曹淑貞， 沈媛媛， 王風芹， 宋安東， 桑玉強

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院， 鄭州 450002； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學 林學院， 鄭州 450002)

土壤甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)研究進展

曹淑貞1， 沈媛媛2， 王風芹1， 宋安東1， 桑玉強2

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院， 鄭州 450002； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學 林學院， 鄭州 450002)

CH4氣體具有極強的紅外線吸收能力，單分子CH4造成的增溫效應(yīng)可以達到單分子CO2的15～30倍，更是遠遠高于其他溫室氣體。地表甲烷氧化和釋放對整個生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和動態(tài)平衡意義重大，近年來科學家圍繞土壤甲烷氧化細菌做了大量研究工作，取得進展的同時也存在諸多問題。以甲烷氧化菌為出發(fā)點，總結(jié)目前國內(nèi)外關(guān)于土壤甲烷氧化的研究進展，重點介紹了甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)研究的各種分子生物學方法，旨在推進對土壤氧化甲烷菌作用機制的研究，完善引起溫室效應(yīng)的生物學因素，為進一步對地表土壤甲烷通量的分析和研究提供理論依據(jù)。

甲烷氧化細菌；菌落結(jié)構(gòu)；土壤

CH4作為重要的溫室氣體，對全球變暖效應(yīng)的貢獻率為20%，僅比第一大溫室氣體CO2低了35%[1]。工業(yè)革命使得煤、石油等化石能源的消耗劇增，與此同時大氣中的CH4濃度也在日益升高。據(jù)調(diào)查顯示，大氣甲烷濃度已在過去200年內(nèi)增加了約1.48倍，目前仍以較高的速度逐年增加[2]。甲烷氧化研究已成為研究全球變暖效應(yīng)不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

陸地土壤對CH4的氧化和釋放影響著大氣中的甲烷含量。對于單一系統(tǒng)，甲烷吸收大于甲烷氧化，稱為甲烷吸收匯，反之則為甲烷排放源。近年來，大氣中甲烷濃度急劇升高就是吸收匯減少和排放源增加的結(jié)果。土壤中含有大量的甲烷氧化細菌，研究表明不飽和土壤在大氣甲烷排放源與吸收匯的平衡中起著重要作用，CH4的年平均攝取量可達到36 Tg±23 Tg[3]。自然因素和人類活動都密切影響著土壤中甲烷氧化菌對甲烷的釋放和吸收，研究不同條件地表土壤中甲烷氧化菌的生態(tài)多樣性對分析甲烷氧化機制和凈甲烷排放核算都具有深遠的意義。

1 森林甲烷氧化菌

1.1 甲烷氧化菌分類

甲烷氧化細菌(Methanotrophic bacteria)屬于革蘭氏陰性菌，廣泛存在于土壤、水體等各種生態(tài)環(huán)境中，其最大的特點是能夠以甲烷作為唯一的碳源和能量維持生存[4]。甲烷氧化菌分為好氧甲烷氧化菌(Aerobic Methanotrophs)和厭氧甲烷氧化菌(Anaerobic Methanotrophs)兩種，其中厭氧甲烷氧化菌能夠在缺氧或無氧環(huán)境中氧化甲烷，多為古生菌，大多在極地、熱泉等極端條件下被發(fā)現(xiàn)，本文的主要探討對象為好氧型甲烷氧化細菌。

好氧型甲烷氧化菌于19世紀初被荷蘭微生物學家Sohngen分離出來[5]，直到1970年才開始被科學家進行分類，奠定了現(xiàn)代甲烷氧化菌分類學的基礎(chǔ)[6]。甲烷氧化菌分為3個菌門，分別為變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)[7]和NC10門[8]。疣微菌門只在極端嗜酸嗜熱環(huán)境下發(fā)現(xiàn)過，NC10門細菌可以在厭氧條件下進行甲烷和亞硝酸鹽耦合反應(yīng)，又叫反硝化厭氧甲烷氧化菌，傳統(tǒng)的甲烷氧化菌都歸類為變形菌門。傳統(tǒng)好氧甲烷氧化細菌氧化甲烷的代謝途徑也存在差異，其中TypeⅠ型菌利用單磷酸核酮糖途徑氧化代謝甲烷，Type II型菌則利用絲氨酸途徑。Ⅰ型甲烷氧化菌被劃分為γ-變形菌綱，又可以細分為Ⅰa型和Ⅰb型，其中Ⅰb型菌又名X型甲烷氧化菌[4]。X型甲烷氧化菌代謝甲烷的途徑與TypeⅠ型菌相同，但其和I型甲烷氧化菌還是存在一定差異：X型菌含有少量的絲氨酸代謝途徑酶，最適生長溫度高于其他類型的甲烷氧化細菌,并且具有大多數(shù)Ⅰ型菌缺乏的固氮能力[9]。Ⅱ型甲烷氧化菌屬于α-變形菌綱，包括Methylocystaceae和Beijerinckiaceae兩個科，前者有Methylocystis和Methylosinus屬，后者包括Methylocapsa、Methylocella和Methyloferula屬。

不同類型的甲烷氧化細菌具有不同的環(huán)境耐受能力。TypeⅠ甲烷氧化菌偏向于高氧濃度低含量甲烷以及營養(yǎng)物質(zhì)豐富的環(huán)境，而Type II型菌則完全相反。關(guān)于Ⅰ型和Ⅱ型的具體分類參見表1。

表1 甲烷氧化菌分類

1.2 甲烷氧化機理

土壤中的甲烷氧化菌首先利用細胞內(nèi)的關(guān)鍵酶甲烷單加氧酶(MMO)將大氣中的CH4氧化為甲醇。不同類型的甲烷氧化菌所利用的甲烷單加氧酶也存在一定的差別：Ⅰ型菌只能利用可溶性甲烷單加氧酶(sMMO)，而TypeⅡ甲烷氧化菌既可同時利用可溶性甲烷單加氧酶(sMMO)和顆粒性甲烷單加氧酶(pMMO)。兩種酶的作用機理都是破壞甲烷分子C-H鍵，最終生成甲醇(CH3OH)和水。后續(xù)反應(yīng)中，產(chǎn)生的甲醇被蘋果酸脫氫酶(MDH)氧化成甲醛，甲醛的代謝過程是TypeⅠ菌和TypeⅡ菌的最重要區(qū)別，前者利用磷酸核酮糖途徑氧化甲醛，后者則利用的是絲氨酸途徑。該過程反應(yīng)見圖1。

2 甲烷氧化菌標記基因

傳統(tǒng)的檢測甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的方法都是依靠培養(yǎng)法實現(xiàn)，操作復(fù)雜、工作量大、不能一次性實現(xiàn)大批樣品的快速檢測等使得該方法存在許多缺點[10]。1995年，Amann等研究人員通過相關(guān)實驗證實了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法可能會錯失99%以上的微生物種類，這使得人們開始開拓創(chuàng)立更為前沿的生物多樣性研究技術(shù)[11]。

圖1 甲烷氧化途徑[4]

隨著分子生態(tài)學的發(fā)展，分子檢測法逐漸取代了傳統(tǒng)的甲烷氧化細菌檢測方法，采用標記基因法測定微生物群落結(jié)構(gòu)的方法已得到廣泛應(yīng)用。標記基因是細菌內(nèi)能夠起特異性標記作用的一種基因，通常具有已知的功能和序列。16s rRNA基因作為最常用的標記基因，負責編碼細菌內(nèi)特定的DNA序列，是微生物多樣性研究的重要工具[12]。特殊情況下，需要對具有特定功能的微生物進行研究，此時需要更為專一負責編碼關(guān)鍵酶的功能基因作為研究對象[13]。

pmoA是甲烷氧化細菌的功能基因，在關(guān)鍵酶甲烷單加氧酶(MMO)的編碼中發(fā)揮著不可替代的作用。因此，環(huán)境中甲烷氧化菌的多樣性研究常選pmoA作為標記基因[14]。繼寡核苷酸引物A189f/A682r之后[15]，人們又設(shè)計出更多pmoA的特異性引物來實現(xiàn)該功能基因的PCR擴增。除了pmoA，其他能編碼甲烷單加氧酶的功能基因也相繼被發(fā)現(xiàn)，共同組成甲烷氧化菌生態(tài)學研究的強有力工具[16]。

3 甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的分子生物學測定方法

近年來分子生物學分析群落結(jié)構(gòu)的技術(shù)被廣泛應(yīng)用,包括限制性片段長度多態(tài)分析(Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)、實時熒光定量PCR (Real-time PCR, RT-PCR)、高通量基因芯片(GeoChip)、磷酸脂肪酸分析(Phospholipid fatty acid, PLFA)、熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)以及高通量測序技術(shù)(High throughput sequencing， HTS)。這些技術(shù)的應(yīng)用拓展了土壤甲烷氧化菌等微生物多樣性的研究手段，以下對目前已應(yīng)用的土壤甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的分子生物學研究方法做相應(yīng)總結(jié)。

3.1 限制性片段多態(tài)性分析

限制性片段多態(tài)性分析(T-RFLP)是研究微生物多樣性的一種高效便捷的手段。該技術(shù)以分子系統(tǒng)學為基礎(chǔ)，克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法造成的物種缺失弊端，不但應(yīng)用快速，而且具有較高的靈敏度，如今已被廣泛應(yīng)用到微生物種群多樣性的研究分析領(lǐng)域[17]。該技術(shù)測定甲烷氧化菌菌落結(jié)構(gòu)的原理是用熒光標記土壤樣品中的甲烷氧化菌功能基因片段，通過DNA測序儀進行電泳和熒光檢測，分析帶有熒光標記基因片段的長度和含量，從而揭示土壤氧化菌的豐度和菌落結(jié)構(gòu)等特征。Singh等[18]以T-RFLP技術(shù)研究了新西蘭的原始山毛櫸林，發(fā)現(xiàn)該林區(qū)土壤中typeⅡ型甲烷氧化菌是最主要的活躍種群；Lüke等[19]運用該技術(shù)研究了意大利某地多種水稻根際甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果證明typeⅡ和typeⅠb甲烷氧化菌比其他甲烷氧化菌在水稻根際土壤中更占優(yōu)勢；Ho等[20]采用T-RFLP與qPCR結(jié)合的技術(shù)研究了反復(fù)性的干旱和洪澇干擾對水稻田土壤中甲烷氧化菌活性、豐度以及菌落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果證明甲烷氧化菌對抗外界干擾有一定的自我恢復(fù)能力，但不同類型的甲烷氧化菌的抗受能力不同，typeⅠ型菌在不利干擾條件下相比typeⅡ型菌有更強的自我恢復(fù)能力，這同時表明不同的甲烷氧化菌采用不同的策略來應(yīng)對外界干擾作用。

3.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR作為一種高靈敏度、強特異性、高自動化的新興分子生物學研究技術(shù)[10]，可以結(jié)合16s rRNA 基因或功能基因作為標記來檢測環(huán)境樣品中微生物多樣性[21]。該技術(shù)的原理是將過量的具有熒光作用的染料(如SYBR Green I)加入到傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)體系，熒光染料可以特異性結(jié)合DNA雙鏈從而對其進行標記，PCR的整個反應(yīng)進程就可以通過熒光累積實時進行監(jiān)測控制，最后通過標準曲線定量計算分析。楊銘德等[10]利用實時熒光定量PCR 技術(shù)，研究探討了不同鹽堿程度下土壤甲烷氧化菌活性與甲烷氧化速率的關(guān)系；劉雅慈等[21]在傳統(tǒng)熒光定量PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合甲烷氧化細菌功能基因pmoA，探索建立了快速、靈敏和特異性的油氣田土壤甲烷氧化菌定量 PCR 檢測技術(shù)；Yun等[22]運用該技術(shù)研究了青藏高原若爾蓋濕地3種典型植被條件下甲烷氧化菌豐度、活性以及群落結(jié)構(gòu)的差異，其中甲烷氧化菌的16s rRNA以及pomA基因拷貝量均顯示出濕地環(huán)境中typeⅠ型菌在數(shù)量上占有優(yōu)勢，而mRNA/DNA的結(jié)果又表明typeⅡ型菌在該地區(qū)雖然豐度較低，但在所有樣品中活性最高。

3.3 高通量基因芯片

高通量基因芯片技術(shù)(GeoChip)研究物種多樣性的原理是將高密度的DNA 探針通過原位合成或微印刷的方法固化于載體的表面，探針進一步與樣品DNA進行雜交，雜交點信號可用激光掃描儀進行采集，最后通過軟件分析處理對生物樣品進行快速有效地檢測和醫(yī)療診斷。Martineau等[23]通過基因芯片與克隆文庫結(jié)合的方法研究了加拿大高緯度北極圈土壤甲烷氧化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在極地土壤中有許多未被研究報道的甲烷氧化細菌。Wang等[24]為探討低水位及氮沉降對青藏高原高寒濕地的影響，運用基因芯片技術(shù)(Geochip 5.0)對土壤中溫室氣體相關(guān)微生物(甲烷氧化菌、產(chǎn)甲烷菌等)進行研究，結(jié)果表明溫室氣體的排放影響著土壤中的相關(guān)微生物結(jié)構(gòu)，在探求溫室氣體釋放對環(huán)境影響的同時不能忽視對微生物機制的研究。如今，微陣列芯片技術(shù)已作為甲烷氧化菌多樣性研究的一個重要手段被廣泛應(yīng)用[19]。

3.4 基因組高通量測序

基因組高通量測序(HTS)，也稱下一代測序技術(shù)(Next generation sequencing, NGS)，其原理是將待測樣品基因長鏈打斷成短片段并在兩端加上接頭，然后使這些單個的小片段DNA分子結(jié)合在固相表面實現(xiàn)單分子的獨立擴增，最后通過高分辨率的成像系統(tǒng)檢測分析熒光信號，實現(xiàn)基因組測序的目的[25]?？蒲腥藛T以16s rRNA為標記基因研究了新西蘭部分草地和森林土壤，分析比較高通量測序和 DGGE 技術(shù)兩種方法在土壤微生物豐度、菌落結(jié)構(gòu)以及多樣性檢測方面的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者能夠更全面和準確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，DGGE僅能夠反應(yīng)有限的微生物類群，在極大程度上會低估物種組成結(jié)構(gòu)[26]。Duan等[27]用基因組高通量測序法研究了畜牧業(yè)表層土壤中甲烷氧化菌多樣性，表明該環(huán)境中Ⅰ型甲烷氧化細菌在物種多樣性和豐度方面更具優(yōu)勢。

3.5 磷酸脂肪酸分析技術(shù)

磷酸脂肪酸分析(PLFA)技術(shù)可以通過檢測微生物中獨特的磷酸脂肪酸類型和含量來評估不同種類微生物活細胞生物量。不同類型的甲烷氧化菌內(nèi)磷酸脂肪酸組成比例也有差異，Ⅰ型和X 型甲烷氧化菌活細胞內(nèi)占優(yōu)勢的為16-C脂肪酸,而18-C脂肪酸在Ⅱ型菌中含量更為豐富，C18:1ω8c和C18:1ω7c常作為標志性脂肪酸來檢測環(huán)境中TypeⅡ甲烷氧化菌的特異性存在[28]。實際應(yīng)用中，PLFA常與同位素13C標記相結(jié)合，13C-PLFA技術(shù)已成為目前研究土壤甲烷氧化菌的有力工具[29]。Boschker等[30]在對淡水湖泊底層沉積物甲烷氧化菌多樣性的研究中首次使用了13C-PLFA 技術(shù)，研究表明在該環(huán)境下氧化CH4的主導(dǎo)菌群為Ⅰ型甲烷氧化菌。Bodelier等[31]利用該技術(shù)標記研究22種TypeⅡ甲烷氧化菌并構(gòu)建其磷酸脂肪酸數(shù)據(jù)庫，結(jié)合多變量方差分析的方法，極大地提高了甲烷氧化菌系統(tǒng)發(fā)育分析的分辨率。但目前甲烷氧化菌的特征性脂肪酸數(shù)據(jù)信息不是很全面，并且該分析所用儀器較為昂貴，使得13C-PLFA技術(shù)的研究還存在一定的困難和挑戰(zhàn)[25]。

3.6 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(shù)(FISH)由Pardue和John兩個工作小組于1969年合作研究發(fā)明，該技術(shù)以細胞遺傳學為基礎(chǔ)，用熒光替代傳統(tǒng)的同位素標記，可以使樣品DNA進行原位雜交，不僅可以鑒定環(huán)境中特定種類的微生物，還能對其進行種群多樣性分析和動態(tài)追蹤監(jiān)測[32]。目前，F(xiàn)ISH 技術(shù)在甲烷氧化菌種群鑒定和種群密度定量描述等方面已取得重大進展，精確程度甚至可以達到物種水平[33]。Dekus等[34]利用該技術(shù)對海底甲烷滲漏區(qū)沉積物中的厭氧甲烷氧化菌與硫酸鹽還原菌展開研究，證實了兩者之間的互養(yǎng)共棲關(guān)系。Elizabeth研究課題組將FISH技術(shù)與標簽測序和細胞捕獲技術(shù)結(jié)合起來，研究某甲烷滲漏區(qū)沉淀物中甲烷氧化菌與其他微生物之間的關(guān)系，推測出甲烷氧化菌的氧化作用與沉積物中的其他微生物功能間存在著復(fù)雜的內(nèi)部聯(lián)系[35]。然而，由于熒光標記的探針與細胞 rRNA 的拷貝數(shù)直接相關(guān),同時也影響著細胞生長速率，而環(huán)境中細胞生長率過低會導(dǎo)致對靶細胞的檢出率降低,再加上強熒光背景的環(huán)境對特定細胞的檢測的干擾作用等[36]，這些因素都會影響到FISH 技術(shù)的準確性。

3.7 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)創(chuàng)立于19世紀80年代，最初的目的是用以分析基因突變，隨后Myuzer等在1993年利用該技術(shù)進行了微生物菌落結(jié)構(gòu)的研究并取得良好的效果，開啟了DGGE技術(shù)研究微生物生態(tài)多樣性的先河。DGGE技術(shù)可以將微生物基因組的長鏈DNA打斷成小片段進行研究，該過程可以通過加入了變性劑(甲酰胺和尿素)的凝膠電泳來實現(xiàn)。最近研究中，相關(guān)學者采用PCR-DGGE技術(shù)對某地污泥干化蘆葦床中的甲烷氧化菌進行了研究，過程中以pmoA作為分子標記，分析比較了不同生長時期以及不同位置存積淤泥中甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度變化[37]。此外，Chi等[38]利用PCR-DGGE和熒光定量PCR技術(shù)分析了中國南方地區(qū)垃圾填埋表層土壤甲烷氧化菌豐度和群落結(jié)構(gòu)，更進一步拓寬了PCR-DGGE技術(shù)在甲烷氧化細菌生態(tài)多樣性研究領(lǐng)域的應(yīng)用。但DGGE檢測技術(shù)也存在很多缺點：一方面，DGGE只能分析較短的(﹤500 bp)基因片段，這就造成了得到的系統(tǒng)發(fā)育信息不完善；另一方面，對一些進化關(guān)系相近的微生物類群來說，其基因PCR產(chǎn)物的分離不徹底也是造成分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成偏差的重要原因[36]。

4 展望

土壤甲烷氧化菌影響著大氣甲烷的氧化與吸收，在全球的溫室氣體平衡中起重要作用，并且甲烷氧化菌能夠降解鹵化烴類化合物，具有潛在的商業(yè)價值。目前為止，對甲烷氧化菌的研究還處于不斷探索的階段，土壤甲烷氧化菌多樣性是研究的重要環(huán)節(jié)，其中包括不同地域、不同植被類型的土壤等。分子生物學方法的興起為土壤甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的研究提供了強有力的工具，為揭示甲烷氧化菌的生態(tài)功能及生物多樣性提供了大量的信息。鑒于這些方法有各自的優(yōu)缺點，在實際應(yīng)用中，通常是多種技術(shù)相互補充印證，并且與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法相結(jié)合，以期得到的信息更加全面準確地反映出甲烷氧化細菌的群落結(jié)構(gòu)等生物學特征。

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Researchadvanceinsoilmethanotrophscommunitystructure

CAO Shu-zhen1， SHEN Yuan-yuan2， WANG Feng-qin1， SONG An-dong1， SANG Yu-qiang2

(1. College of Life Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002； 2. College of Forestry， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China)

Methane, one of the greenhouse gases, has a strong ability in absorbing infrared radiation and its warming potential of single molecule is 15-30 times higher than CO2. Soil methane absorption plays the significant role in the carbon and nitrogen cycle in ecosystem and carbon balance. In recent years, scientists have done a lot of researches on soil methanotrophic bacterias, and there are also many problems at the same time. This article starts with the methanotrophic microorganisms and summarizes the research advance in soil methane oxidation domestically and internationally. The various molecular biology methods used in methane oxidative bacteria community structure were introduced. It aims to synthesize the research advance in soil methane oxidation and the influence mechanism at home and abroad, which provides theoretical reasons to recognize the role of soil methanotrophic bacterias in global climate change and a theoretical guidance for carrying out the research of surficial methane flux.

methanotrophic bacteria; community structure; soil

2016-10-28；

2016-12-16

國家科技支撐計劃子課題(2015BAD07B050601)；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201404206-03)；河南省教育廳重點研究項目(16A220003)

曹淑貞，碩士，專業(yè)方向為微生物生態(tài)學，E-mail: 13154665225@163.com

桑玉強，副教授，從事林業(yè)生態(tài)學研究，E-mail: syuqiang@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.078

Q938.1+3

A

2095-1736(2017)06-0078-05