付艷霞， 黃 巧， 陳良標(biāo)

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306)

鱗頭犬牙南極魚(yú)卵殼蛋白的功能初步研究

付艷霞1,2， 黃 巧1,2， 陳良標(biāo)1,2

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306)

已有研究表明卵殼蛋白ZPC5(Dissostichusmawsonizona pellucida c5,DmZPC5)在南極魚(yú)卵巢中大量表達(dá)，但是其具體功能尚不清楚。為了明確ZPC5是否參與魚(yú)類抗寒過(guò)程，研究在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary ,CHO)中過(guò)表達(dá)南極魚(yú)ZPC5，隨之給予CHO細(xì)胞一定程度的低溫處理，通過(guò)統(tǒng)計(jì)CHO細(xì)胞的存活率，來(lái)探討zpc5在魚(yú)類抗寒過(guò)程中的作用。存活率檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ZPC5的CHO細(xì)胞在0℃處理16 h后，其存活率較對(duì)照組顯著上升(P<0.001)，證明zpc5在低溫下可以促進(jìn)細(xì)胞的存活。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，zpc5能在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)，0℃處理后，CHO細(xì)胞內(nèi)的ZPC5表達(dá)量顯著上調(diào)，證明了低溫可以誘導(dǎo)ZPC5的表達(dá)。研究結(jié)果表明，ZPC5有可能參與南極魚(yú)魚(yú)卵抗寒過(guò)程。

卵殼蛋白；CHO細(xì)胞；南極魚(yú)

南極海水溫度常年維持在-1.9℃左右，過(guò)去三千萬(wàn)年間，南極魚(yú)亞目魚(yú)類適應(yīng)了南大洋極端低溫的環(huán)境，成為南極海域的主要物種。目前已經(jīng)知道南極魚(yú)適應(yīng)這種極端環(huán)境的一個(gè)機(jī)制是這些魚(yú)類進(jìn)化出了抗凍糖蛋白(antifreeze glycoproteins,AFGPs)，AFGPs存在于成魚(yú)的體液中，保護(hù)成魚(yú)可以在持續(xù)寒冷的水體中生存[1]。新孵出的魚(yú)卵主要靠從母體攜帶的AFGPs來(lái)保護(hù)，而魚(yú)卵在孵化的過(guò)程中AFGPs的數(shù)量會(huì)逐漸減少[2]，那么南極魚(yú)卵是如何在這種極端環(huán)境下存活的，是進(jìn)化生物學(xué)上非常重要的一個(gè)科學(xué)問(wèn)題。

卵殼蛋白(zona pellucida,ZP)在哺乳動(dòng)物中被稱為透明帶蛋白，是絨毛膜的組成成分之一，是動(dòng)物卵細(xì)胞卵外圍的一層保護(hù)基質(zhì)。這些蛋白質(zhì)都含有一個(gè)保守的ZP結(jié)構(gòu)域，約260個(gè)氨基酸，包含8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基[3]，通過(guò)二硫鍵將4條多肽鏈結(jié)合形成糖蛋白[4]，主要功能是精卵識(shí)別和保護(hù)卵細(xì)胞[5]。在哺乳動(dòng)物中，ZP主要參與受精過(guò)程中的精卵識(shí)別，從而造成物種之間的生殖隔離[6]。在魚(yú)類中，精子通過(guò)專門(mén)的卵孔穿透漿膜，受精后魚(yú)類絨毛膜硬化，阻止其他精子入卵[7]，硬化的卵殼作為一個(gè)物理屏障保護(hù)發(fā)育中的胚胎。

魚(yú)類的zp經(jīng)歷了基因擴(kuò)增、分化、消亡等過(guò)程，使zp具有多態(tài)性[8]。有關(guān)許多魚(yú)類的zp已經(jīng)發(fā)表，如斑馬魚(yú)Daniorerio[9]、青鳉Oryziaslatipes[10]、虹鱒魚(yú)Oncorhynchusmykiss[11]等。Chen等[12]對(duì)南極圈內(nèi)魚(yú)(D.mawsoni和C.aceratus)和南極圈外魚(yú)(如E.maclovnus)的基因組經(jīng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，南極圈內(nèi)魚(yú)基因組內(nèi)zp的擴(kuò)增較圈外魚(yú)顯著上升，尤其是D.mawsoni的zpc5，表明zpc5可能與南極魚(yú)適應(yīng)南極極端寒冷環(huán)境有關(guān)。對(duì)于在寒冷環(huán)境下進(jìn)化的zpc5，是否具有抗寒功能，是本文研究的主要內(nèi)容。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP購(gòu)自Invitrogen公司；胰酶(不含EDTA)購(gòu)自life technology公司；一抗FLAG(F3165)與熒光染料PI(P4170)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；一抗EGFP購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；二抗羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Galaxy170R)購(gòu)自 Eppendorf公司；低溫培養(yǎng)箱購(gòu)自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；Accuri C6流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)胞熒光倒置顯微鏡購(gòu)自Carl Zeiss Jena公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置購(gòu)自Bio-Rad公司；其他常規(guī)試劑由省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1zpc5重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

將pIRES2-EGFP空載體和包含F(xiàn)LAG標(biāo)簽蛋白的pIRES2-flag-zpc5-EGFP重組質(zhì)粒分別進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)已知zpc5(KM030018.1)目的基因序列利用vector軟件設(shè)計(jì)測(cè)序引物(表1)，引物合成與序列測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。

1.2.2 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)

將凍存的CHO細(xì)胞(ATCCCCL-61TM)從液氮中用鑷子取出，于37℃水浴中迅速化凍，然后以800 r/min在室溫下離心5 min，移除凍存液(含10% FBS，10% DMSO)，向凍存管中加入1 mL完全培養(yǎng)基(含10% FBS，1% PS)，將細(xì)胞吹成單細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移至直徑60 mm培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿內(nèi)補(bǔ)加6 mL完全培養(yǎng)基，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代1次。

1.2.3 CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后蛋白水平成功表達(dá)的鑒定

提前一天傳代CHO細(xì)胞，貼壁細(xì)胞匯合度約40%～60% 時(shí)，采用脂質(zhì)體的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染pIRES2-flag-zpc5-EGFP重組質(zhì)粒和pIRES2-EGFP空載體。繼續(xù)培養(yǎng)2 d，移除培養(yǎng)基，用DPBS清洗細(xì)胞2次，然后加入500 μL細(xì)胞裂解液(sigma，使用前加入1% Cocktail)，4℃裂解15 min，以 20 000 r/min離心細(xì)胞顆粒碎片20 min，轉(zhuǎn)移包含蛋白的上清至冷凍過(guò)的EP管中，使用BCA法測(cè)定蛋白總濃度，將蛋白樣品放置在-80℃冰箱中保存。分別取野生、轉(zhuǎn)空載和轉(zhuǎn)zpc5的CHO細(xì)胞總蛋白各30 μg，加入蛋白電泳緩沖液(Takara)，沸水中煮10 min，蛋白充分變性后，使用10% SDS-PAGE膠進(jìn)行Western Blot，轉(zhuǎn)膜后用FLAG和EGFP抗體分別檢測(cè)ZPC5和EGFP的表達(dá)情況。1.2.4 低溫處理策略及細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)

2 結(jié)果與分析

2.1 zpc5的編碼區(qū)序列分析

本實(shí)驗(yàn)室從鱗頭犬牙南極魚(yú)的卵巢中克隆得到zpc5，測(cè)序結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1629 bp。通過(guò)ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對(duì)zpc5序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因共編碼543個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為60.43 ku，等電點(diǎn)為5.44。SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi? GENO-MIC=1)在線軟件預(yù)測(cè)表明，該ZPC5信號(hào)肽(signal peptide,SP)對(duì)應(yīng)1～21氨基酸，ZP結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)67～324氨基酸，低復(fù)雜性區(qū)域(low complexity region)對(duì)應(yīng)351～363氨基酸，預(yù)測(cè)ZP結(jié)構(gòu)域E值為1.02e-47(圖1，表2)。

圖1 zpc5編碼區(qū)序列

注：其中方框區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽序列；深灰色區(qū)域?yàn)閆P結(jié)構(gòu)域序列；淺灰色區(qū)域?yàn)榈蛷?fù)雜性區(qū)域；*為終止密碼子

Note: The box area denotes the signal peptide sequence; Dark grey area represents the ZP structure domain sequence; Light grey area shows low complexity region; *, stop codon

表2 ZPC5預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域E值

2.2 zpc5重組真核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)分析

pIRES2-flag-zpc5-EGFP真核表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜如圖2所示，zpc5啟動(dòng)子為cmv，雙酶切位點(diǎn)為EcoR I和SmaI,并在sp與zpc5之間添加了flag標(biāo)簽(方便檢測(cè)ZPC5的蛋白表達(dá))。

圖2 pIRES2-flag-zpc5-EGFP 示意圖

2.3 CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后蛋白水平成功表達(dá)的鑒定

為了檢測(cè)ZPC5在CHO細(xì)胞中能否進(jìn)行表達(dá)，將pIRES2-flag-zpc5-EGFP重組質(zhì)粒和pIRES2-EGFP空載體轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中，通過(guò)熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞中有綠色熒光(圖3-A)，說(shuō)明載體成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。為了驗(yàn)證ZPC5在CHO細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)野生型及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞只有1條28 ku左右的EGFP條帶；轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞有2條帶，一個(gè)條帶為ZPC5約75 ku，另外一個(gè)條帶為EGFP；野生型CHO細(xì)胞沒(méi)有條帶出現(xiàn)，表明ZPC5在CHO細(xì)胞中成功進(jìn)行表達(dá)(圖3-B)。

圖3 ZPC5真核表達(dá)檢測(cè)

注：A為質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功，Phase表示白光圖，EGFP表示綠色熒光圖；B為Western Blot檢測(cè)CHO細(xì)胞中ZPC5及EGFP的表達(dá)

Note: A,the expression absence of plasmids in CHO cells, Phase, white light ;EGFP, green light; B, the Western Blot detection of ZPC5 and EGFP

2.4 ZPC5表達(dá)量及存活率檢測(cè)

為了探討低溫下ZPC5是否參與細(xì)胞抗寒，我們使用了瞬間表達(dá)zpc5的CHO細(xì)胞。Western Blot結(jié)果顯示，CHO細(xì)胞表達(dá)的外源性ZPC5在低溫處理后表達(dá)量較37℃明顯上調(diào)，EGFP未對(duì)低溫做出應(yīng)答(圖4-A、圖4-B)。上述結(jié)果說(shuō)明，低溫可以誘導(dǎo)ZPC5的表達(dá)。

通過(guò)PI染色的方法檢測(cè)了低溫下細(xì)胞的存活狀況。轉(zhuǎn)染空載體的CHO細(xì)胞作為對(duì)照組，過(guò)表達(dá)zpc5的CHO細(xì)胞作為試驗(yàn)組，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞存活率為(27.99±2.44)%，試驗(yàn)組存活率為(41.06±3.09)%，試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.001，圖4-C)。這些結(jié)果提示，低溫下ZPC5對(duì)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可能參與細(xì)胞抗寒過(guò)程。

圖4 低溫下ZPC5的表達(dá)與細(xì)胞存活率

注:A、B分別為外源性蛋白ZPC5、EGFP 的Western Blot檢測(cè)及相應(yīng)的灰度分析，***P<0.001，P>0.05，與37℃對(duì)照組比較；C為0℃處理后過(guò)表達(dá)ZPC5(ZPC5-M)及缺乏ZPC5(EGFP-M)的CHO細(xì)胞存活率，***P<0.001，與轉(zhuǎn)染空載CHO細(xì)胞相比

Note: A,Western Blot detection and the gray intensity of ZPC5 in CHO cells,**P<0.001vs37℃ control group; B,Western Blot detection and the gray intensity of EGFP in CHO cells,P>0.05; C,The survival rate of CHO cells in the presence (ZPC5-M) or absence (EGFP-M) of ZPC5 in 0℃, ***P<0.001vsEGFP-M (vector-M)

3 討論

Cao等[13]最近研究發(fā)現(xiàn)，ZPC5具有冰晶融解促進(jìn)活性(ice melting-promoting,IMP activity)，在中等濃度下可以降低溶液的冰點(diǎn)0.26℃～0.65℃，zpc5轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)卵殼蛋白溶液的冰點(diǎn)明顯降低。以往有研究表明，鱗頭犬牙南極魚(yú)的atp6v0c在低溫下可以提高HeLa 細(xì)胞的存活率[14]，南極魚(yú)LycodichthysDearborni的ld4在低溫脅迫下可以顯著降低應(yīng)激顆粒的形成[15]，本研究也發(fā)現(xiàn)，低溫誘導(dǎo)ZPC5表達(dá)量上調(diào)，且zpc5在低溫下可以提高CHO細(xì)胞的存活率，這和Cao等[13]的研究結(jié)果一致。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)CHO細(xì)胞存活率時(shí)，細(xì)胞的低溫處理時(shí)間不能超過(guò)24 h，否則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可修復(fù)的損傷，說(shuō)明zpc5抗寒能力相對(duì)較弱。

蛋白表達(dá)量及存活率結(jié)果表明，低溫處理后，zpc5提高了CHO細(xì)胞的抗寒能力?？箖龅鞍?antifreeze proteins,AFPs)主要是依靠AFPs降低溶液的冰點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)抗凍[16]。有研究表明，南極魚(yú)ZPC5的ZP結(jié)構(gòu)域和酸性殘基是IMP活性所必需的，闡明了ZPC5等一類蛋白是通過(guò)獨(dú)特的ZP-冰晶結(jié)合機(jī)制抗凍的，這是一種不同于已知AFPs的抗凍機(jī)制[13]。本研究中，CHO細(xì)胞低溫處理后，ZPC5表達(dá)量上調(diào)，筆者推測(cè)，有可能是因?yàn)閆PC5與冰晶結(jié)合，導(dǎo)致冰晶對(duì)細(xì)胞膜的損害降低，從而提高了細(xì)胞的存活率。也有可能是低溫誘導(dǎo)ZPC5的表達(dá)，維持了胞內(nèi)與胞外滲透壓平衡，最終達(dá)到維持細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)CHO細(xì)胞在低溫下的耐受性。

ZP作為重要的生物屏障，在保護(hù)卵細(xì)胞、受精卵以及發(fā)育中的胚胎時(shí)發(fā)揮著多種作用[17]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，低溫下卵中zp的擴(kuò)增，可以保護(hù)受精卵免受冰凍的損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，為避免因轉(zhuǎn)染效率過(guò)低導(dǎo)致蛋白表達(dá)量存在差異的情況，我們使用了瞬時(shí)表達(dá)ZPC5的CHO細(xì)胞，熒光觀察及Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%以上。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蜏販囟葹?℃(盡量模擬南極海水-1.9℃的溫度)時(shí)，CHO細(xì)胞的存活率差異顯著。筆者推測(cè)，南極魚(yú)作為一種高級(jí)模式生物，有可能因?yàn)槟蠘O極端寒冷的環(huán)境，導(dǎo)致了南極魚(yú)的部分潛在基因具有了抗寒的功能。另有研究發(fā)現(xiàn)，青藏高原齊口裂腹魚(yú)(Schizothoraxprenanti)的ZP3也具有一定的冰晶結(jié)合活性[18]，表明南極魚(yú)的ZP功能多元化并不是單一的。

綜上所述，轉(zhuǎn)zpc5的CHO細(xì)胞在低溫下的存活率有明顯上升，說(shuō)明南極魚(yú)卵殼蛋白ZPC5參與細(xì)胞抗寒過(guò)程，為更好地研究南極極端環(huán)境下生物的進(jìn)化提供了新思路，有助于我們進(jìn)一步了解低溫適應(yīng)性機(jī)制，為改善其他動(dòng)植物的抗寒性提供了更多可供選擇的抗寒基因。

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PrimaryanalysisofthefunctionofzonapellucidainDissostichusmawsoni

FU Yan-xia1,2, HUANG Qiao1,2, CHEN Liang-biao1,2

(1. College of Aquaculture and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;2. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The previous studies have shown that ZPC5 expressed in the ovary of the Antarctic notothenioid fishes, however, the specific function of ZPC5 is unclear until now. In order to clarify whether ZPC5 has an ability to avoid fish-freezing at the low temperature， here, we attempted the overexpression of ZPC5 in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, and then treated CHO cells in the low temperature, by monitoring the survival rate of CHO cells, thus we revealed about the function ofzpc5 in fishes. The survival rate of CHO cells treated at 0℃ for 16 h was significantly higher than that of the mock (P<0.001), which proved thatzpc5 improved the cold resistance of the cells. The Western Blot analysis showed that thezpc5 was highly expressed in CHO cells and the expression of ZPC5 was significantly increased at 0℃, which proved that the low temperature guided the expression of ZPC5. Our data suggested that ZPC5 may be involved in the resistance process of the Antarctic notothenioid fishes to the cold environment.

zona pellucida; CHO cells; Antarctic notothenioid fishes

2016-11-15；

2016-11-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(31572611)；上海市教委水產(chǎn)高峰學(xué)科項(xiàng)目

付艷霞，碩士，主要從事分子生物學(xué)研究, E-mail:yanxia009@163.com

陳良標(biāo)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事發(fā)育、分子生物學(xué)研究, E-mail: lbchen@shou.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.028

Q51

A

2095-1736(2017)06-0028-04