比較，各濃度組的MMF對(duì)肌成纖維細(xì)胞分泌CTGF、FN均無(wú)抑制作用(P>0.05)，見表1～3。

圖1 大鼠LF熒光染色結(jié)果(×200)Fig.1 Immunouorescence staining of rat lung fibroblast(×200)

圖2 大鼠MF熒光染色結(jié)果(×200)Fig.2 Immunouorescence staining of rat myofibroblast(×200)

圖3 MMF對(duì) TGF-β1 誘導(dǎo)的LF 表型轉(zhuǎn)化α-SMA 表達(dá)的影響(× 200)Fig.3 Effect of MMF on alterations of α-SMA expression in TGF-β1 induced LF (× 200)Note: 1.Control group；2.TGF-β1+0.1 μmol/L MMF；3.TGF-β1+1 μmol/L MMF;4.TGF-β1+10 μmol/L MMF.

圖4 轉(zhuǎn)化中各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的比較 Fig.4 Average fluorescence intensity of each during-differentiation subgroupNote: Compared with TGF-β1 group，*.P<0.05,#.P<0.01.

圖5 MMF對(duì) MF表型的影響(× 200)Fig.5 Effect of MMF on phenotype of MF(× 200)

圖6 轉(zhuǎn)化后各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的比較Fig.6 Average fluorescence intensity of each after-differentiation subgroupNote: Compared with control,*.P>0.05.

GroupsCTGF(ng/L)FN(pg/ml)Controlgroup22.35±1.063.96±0.530.1μmol/LMMF18.10±0.771)3.31±0.081)1μmol/LMMF16.46±2.752)2.59±0.132)3)10μmol/LMMF12.56±2.092)4)5)2.25±0.112)4)

Note：Compared with control group,1)P<0.05，2)P<0.01;compared with 0.1 μmol/L MMF,3)P<0.05，4)P<0.01;compared with 1 μmol/L MMF,5)P<0.05.

GroupsCTGF(ng/L)FN(pg/ml)Controlgroup24.93±3.194.64±0.34TGF-β1+0.1μmol/LMMF22.74±7.543.58±0.172)TGF-β1+1μmol/LMMF16.85±0.981)3.34±0.452)TGF-β1+10μmol/LMMF12.87±1.922)3)2.64±0.342)4)5)

Note：Compared with control group,1)P<0.05，2)P<0.01;compared with TGF-β1+0.1 μmol/L MMF,3)P<0.05，4)P<0.01;compared with TGF-β1+1 μmol/L MMF,5)P<0.05.

GroupsCTGF(ng/L)FN(pg/ml)Controlgroup26.18±1.065.67±0.770.1μmol/LMMF25.29±0.914.47±0.491μmol/LMMF23.82±4.204.24±1.5510μmol/LMMF23.32±1.294.80±2.13

3 討論

目前大量研究已經(jīng)證明成纖維細(xì)胞是間質(zhì)性肺病纖維化中起主要作用的細(xì)胞，尤其是肌成纖維細(xì)胞的多種功能如遷移、增殖、分泌ECM蛋白和細(xì)胞因子等相互作用，共同促進(jìn)了肺纖維化的發(fā)展[4-6]。TGF-β1就是最有效促纖維化因子，可通過(guò)TGF-β/Smad信號(hào)途徑誘導(dǎo)LF轉(zhuǎn)化為MF[7]。肺纖維化中成纖維細(xì)胞的反應(yīng)與ECM重構(gòu)及組織收縮能力相關(guān)聯(lián)，最終導(dǎo)致肺纖維化,這一動(dòng)態(tài)過(guò)程LF與MF都有參與，這兩種細(xì)胞的相互作用突出了肺纖維化發(fā)展的一個(gè)重要方面[8]。MF具有更強(qiáng)分泌細(xì)胞因子功能，如能抑制MF生成對(duì)阻止ILD發(fā)展有益。間質(zhì)性肺病是結(jié)締組織病較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，預(yù)后不良，目前治療方法有限，因此尋求有效安全的治療手段意義重大。MMF是一種較為新型免疫抑制劑,肝及骨髓毒性作用小，傳統(tǒng)應(yīng)用于移植領(lǐng)域，現(xiàn)也應(yīng)用于腎臟疾病、結(jié)締組織病和炎癥性腸病等療效顯著[9]。近期有學(xué)者將其應(yīng)用于結(jié)締組織病間質(zhì)性肺病(Connective tissue disease-interstitial lung disease，CTD-ILD)中且效果良好，張光峰等[10]認(rèn)為MMF在緩解或穩(wěn)定CTD-ILD患者的肺功能及影像學(xué)改變上其總體療效及生存率與環(huán)磷酰胺相當(dāng)，而且耐受性良好，但作用機(jī)制不清楚。

本實(shí)驗(yàn)在MMF干預(yù)的作用下，體外培養(yǎng)大鼠LF經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為MF來(lái)模擬肺纖維化病理過(guò)程，在ILD病理過(guò)程中，細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用，本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化后的MF分泌的CTGF和FN明顯升高。 FN是ECM的主要成分，過(guò)多沉積可導(dǎo)致ECM生成與降解失衡從而促進(jìn)肺纖維化發(fā)展，F(xiàn)N還能誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，也可能是促使肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要原因[11]。CTGF 是一種促纖維化細(xì)胞因子，作為TGF-β1的下游信號(hào)介質(zhì)協(xié)同 TGF-β1促進(jìn)FN沉積，抑制FN降解。CTGF與FN及二者之間的相互作用可能是促進(jìn)了ILD發(fā)生發(fā)展的重要方面。因此，抑制二者的生成與表達(dá)，對(duì)延緩CTD-ILD進(jìn)展可能會(huì)有積極的作用。

本研究結(jié)果顯示，中高濃度的MMF可抑LF表型轉(zhuǎn)化，阻斷CTGF表達(dá)和 FN沉積。但它對(duì)MF表型變化無(wú)影響，也不能降低MF分泌CTGF和FN,由此提示將MMF應(yīng)用于ILD早期可能會(huì)取得良好的效果，根據(jù)研究結(jié)果不難解釋臨床研究結(jié)果不一致，可能同選擇的病人ILD處于不同階段有關(guān)。Karim等[12]認(rèn)為MMF通過(guò)減少腎間質(zhì)纖維肌細(xì)胞以及Ⅲ型膠原的沉積從而延緩腎硬化的發(fā)生。MMF也能抑制由大劑量葡萄糖刺激的小鼠腎小球系膜細(xì)胞纖維連接蛋白和氧自由基的生成[13]。因此，MMF可通過(guò)抑制CTGF和FN的表達(dá)，達(dá)到對(duì)纖維化干預(yù)作用。

肺纖維化機(jī)制復(fù)雜，治療困難，特異性阻斷成纖維細(xì)胞分泌促纖維化蛋白的功能可能有望延緩和改善間質(zhì)性肺病發(fā)展，也需要更多的基礎(chǔ)研究和多中心臨床研究來(lái)探究ILD纖維化發(fā)病機(jī)制和尋求新的治療方法。

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Effectsofmycophenolatemofetilontransdifferentiationandfunctionoflungfibroblasts

LIUYu-Zhi，YINSong-Lou，YINHan-Qiu，WANGKai.

DepartmentofRheumatology,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221002，China

Objective:To investigate the effects of mycophenolate mofetil(MMF)on the differentiation and connective tissue growth factor(CTGF)and fibronectin(FN)expression of lung fibroblasts(LF)through interfering the transdifferentiation of LF into MF in vitro.MethodsLF of neonatal rat were cultured in vitro,induced into MF by transforming growth factor-β1(TGF-β1),and treated with different concentrations of MMF,which was 0 μmol/L(control group),0.1 μmol/L(low dose group),1 μmol/L(middle dose group)or 10 μmol/L(high dose group).Morphology of LF and MF were observed by inverted phase contrast microscope,the expressions of vimentin and α-smooth muscle actin (α-SMA)were identified by immunofluorescence staining,and then analyzed the effect of MMF on the transdifferentiation of fibroblasts.ELISA was used to detect the levels of connective tissue growth factor(CTGF)and fibronectin(FN).ResultsLF was induced into MF by TGF-β1 96 hours later.The immune fluorescence performance of α-SMA in the lung fibroblasts revealed MMF could suppress the expression of α-SMA,but had no effect on the phenotype of myofibroblasts.The results of ELISA showed that the levels of CTGF and FN were significantly decreased compar with that of control group and was concentration-dependent(P<0.05).ConclusionMMF can prevent lung fibroblasts from transdifferentiating into myofibroblasts and inhibit the expressions of CTGF and FN，suggesting that MMF has anti-fibrosis effect and one of the mechanisms is by suppressing the expressions of CTGF and FN.

TGF-β1；Mycophenolate mofetil；Connective tissue growth factor；Fibronectin；Lung fibroblast；Myofibroblast

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.005

R563.1

A

1000-484X(2017)12-1779-05

①本文受徐州市科技項(xiàng)目(KC16SH111)基金資助。

劉玉芝(1989年-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事間質(zhì)性肺病臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：2652263432@qq.com。

及指導(dǎo)教師：殷松樓(1965年-)，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事風(fēng)濕性疾病及其相關(guān)間質(zhì)性肺病臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail：yinsonglou@126.com。

[收稿2017-06-06 修回2017-06-26]

(編輯 許四平 劉格格)