楊 滿 吳 隼 張靈秀 黃 琰 字友梅 張 媛

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，衛(wèi)輝 453100)

miR-143調(diào)控PAN3蛋白的表達(dá)對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響①

楊 滿 吳 隼 張靈秀 黃 琰 字友梅 張 媛

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，衛(wèi)輝 453100)

目的探討miR-143調(diào)控PAN3蛋白的表達(dá)對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響。方法運(yùn)用qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-143在正常骨髓組織和淋巴瘤血液組織中的表達(dá)情況；檢測(cè)在不同種類的細(xì)胞株中miR-143的表達(dá)水平；qPCR檢測(cè)miR-143對(duì)PAN3的表達(dá)水平的影響；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-143和PAN3之間的相互關(guān)系；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-143表達(dá)對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤E6-1細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果和正常骨髓組織相比，miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)明顯下調(diào)；選取miR-143表達(dá)水平較低的E6-1細(xì)胞株；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明miR-143可以下調(diào)PAN3的表達(dá)水平，直接影響PAN3的表達(dá)活性；過表達(dá)miR-143后，E6-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯受到抑制，抑制E6-1細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論miR-143可以通過調(diào)控PAN3的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的遷移和侵襲行為。

miR-143；淋巴瘤；PAN3；Transwell

B細(xì)胞淋巴瘤是血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率很高的惡性腫瘤類型之一，在全球居第三位，在我國(guó)居第二位[1]。其最常見的致死原因是B細(xì)胞淋巴瘤早期診斷困難，容易轉(zhuǎn)移至面部，四肢甚至全身其他器官，合并多種并發(fā)癥，導(dǎo)致其死亡率居高不下[2]。盡管近期關(guān)于B細(xì)胞淋巴瘤的診斷治療取得很大進(jìn)展，但是其化療、放療的復(fù)發(fā)情況改善不佳，所以研究探討新的分子靶向機(jī)制是B細(xì)胞淋巴瘤診斷和治療方向上的研究熱點(diǎn)。

miRNA 可以通過與其靶基因的 mRNA 特定結(jié)合位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)，達(dá)到調(diào)控其生物學(xué)功能的作用[3]。尤其是目前研究表明，miRNA 可以對(duì)腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，達(dá)到抑癌或促癌的效果[4]。miR-143在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中都扮演著一定的作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-143對(duì)前列腺癌、胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞均有一定的抑制效果[5]。不過關(guān)于miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況及作用機(jī)制尚未有相關(guān)研究報(bào)道指出。

PAN3蛋白屬于RAS家族成員中的一個(gè)保守蛋白，其在細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中扮演重要角色，可以抑制凋亡蛋白酶的活性，抑制細(xì)胞的過度凋亡[6]。由于PAN3蛋白的編碼序列較為保守，其在多種細(xì)胞中都有表達(dá)[7]。最近研究表明其可以和上游mRNA的相關(guān)聯(lián)系對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共同調(diào)控[8]。

本研究旨在探討miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，明確miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中和PAN3蛋白的相關(guān)關(guān)系，探討其可能的作用方式。

1 材料與方法

1.1材料 B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株BJAB、A20，E6-1和OCI-LY3均獲自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件：在RPMI1640培養(yǎng)基中加入1%青霉素/鏈霉素。用5%胎牛血清在5%CO2空氣濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。鼠克隆單抗PAN3購(gòu)于Sigam公司(Sigam，F(xiàn)LJ40270)。miR-143-mimic購(gòu)買于上海吉瑪基因有限公司。Lipofecta mine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1臨床標(biāo)本采集與處理 收集2016年1月～8月在醫(yī)院手術(shù)切除并且經(jīng)病理檢查確診為B細(xì)胞淋巴瘤的血液樣本20例，同時(shí)取正常人血液樣本20例。樣本獲取得到醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意，患者均簽署知情同意書。

1.2.2qPCR試驗(yàn) qPCR法檢測(cè)miR-143表達(dá)。將E6-1細(xì)胞接種于六孔板，接種密度為1×106L-1， 培養(yǎng)36 h后按照Trizol說(shuō)明操作提取組細(xì)胞總RNA，檢測(cè)mRNA的濃度和純度。用在SsoFast EvaGreen試劑(Bio-Rad)中以1∶10稀釋的cDNA進(jìn)行qPCR測(cè)量。 將表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至相應(yīng)的參照基因。根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算檢測(cè)基因反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，98℃ 5 min。根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)量。

1.2.3雙熒光素酶試驗(yàn) 通過雙熒光素酶確證miR-143能夠靶向作用于PAN3。本實(shí)驗(yàn)將PAN3的3′UTR區(qū)構(gòu)建入雙光素酶報(bào)告基因載體。本次所用的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的載體包含兩個(gè)熒光素酶報(bào)告基因：一個(gè)是海腎熒光素酶報(bào)告基因，一個(gè)是熒火蟲熒光素酶報(bào)告基因，后者作為內(nèi)對(duì)照。將其分為NC組和miR-143-mimic組，分別使用不同的類似物處理，將上述基因的3′UTR構(gòu)建到海腎熒光素酶報(bào)告基因的直接下游區(qū)，如果3′UTR能夠被miR-143識(shí)別，則該3′UTR前面基因Luciferase的表達(dá)將被抑制，對(duì)比兩組之間的差異。

1.2.4劃痕愈合試驗(yàn) 將細(xì)胞密度調(diào)整為 5×105個(gè)/ml，接種到6孔板中，放置于5%CO2溫箱孵育過夜，使細(xì)胞匯合度達(dá)到 100%。細(xì)胞劃痕先用 Marker 筆在每個(gè)孔的背面做好標(biāo)記，以保證獲取數(shù)據(jù)的位置保持一致。用滅過菌的槍頭比著直尺，垂直于標(biāo)記線快速進(jìn)行劃痕。并用 PBS 緩沖液反復(fù)沖洗細(xì)胞孔，去除懸浮細(xì)胞。向培養(yǎng)孔加入不含血清的1640培養(yǎng)基，放置于 5%CO2的 37℃孵箱孵育。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的時(shí)間點(diǎn)取樣，在顯微鏡下拍照。測(cè)量劃痕的初始距離(0 time)；在24、48、72 h后，分別測(cè)量劃痕的距離，并拍照，計(jì)算細(xì)胞的遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 所有試劑及器材均于冰上預(yù)冷，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠50 μl(0.2 μg/μl)，37℃孵育15 min，凝固膠后；消化、離心、計(jì)數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞后，按照2.5×104ml-1用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；按照每孔200 μl，將細(xì)胞懸液加入Transwell上室，同時(shí)在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基600 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；甲醛固定，結(jié)晶紫染色10 min，然后用棉簽輕輕擦拭內(nèi)膜上的細(xì)胞。顯微鏡下技術(shù)，計(jì)數(shù)4個(gè)高倍視野(×40)下穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1檢測(cè)不同B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中miR-143的表達(dá) 通過qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常骨髓樣本和B細(xì)胞淋巴瘤樣本中miR-143的表達(dá)水平，miR-143在正常骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平相對(duì)較高[(85.62±6.21)% vs(18.6±2.62)%,P=0.016]。在不同B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中，miR-143的表達(dá)水平不盡相同，我們選取表達(dá)水平較低的E6-1細(xì)胞株作為后續(xù)試驗(yàn)對(duì)象，見圖1。

2.2雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-143和PAN3之間的關(guān)聯(lián) 為了尋找miR-143的下游靶點(diǎn)，我們利用生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-143的序列與下游PAN3基因的部分序列有相同的結(jié)合位點(diǎn)。我們通過雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，首先我們構(gòu)建了PAN3攜帶3′-UTR的熒光素酶報(bào)告因子，其中每個(gè)基因的結(jié)合位點(diǎn)與miR-143結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。熒光素酶測(cè)定顯示miR-143下游結(jié)合3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)PAN3相符合，過表達(dá)miR-143過后可以導(dǎo)致熒光素酶活性的顯著降低(圖2C)。過表達(dá)miR-143后可明顯下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中PAN3的表達(dá)(圖2A、B)。上述結(jié)果表明miR-143可以調(diào)控下游PAN3蛋白表達(dá)情況，可能是通過調(diào)控PAN3的表達(dá)影響B(tài)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株的生物學(xué)行為。

2.3miR-143表達(dá)影響B(tài)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞遷移能力 為了研究miR-143對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖能力的影響，使用E6-1細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以增加miR-143的表達(dá)。通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-143對(duì)E6-1細(xì)胞遷移能力的影響。miR-143-mimic組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度比其對(duì)照組明顯降低[(88.15±8.25)% vs(52.34±3.25)%,P<0.01]，培養(yǎng)72 h后抑制效果顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A、B)。綜上所述，miR-143可以調(diào)控E6-1細(xì)胞的遷移能力。

圖1 miR-143在B淋巴細(xì)胞瘤和細(xì)胞株中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-143 in B lymphoma and cell linesNote: A.miR-143 expression levels in normal bone marrow and B-cell lymphoma samples；B.miR-143 expression levels in different cell lines.

圖2 miR-143和PAN3蛋白之間的相互關(guān)系Fig.2 Correlation between miR-143 and PAN3 proteinsNote: A,B.miR-143-mimic regulation of miR-143 and PAN3 expression levels;C.Double luciferase assay to detect the relationship between miR-143 and PAN3.

2.4miR-143表達(dá)影響B(tài)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞侵襲能力 為了研究miR-143對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，使用HT-29細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以增加miR-143的表達(dá)。通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-143對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響。miR-143-mimic組細(xì)胞的侵襲數(shù)目比其對(duì)照組明顯降低[78.95±6.62)% vs(18.26±3.26)%,P<0.01]，差異顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-143后可以明顯抑制E6-1細(xì)胞株的侵襲能力。

圖3 劃痕愈合試驗(yàn)檢測(cè)miR-143對(duì)E6-1細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Scratch healing test to detect effect of miR-143 on migration of E6-1 cells

圖4 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)miR-143對(duì)E6-1細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.4 Transwell test to detect effect of miR-143 on invasion of E6-1 cells

3 討論

B細(xì)胞淋巴瘤是一種由多種因素引起的血液系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤[9]。由于目前早期診斷和發(fā)現(xiàn)水平存在一定缺陷，早期B細(xì)胞淋巴瘤的診斷尚未達(dá)到較高的水平，對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的診斷和治療預(yù)后都存在不利的影響[10,11]。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和基因檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，B細(xì)胞淋巴瘤的分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)獲得越來(lái)越多的關(guān)注，通過檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤的臨床分子靶標(biāo)，然后根據(jù)不同標(biāo)記物的情況對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤患者進(jìn)行早期診斷和個(gè)體治療是未來(lái)發(fā)展的熱門方向[12]。

miRNA是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種短序列的非編碼RNA因子，可以調(diào)控基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄過程[13]。在哺乳動(dòng)物中，miRNA一般是由21～24個(gè)核苷酸組成，通過與下游相關(guān)靶點(diǎn)形成復(fù)合物，來(lái)調(diào)控基因的翻譯過程或誘導(dǎo)靶向mRNA的降解過程[14]。新的證據(jù)表明，miRNA在多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、脂肪代謝、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等[15-17]。最近，部分miRNA在腫瘤中報(bào)道可以促進(jìn)或抑制惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲行為，為研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程提供了新的視角[18]。

有研究表明，某些mRNA在B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有一定的誘導(dǎo)或抑制作用[19]。因此，我們推測(cè)在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的致癌過程中誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)可能阻斷惡性腫瘤細(xì)胞的快速轉(zhuǎn)移與侵襲過程。雖然在胃癌、肝癌等實(shí)體腫瘤中已經(jīng)報(bào)道了miR-143水平存在一定的表達(dá)異常，但是B細(xì)胞淋巴瘤尚未有明確報(bào)道[20,21]。在本報(bào)告中，我們首次研究并選擇出高侵襲性的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，通過選擇的優(yōu)良B細(xì)胞淋巴瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞株模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)探索。

miR-143的抗轉(zhuǎn)移功能讓人聯(lián)想到與P53腫瘤抑制因子的作用功能相似[22]。通過激活腫瘤抑制因子對(duì)各種致癌信號(hào)做出相應(yīng)反應(yīng)，致癌作用可能是通過誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤中miR-143的表達(dá)影響B(tài)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的行為反應(yīng)，但是其具體的分子通路機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行探討及驗(yàn)證。

我們實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中可能扮演著抑癌因子的作用，并通過生物信息學(xué)檢測(cè)尋找miR-143下游的蛋白靶點(diǎn)PAN3。通過增加miR-143的表達(dá)檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的變化，推測(cè)miR-143可以抑制B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，從而調(diào)控其在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移行為。另外，我們通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，miR-143在乳腺癌細(xì)胞株中可以抑制Akt的磷酸化水平，減弱乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞的存活率[23]。但是在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中我們還未檢測(cè)相關(guān)蛋白通路的磷酸化水平，還不清楚miR-143是否通過信號(hào)通路激活抑制B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

在之前的研究中，有研究報(bào)道PAN3廣泛存在于各種侵襲性腫瘤細(xì)胞株中，在非侵襲性的腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平較低，表明PAN3可能在腫瘤細(xì)胞中起到促癌因子的作用[24]。而miR-143則在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá)與PAN3的表達(dá)相反。當(dāng)我們轉(zhuǎn)染miR-143-mimic和miR-143-inhibitor后，雙向證明其可以影響B(tài)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，通過雙熒光素酶試驗(yàn)我們知道PAN3的表達(dá)受miR-143的調(diào)控，但是PAN3能否逆向影響miR-143的抑癌作用，本實(shí)驗(yàn)尚未進(jìn)行完善探討，擬后續(xù)試驗(yàn)繼續(xù)檢測(cè)PAN3蛋白的過表達(dá)和敲除是否可以逆轉(zhuǎn)miR-143對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的抑制作用。然而有其他學(xué)者研究報(bào)道，通過慢病毒敲除PAN3蛋白的表達(dá)與過表達(dá)miR-143對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響程度類似，都對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用，但是通過慢病毒敲除PAN3的影響效應(yīng)相對(duì)較弱。我們推測(cè)這可能是因?yàn)閙iR-143下游的相關(guān)靶標(biāo)不止PAN3，盡管如此，仍可以表明miR-143對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，至少部分是通過調(diào)控PAN3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

總之，我們通過研究miR-143與下游PAN3靶點(diǎn)相互作用對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力的影響證實(shí)了我們對(duì)miR-143調(diào)控作用的猜測(cè)，補(bǔ)充了miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤中的生物信息學(xué)的調(diào)控方式。為B細(xì)胞淋巴瘤的臨床早期診斷和治療提供一定的分子理論支持，可以通過使用miR-143的類似物激活其表達(dá)來(lái)達(dá)到治療效果。后續(xù)我們繼續(xù)完善相關(guān)機(jī)制的研究為miR-143在B細(xì)胞淋巴瘤中的作用機(jī)制提供更多的理論支持。

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EffectsofmiR-143oninvasionandmigrationofBcelllymphomacellsthroughregulatingexpressionofPAN3protein

YANGMan,WUSun,ZHANGLing-Xiu,HUANGYan,ZIYou-Mei,ZHANGYuan.

DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Weihui453100，China

Objective:To investigate the effect of miR-143 on the invasion and migration of B cell lymphoma cells.MethodsThe expression of miR-143 in normal bone marrow and lymphoma was detected by qPCR.The expression levels of miR-143 in different cell lines were examined by qPCR.qPCR was used to detect the ability of miR-143 on PAN3.The relationship between miR-143 and PAN3 was detected by double luciferase assay.The effect of miR-143 expression on the migration ability of B cell lymphoma E6-1 cells was examined by scratch test.The effect of miR-143 expression on the invasion ability of B cell lymphoma E6-1 cells was exa mined by transwell test.ResultsCompared with normal bone marrow,miR-143 was down-regulated in B-cell lymphoma.Double luciferase assay showed that miR-143 could regulate the expression of PAN3.Overexpression of miR-143,E6-1 cells significantly reduced the ability to attack and migrate.ConclusionmiR-143 can regulate the migration and invasion of B cell lymphoma cells by regulating the expression of PAN3.

miR-143；Lymphoma；PAN3；Transwell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.004

R733.4

A

1000-484X(2017)12-1774-05

①本文為河南省教育廳基金資助項(xiàng)目(No.2006320039)。

楊 滿(1983年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事血液病學(xué)方面的研究，E-mail：mmyis2017@126.com。

[收稿2017-05-15 修回2017-06-19]

(編輯 許四平 劉格格)