李建華 韓 玲 楊志良

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院普外科,新鄉(xiāng) 453000)

miR-125b調(diào)控ART4蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響①

李建華 韓 玲 楊志良

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院普外科,新鄉(xiāng) 453000)

目的探討miR-125b對(duì)ART4蛋白的調(diào)控作用及在肝癌細(xì)胞中對(duì)其增殖和侵襲能力的影響。方法qPCR檢測(cè)肝癌組織和肝癌細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)情況；過表達(dá)miR-125b 后qPCR檢測(cè)ART4的表達(dá)；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125b和ART4的關(guān)系；MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125b的過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響；MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)ART4后逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)ART4后逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果miR-125b在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平較低，過表達(dá)miR-125b可以有效抑制ART4蛋白的表達(dá)；過表達(dá)miR-125b可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖侵襲能力；過表達(dá)ART4后可以逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞被miR-125b抑制的增殖侵襲能力。結(jié)論miR-125b在肝癌中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)miR-125b可以調(diào)控ART4的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。

miR-125b；肝癌；ART4；Transwell

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第二大癌癥死亡原因，是惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率居高不下的一種類型[1]。盡管目前針對(duì)肝細(xì)胞癌的手術(shù)、化療和生物治療方法都在不斷改善，但由于其本身高轉(zhuǎn)移率和術(shù)后高復(fù)發(fā)率，肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后現(xiàn)狀很差，不能達(dá)到令人滿意的程度[2]。因此，研究肝癌發(fā)病的高危因素和了解其具體分子發(fā)病機(jī)制對(duì)改善肝癌患者的治療至關(guān)重要。

微小RNA(microRNA)是由20～24個(gè)核苷酸編碼的非蛋白質(zhì)RNA，其可以通過靶向結(jié)合mRNA下游的39個(gè)非翻譯區(qū)位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控其靶基因的表達(dá)水平，干擾mRNA降解和翻譯過程[3,4]。目前已經(jīng)鑒定出多種miRNA異常表達(dá)，與多種類型的惡性腫瘤進(jìn)展相關(guān)[5,6]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在肝細(xì)胞癌中明顯下調(diào)，并且也顯示肝細(xì)胞癌的發(fā)生，轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)和預(yù)后有一定相關(guān)關(guān)系[7,8]。然而，需要進(jìn)一步的研究來確定miRNA對(duì)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制。以往研究報(bào)道，位于染色體脆性位點(diǎn)或異?；蚪M區(qū)域的幾種miRNA在人類惡性腫瘤的進(jìn)展中起著致癌或抑癌作用[9]。 MiR-125b位于19q13，在多種人類腫瘤表達(dá)水平下調(diào)，例如，在乳腺癌ERBB2依賴性SKBR3細(xì)胞系中，通過過表達(dá)MiR-125b可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，遷移和侵襲行為[10]。研究人員發(fā)現(xiàn)miR-125b可以抑制人胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，甚至減弱其耐藥性的產(chǎn)生[11]。此外，miR-125b在非小細(xì)胞肺癌中也存在表達(dá)水平降低的狀態(tài)，對(duì)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用[12]。miR-125b的過度表達(dá)可以誘導(dǎo)高侵襲性卵巢癌細(xì)胞從間充質(zhì)轉(zhuǎn)化為上皮形態(tài)，這表明miR-125b是卵巢EMT的負(fù)調(diào)節(jié)因子[13]。然而，目前尚沒有相關(guān)研究miR-125b在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)和作用。

ART4是一類在結(jié)構(gòu)上與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶類似的修飾蛋白，其可以共價(jià)修飾細(xì)胞內(nèi)影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的靶蛋白，調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[14]。哺乳動(dòng)物中ART由5名成員組成中分別是ART1～ART5，其中ART4已經(jīng)在小鼠模型進(jìn)行了廣泛的研究[15]。在5個(gè)已知的ART中，只有ART1、ART2和ART4才具有特異酶活性，ART3和ART5似乎已經(jīng)失去了相應(yīng)的催化活性，通常ART4在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)為活躍蛋白[16]。因此，探討ART4的編碼序列及蛋白功能發(fā)展方式是目前研究的主要方向。

在本研究中，我們將肝細(xì)胞癌組織與配對(duì)鄰近非腫瘤肝組織相比，miR-125b在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，且miR-125b的異常表達(dá)可以抑制體外和體內(nèi)肝癌細(xì)胞株的增殖和侵襲行為。因此，我們通過研究miR-125b與ART4的關(guān)系來進(jìn)一步探討其對(duì)肝細(xì)胞癌抑制作用的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株和相關(guān)試劑 細(xì)胞系和人體樣本人類肝癌細(xì)胞(SMMC7721，MHCC97L，MHCC97H)由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所提供。 HepG2細(xì)胞系獲自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC號(hào)：HB-8065，Manassas，VA)。將所有細(xì)胞系在1640 DMEM培養(yǎng)基，含有10%FBS，100 mg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，37℃在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。來自醫(yī)院病理科的80例患者的組織型肝癌組織均獲得了醫(yī)院保護(hù)人類受試者委員會(huì)的批準(zhǔn)，并獲得了所有患者的知情同意書。

1.2方法

1.2.1qPCR實(shí)驗(yàn) 使用Trizol(Invitrogen)從細(xì)胞系和組織樣品中提取總RNA，并通過測(cè)量其在260 nm處的吸光度來定量測(cè)定總RNA的濃度。使用SYBRH Green PCR Kit進(jìn)行qPCR分析。miR-125b和U6 snRNA的引物(內(nèi)部對(duì)照)購自QIAGEN(MS00003423和MS00033740)。使用22DDCT方法計(jì)算肝癌組織和相鄰非腫瘤肝組織的mRNA的倍數(shù)變化。通過qPCR測(cè)定肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中的相對(duì)mRNA水平，使用GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照引物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所使用的基因的引物如下。miR-125b的前體序列如下生成：正向5′-CTATGTTTGAATGA GGCTTCAG-3′和反向5′-CGCGTCGCCGCGTGTTT-AAACG-3′。

1.2.2Western印跡分析 使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與ART4抗體(濃度1∶1 000)，內(nèi)參GAPDH(濃度1∶2 000)，4℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標(biāo)記物(濃度1∶5 000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影液檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 驗(yàn)證miR-125b和ART4的相關(guān)關(guān)系，我們使用雙熒光素酶測(cè)定，將24孔板中的miR-125b或NC細(xì)胞與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體和0.08 mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對(duì)照載體共轉(zhuǎn)染，使用siPORTneoFX(Ambion，Austin，TX)，根據(jù)使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定(Applied Biosystems)測(cè)量熒光素酶活性。將螢火蟲熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化后測(cè)定海腎螢光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所使用的miR-125序列見上述1.2.1。

1.2.4MTT測(cè)定肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的速度 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸浮液并以1×103細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。在細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，加入20 μl MTT測(cè)定液，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在24、48、72和96 h進(jìn)行MTT測(cè)定波長為490 nm時(shí)的吸光度，計(jì)算肝癌細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

1.2.5細(xì)胞侵襲測(cè)定 對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲能力測(cè)定。將SMMC7721細(xì)胞在含有0.1%FBS的DMEM中培養(yǎng)。 24 h后，在沒有FBS或HGF的DMEM中的2×105個(gè)饑餓過的細(xì)胞用含有基質(zhì)膠的小室(直徑6.5 mm，孔徑為8 μmol/L，Corning，NY，USA)接種在上室中，將具有10%FBS和HGF(20 ng/ml)的培養(yǎng)基置于下腔中。在37℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面上的細(xì)胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈過后，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。三次獨(dú)立測(cè)定后取其平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16.0軟件包(SPSS，Chicago，IL)進(jìn)行，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析miR-125b在肝細(xì)胞癌和配對(duì)鄰近組織中的差異表達(dá)。采用單因素方差分析方法評(píng)估細(xì)胞增殖和侵襲試驗(yàn)三項(xiàng)之間差異，采用最小差別t檢驗(yàn)分析兩組。

2 結(jié)果

2.1MiR-125b在肝細(xì)胞癌組織和不同細(xì)胞株中的表達(dá)情況 使用qPCR檢測(cè)80例患者的肝細(xì)胞癌和配對(duì)臨近非腫瘤肝組織中miR-125b的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與匹配的相鄰肝組織相比，miR-125b的表達(dá)在肝細(xì)胞癌組織中下調(diào)(圖1A)。在不同肝癌細(xì)胞株中，在所有4種肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721、HepG2、MHCC-97L和HCC-LM3)中觀察到miR-125b的表達(dá)均較低，未超過50%相對(duì)表達(dá)量，其中(圖1B) SMMC-7721和其他細(xì)胞株相比，miR-125b表達(dá)最低，而且SMMC-7721的侵襲性相對(duì)較強(qiáng)。因此，我們選擇了SMMC-7721細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2雙熒光素酶驗(yàn)證miR-125b與ART4的關(guān)聯(lián) 我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，下游幾種致瘤性相關(guān)基因可作為miR-125b的潛在靶標(biāo)，包括MMP11、ERBB2、ERBB3、EDN1、VEGF-A、ART4和BCL-9L等等。而且miR-125b和下游ART4基因有相似可結(jié)合的位點(diǎn)，為了驗(yàn)證二者之間是否有調(diào)節(jié)關(guān)系，我們進(jìn)行雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。首先我們構(gòu)建了攜帶3′-UTR的熒光素酶報(bào)告因子，其中每個(gè)基因的結(jié)合位點(diǎn)與miR-125b結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。熒光素酶測(cè)定顯示miR-125b下游結(jié)合3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)與ART4相符合，而不是其他靶點(diǎn)基因，過表達(dá)miR-125b可以導(dǎo)致熒光素酶活性的顯著降低(圖2B)。過表達(dá)miR-125b后可明顯抑制SMMC-7721細(xì)胞中ART4的表達(dá)(圖2A)。表明miR-125b可以調(diào)控下游ART4的基因表達(dá)情況，可能是通過調(diào)控ART4的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為。

圖1 miR-125b的表達(dá)在肝癌癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-125b in liver cancer tissues and cell linesNote: *.P<0.05.

2.3過表達(dá)MiR-125b抑制肝癌細(xì)胞株的增殖能力 為了研究miR-125b對(duì)肝細(xì)胞癌增殖能力的影響，使用SMMC-7721細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以增加miR-125b的表達(dá)。如圖3所示，與對(duì)照組相比，qPCR分析證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-125-mimic后，SMMC-7721細(xì)胞株中miR-125b表達(dá)水平明顯上調(diào)。然后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125b對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖情況的影響。miR-125b-mimic組的細(xì)胞的生長速度比其對(duì)照組明顯減慢(P<0.01)，培養(yǎng)96 h后抑制效果顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。綜上所述，過表達(dá)miR-125b后可以明顯抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞株的增殖能力。

圖2 miR-125b與ART4之間的相互關(guān)系Fig.2 Relationship between miR-125b and ART4Note: A.Effect of miR-125b on expression of ART4;B.Double luciferase to verify the relationship between miR-125b and ART4,*.P<0.05.

圖3 miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of miR-125b on proliferation of liver cancer cells

圖4miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Fig.4EffectofmiR-125boninvasionoflivercancercells

Note: *.P<0.05.

圖5 過表達(dá)ART4可以逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的抑制Fig.5 Overexpression of ART4 can reverse inhibitory effect of miR-125b on proliferation of liver cancer cells

2.4過表達(dá)miR-125b抑制肝癌細(xì)胞侵襲能力 為了研究miR-125b對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲能力的影響，使用SMMC-7721細(xì)胞株進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染以增加miR-125b的表達(dá)。如圖4所示，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125b對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖情況的影響。miR-125b-mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)目比其對(duì)照組明顯減少[(186.5±15.1)% vs(48.4±4.2)%,P<0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，P<0.05)。綜上所述，過表達(dá)miR-125b后可以明顯抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞株的侵襲能力。

2.5過表達(dá)ART4可以逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的抑制 如上述實(shí)驗(yàn)所示，過表達(dá)miR-125b后肝癌細(xì)胞株增殖能力受到抑制，然后我們miR-125b-mimic組細(xì)胞中過表達(dá)ART4蛋白，觀察肝癌細(xì)胞株的增殖能力是否能被逆轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)，miR-125b-mimic+LV5-ART4組肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞生長速度快于對(duì)照組。我們可以得到結(jié)論，在肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)ART4蛋白可以逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)其的抑制能力，也側(cè)面說明了miR-125b和ART4之間有間接調(diào)控關(guān)系。

圖6過表達(dá)ART4可以逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的抑制

Fig.6OverexpressionofART4canreverseinhibitoryeffectofmiR-125boninvasionoflivercancercells

Note: *.P<0.05.

2.6過表達(dá)ART4可以逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的抑制 如上述實(shí)驗(yàn)所示，過表達(dá)miR-125b后肝癌細(xì)胞株侵襲能力受到抑制，然后我們miR-125b-mimic組細(xì)胞中過表達(dá)ART4蛋白，觀察肝癌細(xì)胞株的侵襲能力是否能被逆轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6，miR-125b-mimic+LV5-ART4組肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯多于對(duì)照組[(146.5±12.8)% vs(44.7±3.1)%,P<0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們可以得到結(jié)論，在肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)ART4蛋白可以逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)其的抑制能力，也側(cè)面說明了miR-125b和ART4之間有間接調(diào)控關(guān)系。

3 討論

肝細(xì)胞癌(HCC)在全球范圍內(nèi)都是影響人類健康的主要問題，對(duì)于感染了肝炎病毒的患者來說，肝癌的患病率會(huì)明顯升高[17]。目前手術(shù)仍是肝細(xì)胞癌最主要的治療療法，雖然化療、放療及生物療法一直在發(fā)展，但一切都是以手術(shù)為中心[18]。然而，超過80%的患者因肝功能受損或其他器官的原因，錯(cuò)了肝移植的最佳時(shí)期，手術(shù)切除局部肝臟是唯一的治療方案[19,20]。因此，除了手術(shù)治療之外，尋找發(fā)現(xiàn)新的分子靶向治療方案顯得尤為重要，可以明顯延長肝癌晚期患者的生存率，改善其生存質(zhì)量[21]。盡管目前尋找肝癌有效的治療靶向分子研較多，但是都尚在實(shí)驗(yàn)室階段，探討其具體分子機(jī)制也是必要的過程[22]。

最近幾項(xiàng)研究表明，肝癌組織中多種miRNA的表達(dá)下調(diào)明顯，可能與肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展相關(guān)[23]。然而，由于miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)數(shù)個(gè)下游靶信號(hào)通過相關(guān)信號(hào)通路影響腫瘤的行為，而信號(hào)通路的范圍較廣泛，未能徹底研究透徹，所以miRNA在肝細(xì)胞癌中的致癌原因和具體過程尚未得到充分的闡明。因此，探索肝癌腫瘤發(fā)展的miRNA的臨床潛力和分子機(jī)制對(duì)于延緩肝細(xì)胞癌發(fā)展和改善患者生活質(zhì)量是有幫助的。

以前的研究表明miR-125b在多種不同類型的腫瘤中表達(dá)下調(diào)，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等等[24-26]。而且人類miRNA微陣列的結(jié)果已經(jīng)表明肝癌組織中miR-125b低表達(dá)水平是普遍存在的[27]。然而這些研究都很少關(guān)注肝癌患者腫瘤樣本中miR-125b與相關(guān)下游靶基因作用后對(duì)其治療和預(yù)后價(jià)值的估計(jì)。在本研究中，肝癌組織與匹配非腫瘤相鄰肝組織相比，我們首次證實(shí)了miR-125b在肝細(xì)胞癌中顯著下調(diào)，而且miR-125b的低表達(dá)狀態(tài)與肝癌患者的進(jìn)展有一定關(guān)系。在肝細(xì)胞株中也同時(shí)觀察到miR-125b的表達(dá)水平較低，miR-125b的低表達(dá)水平可以抑制體外和體內(nèi)肝細(xì)胞癌的增殖和侵襲行為。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，MTT測(cè)定顯示，培養(yǎng)7 d后miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖的抑制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定結(jié)果為24 h，表明miR-125b對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用不是由細(xì)胞增殖減少引起的。因此，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明機(jī)制。

曾經(jīng)有研究表明，miR-125b可以阻斷p53腫瘤抑制基因的翻譯過程，影響其下游基因的表達(dá)，并且干擾乙型肝炎病毒表面抗原的表達(dá)[28]。使用生物學(xué)信息檢測(cè)法的分析表明，以下幾種相關(guān)癌基因包括都是miR-125b的潛在靶基因，MMP11、EDN1、VEGF-A、ART4和BCL-9L。有趣的是，miR-125b的過度表達(dá)并沒有明顯抑制所有下游靶基因的表達(dá)情況，這證明對(duì)于不同類型的腫瘤來說，miR-125b的抑制作用是不相同的[29]。而且根據(jù)雙熒光素酶報(bào)道分析證實(shí)，在肝癌細(xì)胞中，ART4是miR-125b下游的有效靶基因。通過qPCR和Western blot蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)的正確性。基于這些數(shù)據(jù)，我們懷疑miR-125b可以通過下調(diào)ART4來抑制肝細(xì)胞癌的增殖和侵襲。

以前的研究表明，靶向沉默ART4的表達(dá)能夠在體內(nèi)抑制腫瘤生長和腫瘤血管生成[30]，并且在缺氧條件下對(duì)肝細(xì)胞癌患者具有抗腫瘤功效[31]。我們的研究表明，ART4的上調(diào)可以逆轉(zhuǎn)miR-125b對(duì)肝細(xì)胞癌的抑制能力，進(jìn)一步證實(shí)miR-125a通過調(diào)控ART4的表達(dá)發(fā)揮相應(yīng)作用。

我們通過檢測(cè)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-125b的過表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，通過前面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)miR-125b在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，ART4在肝癌細(xì)胞系中上調(diào)。于是我們推測(cè)，在生理狀態(tài)下，miR-125b保持穩(wěn)定高表達(dá)的狀態(tài)，當(dāng)外界因素或自身情況影響抑制miR-125b的表達(dá)進(jìn)入病理狀態(tài)時(shí)，機(jī)體的平衡狀態(tài)被破壞，可能引起部分肝細(xì)胞的惡性突變，引發(fā)肝細(xì)胞癌的發(fā)生，且隨著病程進(jìn)展，可以影響到肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)闡明了miR-125b/ART4在肝癌中發(fā)生發(fā)展中的作用，有可能為肝癌的早期診斷和治療進(jìn)展方面提供參考意見。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[3] 鄭榮壽,左婷婷,曾紅梅,等.中國肝癌死亡狀況與生存分析[J].中華腫瘤雜志,2015,37(9):697.

[4] Ding J,Huang S,Wu S,etal.Gain of miR-151 on chromosome 8q24.3 facilitates tumour cell migration and spreading through down regulating RhoGDIA[J].Nat Cell Biol,2010,12(4):390-399.

[5] He XX,Chang Y,Meng FY,etal.MicroRNA-375 targets AEG-1 in hepatocellular carcinoma and suppresses liver cancer cell growth in vitro and in vivo[J].Oncogene,2012,31(28):3357-3369.

[6] Yang F,Zhang L,Wang F,etal.Modulation of the unfolded protein response is the core of microRNA-122-involved sensitivity to chemotherapy in hepatocellular carcinoma[J].Neoplasia,2011,13(7):590IN3-600IN4.

[7] Caygill EE,Johnston LA.Temporal regulation of metamorphic processes in Drosophila by the let-7 and miR-125 heterochronicmicroRNAs[J].Curr Biol,2008,18(13):943-950.

[8] Garbuzov A,Tatar M.Hormonal regulation of Drosophila microRNA let-7 and miR-125 that target innate immunity[J].Fly,2010,4(4):306-311.

[9] 魯艷明,銀 鐸,王 寧,等.miRNA-200c 對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力影響觀察[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(10):732-735.

[10] 李 楓,姚 麗,張喜紅,等.miRNA-22 在卵巢癌組織的表達(dá)及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖,遷移與侵襲的影響[J].中國病理生理雜志,2016,32(12):2251-2255.

[11] Kim SW,Ramasamy K,Bouamar H,etal.MicroRNAs miR-125a and miR-125b constitutively activate the NF-κB pathway by targeting the tumor necrosis factor alpha-induced protein 3(TNFAIP3,A20)[J].Proc Natl Acad Sci,2012,109(20):7865-7870.

[12] Jiang L,Huang Q,Zhang S,etal.Hsa-miR-125a-3p and hsa-miR-125a-5p are downregulated in non-small cell lung cancer and have inverse effects on invasion and migration of lung cancer cells[J].BMC Cancer,2010,10(1):318.

[13] Bi Q,Tang S,Xia L,etal.Ectopic expression of MiR-125a inhibits the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma by targeting MMP11 and VEGF[J].PLoS One,2012,7(6):e40169.

[14] Parusel I,Kahl S,Braasch F,etal.A panel of monoclonal antibodies recognizing GPI-anchored ADP-ribosyltransferase ART4,the carrier of the Dombrock blood group antigens[J].Cell Immunol,2005,236(1):59-65.

[15] Friedrich M,Grahnert A,Hauschildt S.Analysis of the 3′ UTR of the ART3 and ART4 gene by 3′ inverse RACE-PCR[J].DNA Sequence,2005,16(1):53-57.

[16] Durousseau de Coulgeans C,Chiaroni J,Bailly P,etal.Sequencing of the ART4 gene in sub-Saharan cohorts reveals ethnic differences and two new DO alleles:DO* B-Ile5Thr and DO* B-Trp266Arg[J].Transfusion,2015,55(10):2376-2383.

[17] 李 焱,程 朋.中晚期肝癌臨床治療進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志,2014,30(3):233-236.

[18] 戴朝六,趙 陽.原發(fā)性肝癌的綜合治療[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2014,21(2):133-137.

[19] Murakami Y,Yasuda T,Saigo K,etal.Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues[J].Oncogene,2006,25(17):2537-2545.

[20] 褚志強(qiáng),吳向未,楊宏強(qiáng),等.原發(fā)性肝癌手術(shù)治療的生存率分析及影響因素研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(5):787-789.

[21] Meng F,Henson R,Wehbe-Janek H,etal.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J].Gastroenterology,2007,133(2):647-658.

[22] Wang J,Liu X,Wu H,etal.CREB up-regulates long non-coding RNA,HULC expression through interaction with microRNA-372 in liver cancer[J].Nucleic Acids Res,2010,38(16):5366-5383.

[23] Zhang Y,Gao JS,Tang X,etal.MicroRNA 125a and its regulation of the p53 tumor suppressor gene[J].FEBS Lett,2009,583(22):3725-3730.

[24] Wojtowicz EE,Walasek MA,Broekhuis MJC,etal.MicroRNA-125 family members exert a similar role in the regulation of murine hematopoiesis[J].Exp Hematol,2014,42(10):909-918.e1.

[25] 郭曉東,張 璇,劉樹紅,等.miRNA-125 在肝癌中表達(dá)變化的研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013，(7):1253-1255.

[26] Potenza N,Papa U,Mosca N,etal.Human microRNA hsa-miR-125a-5p interferes with expression of hepatitis B virus surface antigen[J].Nucleic Acids Res,2011:gkr067.

[27] Raskopf E,Vogt A,Sauerbruch T,etal.siRNA targeting VEGF inhibits hepatocellular carcinoma growth and tumor angiogenesis in vivo[J].J Hepatol,2008,49(6):977-984.

[28] Jopling CL,Yi MK,Lancaster AM,etal.Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA[J].Science,2005,309(5740):1577-1581.

[29] 劉建華,程 濤,王洪敏,等.血清 miRNA 表達(dá)水平檢測(cè)與原發(fā)性肝癌早期診斷的研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2010,10(6):666-668.

[30] Fan R,Li X,Du W,etal.Adenoviral-mediated RNA interference targeting URG11 inhibits growth of human hepatocellular carcinoma[J].Int J Cancer,2011,128(12):2980-2993.

[31] Ezzat WM,Amr KS.Insights for hepatitis C virus related hepatocellular carcinoma genetic biomarkers:Early diagnosis and therapeutic intervention[J].World J Hepatol,2016,8(30):1251.

EffectsofmiR-125bonproliferationandinvasionofhepatocarcinomacellsbyART4protein

LIJian-Hua,HANLing,YANGZhi-Liang.

DepartmentofGeneralSurgery,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,China

Objective:To investigate the effect of miR-125b on ART4 protein and its effect on proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe expression of miR-125b in hepatocellular carcinoma and hepatocellular cells was detected by qPCR.The expression of miR-125b and ART4 was detected by qPCR after overexpression of miR-125b.The expression of miR-125b and ART4 was detected by double luciferase assay.The effect of miR-125b on the proliferation of hepatoma cells was detected by MTT assay.The effect of miR-125b on the invasion of hepatoma cells was detected by Transwell invasion assay.MTT assay was used to detect the effect of miR-125b on the proliferation of hepatoma cells after overexpression of ART4.Transwell invasion assay was used to detect the effect of miR-125b on the invasion of hepatoma cells after overexpression of ART4.ResultsThe expression of miR-125b in hepatoma cells was low,and overexpression of miR-125b could inhibit the expression of ART4 protein.Overexpression of miR-125b could inhibit the proliferation and invasion of hepatoma cells.Overexpression of ART4 could reverse the proliferation and invasion of hepatoma cells by miR-125b.ConclusionExpression of miR-125b in hepatocellular carcinoma was down-regulated.Meanwhile,miR-125b can regulate the expression of ART4 and affect the proliferation and invasion of hepatoma cells.

miR-125b;Hepatoma;ART4;Transwell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.002

R735.7

A

1000-484X(2017)12-1765-06

①本文為河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(201602362)。

李建華(1973年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸肝膽方面的研究，E-mail：yisheng111yy@163.com。

[收稿2017-05-31 修回2017-07-13]

(編輯 張曉舟)

·啟事·

《中國免疫學(xué)雜志》關(guān)于彩圖處理的有關(guān)說明

《中國免疫學(xué)雜志》的全部來稿一經(jīng)采用，來稿所附圖片根據(jù)具體需要，酌情制作彩圖，彩圖制作費(fèi)包含在該稿件的版面制作費(fèi)中，一并開具發(fā)票，望周知！

《中國免疫學(xué)雜志》編輯部