許立新， 李恒月， 趙東旭

(北京理工大學(xué) 生命學(xué)院, 北京 100081)

獸骨明膠的新提取工藝研究

許立新， 李恒月， 趙東旭

(北京理工大學(xué) 生命學(xué)院, 北京 100081)

對傳統(tǒng)明膠提取工藝進行改造有助于提高生產(chǎn)效率。以破碎后的獸骨骨粒為原料，利用超聲波輔助技術(shù)提取明膠，對提取的明膠性質(zhì)進行表征。通過單因素試驗探討了鹽酸濃度、超聲功率、浸泡時間、浸酸料液比對原料礦物質(zhì)去除的影響，確定去除礦物質(zhì)的條件為：鹽酸濃度為3%，超聲功率為1000 W，浸酸料液質(zhì)量比為1∶10，浸酸時間為3 d。在隨后的浸堿操作中，研究了浸堿時間、超聲功率、水提pH、水提料液比對明膠提取率的影響。最終優(yōu)化明膠提取條件為：浸堿時間6 d，超聲功率為1000 W，水提pH 5，水提料液質(zhì)量比為3∶10。在最佳浸堿和提膠條件下，明膠的提取率達14.52%。以SDS-PAGE電泳和BCA法作為檢測手段檢測明膠分子相對分子質(zhì)量和提取率。最終結(jié)果表明：明膠的分子質(zhì)量主要分布在20.0～94.4 ku之間，在60℃下蛋白提取率較高。

獸骨；明膠；超聲波

明膠是由動物體的皮、骨等結(jié)締組織經(jīng)預(yù)處理后，在適當(dāng)溫度下提取出來的具有水溶性和能凝凍的一類物質(zhì)的總稱[1]，不僅作為食品添加劑運用到各種食品加工過程中，同時還被應(yīng)用在醫(yī)藥、生化、印刷、感光工業(yè)等其它領(lǐng)域[2-5]。

皮明膠與獸骨明膠的制備有較大區(qū)別，皮組織只需較低的鹽酸溶液濃度且浸泡時間短，就可以使其吸水膨脹，具備一定的彈性；而獸骨的組織堅硬，需要較高濃度的鹽酸溶液浸泡較長時間，從而延長了生產(chǎn)周期[6]。傳統(tǒng)的獸骨明膠制備工藝流程為：獸骨→酸處理→檢測→堿處理→檢測→提膠→膠液凈化→濃縮→干燥→明膠成品[7]。為改善獸骨明膠的制備工藝，將超聲波技術(shù)應(yīng)用于獸骨明膠的生產(chǎn)中，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)等多重效應(yīng)可以加快物質(zhì)間的化學(xué)反應(yīng)，促進蛋白的溶出，縮短實驗周期，在獸骨明膠的制備中具有良好的應(yīng)用前景[8]。本文利用超聲波技術(shù)確定了獸骨下腳料中明膠礦物質(zhì)的去除以及浸堿和提膠的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

原料雜骨由安徽蚌埠豐原明膠有限公司提供，室溫保存。

1.2 試劑與儀器

HCl(北京化工廠)；NaOH(西隴化工股份有限公司)；氧化鈣(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；考馬斯亮藍R-250均購于北京凱諾春天生物科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自TIANGEN公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

超聲波儀器的改裝說明：由于常規(guī)的超聲波清洗器的容量及功率的限制，我們改裝了板振式超聲波清洗器。為了控制溫度，在清洗器上改裝了兩個水龍頭，一個在上方，另一個在下方，用水流的方式有效地控溫。其中，下方是作為主要出水口，而上方的出水口是為了消除安全隱患。同時，在主機上連接了一個電磁繼電器，能夠控制具體的超聲時間。此外，在超聲振板上方安裝了一個金屬籃，固定高度，方便實驗的進行。

1.3 方法

1.3.1 獸骨中明膠的提取

取30 g原料獸骨，加入一定濃度的鹽酸溶液浸泡以除去獸骨中的礦物質(zhì)，隨后用飽和石灰水浸泡除去獸骨中的雜蛋白，每24 h換1次液。經(jīng)浸酸浸堿處理后的獸骨水洗3～4遍，調(diào)節(jié)pH，采取“分道提膠”的方法，在不同溫度下提膠，得到明膠提取液。在4℃，10 000 r/min的條件下，離心10 min，澄清明膠提取液，干燥后即得到明膠。明膠提取率(%)=(明膠干重/樣品干重)×100%。

1.3.2 單因素試驗確定去除獸骨礦物質(zhì)的條件

采用1.3.1中的方法提取明膠，通過測定骨素干重，確定去除獸骨礦物質(zhì)的條件。提取條件為：固定反應(yīng)條件為原料30 g，料液質(zhì)量比為30∶300，超聲功率為1000 W，超聲時間為每小時20 min?？疾觳煌}酸濃度(2%、3%和4%)對原料礦物質(zhì)去除的影響；固定反應(yīng)條件為原料30 g，鹽酸濃度為3%，超聲功率為1000 W，超聲時間為每小時20 min?？疾觳煌弦罕?30∶100、30∶300和30∶500)對原料礦物質(zhì)去除的影響；固定反應(yīng)條件為原料30 g，鹽酸濃度為3%，料液比為30∶300，超聲時間每小時為20 min?？疾觳煌暪β?800 W、1000 W和1200 W)對原料礦物質(zhì)去除的影響。

1.3.3 明膠最佳浸堿及水提工藝條件的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計了浸堿時間分別為5 d、6 d和7 d，超聲功率分別為600 W、800 W和1000 W，水提pH分別為5、7和9，水提料液比分別為3∶8、3∶10及3∶12的四因素三水平的正交試驗，各因素的3個水平采用-1,0,1進行編碼，如表1。

1.3.4 SDS-PAGE 電泳分析

采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對明膠樣品進行電泳分析。樣品按照1∶1的比例加入樣品緩沖液，于100℃加熱5 min 使蛋白質(zhì)變性，待測。采用3%的濃縮膠、12%分離膠對已處理樣品進行電泳分析。采用考馬斯亮藍對聚丙烯酰胺凝膠進行染色后，用10%甲醇及10%冰醋酸的混合溶液脫色[9]。

1.3.5 BCA法測蛋白提取率

分別取25 μL新鮮配制的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待測明膠樣品，加入到96孔板中。加入200 μL的BCA工作液，并充分混勻；加蓋，37℃孵育30 min后冷卻至室溫或室溫下放置2 h；用酶標(biāo)分析儀于562 nm處檢測其吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的蛋白濃度[10]。

表1 正交試驗因素水平和編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗確定去除獸骨礦物質(zhì)的條件

2.1.1 不同鹽酸濃度對原料雜骨中的礦物質(zhì)去除的影響

由圖1可知，隨著鹽酸浸泡時間的延長，骨素干重逐漸減少。鹽酸濃度為 2%浸泡后骨素干重始終大于鹽酸濃度為3%和4%浸泡后的骨素干重。這說明鹽酸濃度為2%時，并沒有完全除去原料中礦物質(zhì)。當(dāng)鹽酸濃度為3%時，即可充分除去原料中的礦物質(zhì)。故確定去除原料雜骨時浸泡的鹽酸濃度為3%。

圖1 不同濃度的鹽酸浸泡后骨素的干重變化

2.1.2 不同料液比對原料雜骨的礦物質(zhì)去除的影響

由圖2可知，從各個時間段的骨素干重來看，在48 h之前，由于鹽酸量充足，不同料液比浸泡后的骨素干重相差不大；當(dāng)反應(yīng)進行到72 h時，料液比為30∶100時的骨素干重明顯大于料液比為30∶300和30∶500時的骨素干重，且在此時，料液比為30∶100時的骨素干重減少量明顯小于料液比為30∶300和30∶500時的骨素干重的減少量。這是由于隨著反應(yīng)的進行，料液比為30∶100的鹽酸量逐漸不足。當(dāng)反應(yīng)進行到84 h時，料液比為30∶100的骨素干重減少量遠小于料液比30∶300和30∶500時的骨素干重減少量，因料液比小，鹽酸的量過少，在鹽酸與骨素的內(nèi)部反應(yīng)時因鹽酸的量不夠而導(dǎo)致反應(yīng)停止，料液比為30∶300和30∶500時均能在理想的時間除去礦物質(zhì)，故選取30∶300為最適料液比。

圖2 不同料液比的鹽酸浸泡后骨素的干重

2.1.3 不同超聲功率對原料雜骨中礦物質(zhì)去除的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的增大，各時間段骨素的干重逐漸減少。在48 h之前，骨素干重的減少量差異不顯著，在48 h之后骨素的干重減少量差異顯著。原因是剛開始時原料表面與鹽酸反應(yīng)，需要漸漸地鹽酸滲透到原料內(nèi)部，反應(yīng)速度減慢。增大超聲功率能夠增加礦物質(zhì)去除速度，但是超聲功率為1000 W和超聲功率為1200 W時相差不大。并且在72 h時，超聲功率為1000 W和1200 W時的剩余鹽酸濃度相差不大(圖4)，但超聲功率為1200 W時的骨素干重過低，推測在超聲功率1200 W時，由于功率過大而破壞了骨素的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，使骨素流失，故超聲功率為1000 W時較佳。

圖3 不同超聲功率作用下的骨素干重變化

綜上所述，增大鹽酸濃度、料液比和超聲功率都能在一定程度提高去除原料中礦物質(zhì)的效率。按照原料30 g來計算，則理論上其中礦物質(zhì)的含量為18～22 g。在上述實驗確定的最佳條件下(鹽酸濃度為3%，浸酸時間為72 h，料液比為30∶300，超聲功率為1000 W)，反應(yīng)后的骨素干重在8 g以下(圖3)，即礦物質(zhì)去除量達90%以上。

圖4 不同超聲功率作用下的鹽酸剩余濃度曲線

2.2 明膠最佳浸堿及水提工藝條件的確定

以浸堿時間、超聲功率、水提pH、水提料液比為考察因素，每個因素3個水平，按照L9(34)正交試驗設(shè)計表設(shè)計實驗，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計以及明膠提取率

由表2的實驗結(jié)果R值分析可知，各因素對明膠提取率的影響從大到小依次為超聲功率、水提料液比、水提pH、浸堿時間。當(dāng)超聲功率為第三水平時，明膠的提取率最高，在第一水平時，明膠的提取率最低。由此可知，超聲在明膠的處理過程中扮演著重要角色，且超聲功率越大，明膠的提取效率越高。因此，超聲功率定為1000 W。

當(dāng)水提料液比為第一水平時，明膠提取率較低，當(dāng)水提料液比為第二水平和第三水平時，明膠的提取率較高。由明膠的提取過程中可以推測，在不斷產(chǎn)生明膠的過程中繼續(xù)加熱會使已經(jīng)生成的明膠也有可能逐漸水解成多肽。因此在相同條件下，料液比越高在熱水提膠過程中殘留下的明膠越多。綜合考慮提取率和資源，水提料液比定為3∶10。

當(dāng)水提pH為第一水平時，提取率最高，而當(dāng)水提pH為第二水平和第三水平的差別不明顯。熱水提膠時，骨膠原螺旋體會慢慢解體，使原本相互纏繞的鏈彼此松開，形成許多無規(guī)則的線團，斷裂成明膠碎片，融入溶液中，形成明膠溶液。同時，明膠提取是在膠原纖維的熱收縮溫度上進行的，提取溫度越高于收縮溫度，膠原越容易轉(zhuǎn)變成明膠。而膠原纖維的收縮溫度受pH的影響，在中性溶液中的收縮溫度高于酸性和堿性條件下的收縮溫度。所以，在溶液pH為中性時，膠原纖維的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，膠原轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z較困難，故明膠的提取量少。酸性環(huán)境對明膠纖維結(jié)構(gòu)的去穩(wěn)定性比堿性強，所以在酸性環(huán)境下，明膠的提取率更高。故水提pH定為5。

浸堿過程是除去雜蛋白的過程，使骨素顏色發(fā)白，并具有一定的彈性。當(dāng)浸堿時間為第二水平時，明膠提取率較大。理論上應(yīng)該是適當(dāng)延長浸堿時間，更有利于提高明膠的提取率。實際上，當(dāng)浸堿時間為第三水平時，明膠的提取率反而下降。原因是浸堿時間過長，會破壞骨素的高級結(jié)構(gòu)，降低骨素的彈性。因此，浸堿時間定為6 d。

經(jīng)綜合分析，浸堿和提膠的最佳條件為，浸堿時間為6 d，超聲功率為1000 W，水提pH為5，水提料液比為3∶10。在此條件下明膠的提取率可達14.52%。

2.3 SDS-PAGE 電泳分析所提明膠的相對分子質(zhì)量分布

圖5 SDS-PAGE法測定不同溫度下提取的明膠的分子質(zhì)量

注：1代表標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2～6分別代表在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取的明膠

圖6 不同溫度下的明膠提取率

明膠在SDS-PAGE電泳圖上均呈連續(xù)分布，沒有明顯的電泳條帶，說明這些明膠的相對分子質(zhì)量分布具有分散性。但主要分布在20～94.4 ku之間(圖5)。

2.4 BCA法測定蛋白提取率

由圖6可以看出，明膠在60℃下提取率較高，而當(dāng)溫度為50℃、90℃時，蛋白提取率相對較低。這點在圖5的SDS-PAGE電泳圖也可以看出，第2、6條帶顏色較淺，這可能是由于提膠溫度較低時，溶出的蛋白含量較少；而提膠溫度過高則又引起部分蛋白降解。

3 結(jié)論

本文研究了鹽酸濃度、超聲功率、浸酸時間、浸酸料液比對獸骨中礦物質(zhì)去除的影響，確定最佳的去除礦物質(zhì)的條件為鹽酸濃度為3%，超聲功率為1000 W，浸酸時間為3 d，浸酸料液比為30∶300，礦物質(zhì)去除量達90%以上。在確定最佳的去除礦物質(zhì)條件后，研究了浸堿時間、超聲功率、水提pH、水提料液比對明膠提取率的影響，確定最佳的浸堿和提膠條件為浸堿時間6 d，超聲功率為1000 W，水提pH為5，水提料液比為3∶10。此時明膠的提取率達14.52%。通過SDS-PAGE圖可知，明膠的分子質(zhì)量具有分散性，但主要分布在20.0～94.4 ku之間，明膠提取率在60℃達到最高。

本文從獸骨的下腳料中提取明膠，既能解決環(huán)境污染問題，又能增加獸骨加工的附加值。同時，本文的研究為從獸骨中提取明膠提供了理論基礎(chǔ)，利用超聲波輔助提取技術(shù)給獸骨明膠的提取提供了新的方法。

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Studyonthenewextractiontechnologyofgelatininanimalbone

XU Li-xin, LI Heng-yue, ZHAO Dong-xu

( School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China )

The improvement of the traditional gelatin extraction process can help to improve the production efficiency. We used animal bones to extract gelatin by ultrasonic technique. Based on the single factor experiments, the influence of the hydrochloric acid concentration, ultrasonic power, pickling time, ratio of liquid to materials for removing minerals was determined. The bone was desalted with HCl on the best conditions as follows: HCl concentration, 3%; ultrasonic power, 1000 W; pickling time 3 d, the weight of bone: the weight of HCl 1∶10. The best condition for the gelatin extraction yield was determined as follows: alkali soaking time, 6 d; ultrasonic power, 1000 W; water extraction pH 5; the weight of bone∶the weight of water, 3∶10. The gelatin extraction yield was 14.52% under the best condition. The distribution of gelatin molecules was measured by SDS-PAGE, while the relative content mass was measured by BCA method. The SDS-PAGE results showed that distribution of gelatin molecules was within a range from 20.0 to 94.4 ku. The protein extraction rate was higher at 60℃.

animal bone; gelatin; ultrasonic wave

2016-11-22；

2016-12-12

面向公共安全用納米材料及診斷技術(shù)的研發(fā)(2013AA032204)

許立新，碩士研究生，專業(yè)方向為生物學(xué)，E-mail：xulixin1993@126.com

趙東旭，博士，研究生導(dǎo)師，研究方向為生物活性成分的分離分析，E-mail:zhaodx@bit.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.089

TS251.94

B

2095-1736(2017)06-0089-04