張曉慧 顏 妍 趙世敏 王昕旭 劉春妍 謝基明 王玉珍 武春燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

LactobacilluscaseiZhang對撲熱息痛誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護作用①

張曉慧 顏 妍 趙世敏 王昕旭 劉春妍 謝基明②王玉珍 武春燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

目的研究益生菌Lactobacillus casei Zhang(Lcz)對撲熱息痛(APAP)所致小鼠急性肝損傷的保護作用及其機制。方法C57BL/6小鼠被隨機分為空白組(Ctrl)、APAP誘導(dǎo)急性肝損傷模型組(Acetaminophen ,APAP)、陽性藥物組(N-Acetylcysteine,NAC)、Lcz預(yù)防組(Lcz/APAP)和Lcz對照組(Lcz)。Lcz(1×109CFU/ml)連續(xù)灌胃30 d后，NAC組在APAP處理前1 h腹腔注射NAC(150 mg/kg)。APAP、NAC以及Lcz/APAP組均腹腔注射APAP(300 mg/kg)。APAP作用18 h后，采集血液和收集肝臟組織，檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。通過Western blot檢測肝臟組織中血紅素氧化酶(HO-1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、Bcl-2以及TLR4的表達水平。結(jié)果Lcz能抑制APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷血清中ALT和AST水平。Lcz提高了HO-1、SOD2和Bcl-2的蛋白表達水平，而降低了APAP誘導(dǎo)的TLR4的表達。結(jié)論益生菌Lcz對APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有保護作用，其保肝作用機制可能與其抗氧化和抗炎活性有關(guān)。

Lactobacillus casei Zhang；撲熱息痛；超氧化物歧化酶2；血紅素氧化酶；Bcl-2

肝損傷的發(fā)病機制復(fù)雜，有很多因素如氧化應(yīng)激、細胞因子、病毒感染、酒精、藥物、代謝性疾病等都可以導(dǎo)致肝損傷[1]。藥物性肝損傷是由于長期或高劑量服用某種藥物后因藥物本身或其代謝產(chǎn)物直接或間接的毒副作用引起。人體對藥物或其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的過敏反應(yīng)也會誘導(dǎo)肝損傷[2,3]。

撲熱息痛(Acetaminophen，APAP)誘導(dǎo)的肝損傷是藥物性肝損傷中最常見的。APAP是一類解熱鎮(zhèn)痛藥。長期或過量服用APAP會導(dǎo)致體內(nèi)生成的毒性代謝產(chǎn)物不能及時排出而誘導(dǎo)急性肝損傷[4]。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)是治療APAP性肝損傷的標準療法。其作用機制主要是通過提高細胞內(nèi)的GSH的存儲量來降低NAPQI引起的毒性[5]。在動物實驗研究中，NAC經(jīng)常作為陽性藥物使用。但是NAC發(fā)揮作用的窗口期很短。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，不僅對腸道微生態(tài)環(huán)境有顯著的調(diào)節(jié)作用，而且對腸道外疾病以及肝臟疾病的預(yù)防和治療具有重要意義[6]。益生菌Lactobacillus casei Zhang(Lcz) 是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的益生菌，張和平課題組的研究表明，Lcz除了可以調(diào)節(jié)腸道菌群外還具有一定的抗氧化和抗炎作用[7,8]。

抗炎和抗氧化作用中首先研究的是TLR4、HO-1、SOD2等蛋白的表達水平。TLR4是天然免疫應(yīng)答中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的模式識別分子，它的激活能夠使促炎性因子活化并誘導(dǎo)細胞因子的表達[9]。HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，通過抗凋亡、抗氧化、抗炎性作用來調(diào)節(jié)細胞損傷，有研究表明HO-1在急性肝損傷中扮演著重要的角色[10]。SOD2是體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中重要的酶，在機體抗氧化途徑中發(fā)揮作用。Bcl-2在細胞發(fā)生凋亡時能夠調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，是保護細胞的抗凋亡基因[11]。

本實驗通過檢測TLR4、HO-1、SOD2、Bcl-2的蛋白表達水平來研究益生菌Lcz對撲熱息痛誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護作用，并為開發(fā)益生菌的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 益生菌Lactobacillus casei Zhang(Lcz)來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點實驗室。APAP和NAC均為Sigma公司的產(chǎn)品。

1.1.2實驗動物 C57BL/6系雄性小鼠購于北京維通利華實驗動物有限公司。5～8周齡，體重約為(20±2)g，共50只，分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：動物房保持通風(fēng)、干燥、室溫22～25℃，濕度(50±5)%，12 h/12 h白晝交替，自由飲水，標準飼養(yǎng)飼料。

1.2方法

1.2.1APAP 誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型的建立 小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組：空白組(Ctrl)、APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型組(Acetaminophen,APAP)、陽性藥物組(N-Acetylcysteine,NAC)、Lcz治療組(Lcz/APAP)和Lcz對照組， 每組10只。益生菌樣品用生理鹽水配制，連續(xù)灌胃給藥30 d，空白組和模型組均給予相同體積的生理鹽水。灌胃結(jié)束后，小鼠禁食不禁水24 h，陽性藥物組在APAP處理前腹腔注射NAC(150 mg/kg)，1 h后除空白組和Lcz對照組外，其他組均腹腔注射APAP(300 mg/kg)構(gòu)建急性肝損傷模型。摘取眼球取血，收集血液，分離血清備用，并收集肝臟凍存。

1.2.2血清生化指標的檢測 小鼠血清ALT和AST活性采用速率法以及全自動生化分析儀測定，在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科完成。

1.2.3肝臟組織切片的制作 HE染色觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化：處死小鼠后，取出肝臟組織，置于10%的甲醛溶液中固定，在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院完成組織切片的制作。

1.2.4Western blot分析肝臟組織中HO-1、SOD2、Bcl-2以及TLR4的表達水平 SDS-PAGE電泳分離所提取的肝臟組織蛋白，經(jīng)濕法轉(zhuǎn)膜到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后孵育一抗過夜，TBST洗滌PVDF膜5次后加二抗，室溫孵育90 min，再次洗膜5次，用Odyssye 紅外激光掃描成像系統(tǒng)檢測蛋白表達含量后進行分析。

2 結(jié)果

2.1Lcz對肝損傷小鼠血清中ALT和AST水平的影響 從圖1中可以看出，與Ctrl組相比較，APAP組血清中ALT、AST水平顯著升高(P<0.01)。表明APAP作用后對小鼠肝細胞造成了嚴重的損傷，動物模型建立成功。其余各組與模型組相比，ALT和 AST水平顯著降低(P<0.01)。Lcz對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷具有一定的保護作用。

圖1 Lcz對APAP誘導(dǎo)肝損傷血清中ALT和AST的影響Fig.1 Effects of Lcz on serum ALT and AST levels in APAP-induced liver injuryNote: Compared with APAP group，**.P<0.01.

圖2 Lcz作用后對APAP誘導(dǎo)的肝損傷組織學(xué)的改善Fig.2 Histological mitigation effect of Lcz on APAP-induced liver injuryNote: A.Ctrl;B.APAP;C.NAC group;D.Lcz/APAP group;E.Lcz group.

圖3 Lcz對肝臟中SOD2和HO-1表達的影響Fig.3 Effects of Lcz on hepatic expression of SOD2 and HO-1Note: Compared with APAP group,*P<0.05;**.P<0.01.

2.2Lcz作用后對肝臟組織學(xué)變化的改善 從HE染色圖來看，正常組肝小葉輪廓清晰，肝細胞胞質(zhì)豐富，核大而圓，核仁清晰(如圖2A)。APAP作用后可見肝小葉中央明顯的顆粒變性和壞死，并出現(xiàn)大量的壞死灶，局部可見肝細胞大面積溶解(如圖2B)；NAC以及Lcz/APAP組可觀察到肝細胞病變癥狀有所減輕(如圖2C、D)。Lcz組肝組織形態(tài)與正常組類似(如圖2E)。

2.3Western blot分析Lcz對肝臟組織中SOD2、HO-1表達的影響 如圖3所示，與空白組相比，模型組中SOD-2的表達降低，而NAC以及益生菌Lcz處理后其表達量增高?？瞻捉M與Lcz對照組的HO-1幾乎沒有表達，模型組表達量升高，NAC及Lcz治療組均高于模型組，灰度掃描分析顯示，Lcz作用后顯著提高了SOD2(P<0.05)以及HO-1的表達(P<0.01)。

2.4Western blot 分析Lcz對肝臟組織中TLR4表達的影響 從圖4中可以看出，與空白組相比，模型組中TLR4的表達量顯著升高，而NAC以及Lcz治療組的TLR4的表達均顯著降低(P<0.01)。

圖4 Western blot檢測Lcz對肝臟中TLR4的影響Fig.4 Effects of Lcz on TLR4 in liver by Western blotNote: Compared with APAP group,**.P<0.01.

圖5 Lcz對肝臟中Bcl-2表達的影響Fig.5 Effects of Lcz on hepatic expression of Bcl-2Note: Compared with APAP group,**.P<0.01.

2.5Western blot分析Lcz對肝臟組織中Bcl-2表達的影響 從圖5中可以看出，模型組Bcl-2的顯著表達量低于空白組(P<0.01)。而NAC和Lcz處理都顯著提高了Bcl-2的表達水平(P<0.01)。

3 討論

益生菌對腸道菌群作用的研究越來越廣泛。已有研究表明，益生菌可以直接改善腸道功能[12]，維持腸道微生物的平衡，保護腸道的屏障功能，調(diào)節(jié)腸道中天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[13]。由于肝腸軸的存在，益生菌可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群，改善由飲酒、病毒性感染以及代謝紊亂引起的慢性肝病[14]。我們之前的研究表明，益生菌Lcz對大鼠內(nèi)毒性肝損傷具有良好的保護作用[15]，該研究再次證實Lcz對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷也有保護作用。

ALT和AST是檢測肝細胞是否壞死的重要指標。我們的研究顯示預(yù)先給予Lcz降低了APAP誘導(dǎo)的ALT和AST水平，說明Lcz作用后部分恢復(fù)了肝臟功能。從HE染色的結(jié)果中也可以看出，Lcz作用后肝細胞形態(tài)明顯改善，炎性浸潤程度較模型組低。而且Lcz能夠有效降低APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷組織中TLR4的表達水平，結(jié)合HE染色的結(jié)果來看，Lcz確實能夠通過抗炎作用保護肝細胞的損傷。除此之外，益生菌Lcz還調(diào)節(jié)了Nrf2下游靶基因HO-1、SOD2的蛋白表達水平。單獨飼喂益生菌Lcz并沒有激活HO-1的表達。APAP刺激后，HO-1被激活，而益生菌Lcz作用后進一步提高HO-1的表達。我們推斷Lcz作用通過調(diào)控HO-1的表達來發(fā)揮抗氧化功能。Bcl-2是細胞內(nèi)抗凋亡蛋白，能阻止細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，從而抑制細胞凋亡[16]。益生菌Lcz治療組與模型組相比較，Bcl-2的表達量也是有所升高。說明Lcz也可能通過提高肝臟的抗凋亡功能來發(fā)揮保護作用。更多的保護機制還需要進一步研究。

綜上所述，益生菌Lcz可能通過抗炎和抗氧化途徑對APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有很好的保護作用，本實驗的研究對今后益生菌的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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ProtectiveeffectofLactobacilluscaseiZhangagainstAcetaminophen-inducedacuteliverinjuryinmice

ZHANGXiao-Hui,YANYan,ZHAOShi-Min,WANGXin-Xu,LIUChun-Yan,XIEJi-Ming,WANGYu-Zhen,WUChun-Yan.

CollegeofLifeScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,China

Objective:To investigate the protective effects of Lactobacillus casei Zhang (Lcz) on mice with Acetaminophen (APAP)-induced acute liver injury.MethodsMice were randomly divided into five groups:Control group (ctrl),APAP-induced liver injury group (APAP),N-Acetylcysteine positive control group (NAC),Lcz preventive group (Lcz/APAP) and Lcz control group (Lcz).Mice were orally administrated with Lcz (1×109CFU/ml) for 30 continuous days prior to APAP exposure.Positive control group were intraperitoneally injected with 150 mg/kg NAC 1 h before APAP challenge.Mice in the APAP,NAC and Lcz/APAP group were intraperitoneally injected with 300 mg/kg APAP.Blood and liver samples were collected 18 h post APAP challenge.The expression of HO-1,SOD2,Bcl-2 and TLR4 were detected by Western blot.ResultsLcz could significantly inhibit APAP-induced increase in ALT and AST levels.Furthermore,pretreatment with Lcz increased the hepatic expression of HO-1,SOD2 and Bcl-2,while suppressing the expression of Toll-like receptor 4 (TLR4).ConclusionLcz can protect against APAP-induced acute liver injury in mice.The hepatoprotective effects of Lcz are associated with its anti-oxidative and anti-inflammatory capacity.

Lactobacillus casei Zhang;Acetaminophen;SOD2;HO-1;Bcl-2

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.001

R392

A

1000-484X(2017)12-1761-04

①本文為國家自然科學(xué)基金(81260662，81560677)、內(nèi)蒙古杰出青年培育基金(2016JQ08)和內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2016MS0836,2015MS0884)。

②內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，呼和浩特 010020。

張曉慧(1992年-)，女，碩士，主要從事益生菌與免疫應(yīng)答方面的研究，E-mail：1041896658@qq.com。

及指導(dǎo)教師：武春燕(1983年-)，女，碩士，實驗師，主要從事微生物方面的研究。

[收稿2017-06-09 修回2017-08-09]

(編輯 張曉舟)