王 雨, 何盛南, 蔡志明, 牟麗莎

(1. 中山大學 醫(yī)學院, 廣州 510275； 2. 深圳市第二人民醫(yī)院, 深圳 518035)

溫度對微囊化重組CHO細胞生長和去氨普酶表達的影響

王 雨1,2, 何盛南1,2, 蔡志明2, 牟麗莎1,2

(1. 中山大學 醫(yī)學院, 廣州 510275； 2. 深圳市第二人民醫(yī)院, 深圳 518035)

為了研究不同溫度對微囊化rCHO細胞生長代謝和重組蛋白表達影響，采用不同溫度培養(yǎng)微囊化rCHO細胞，經(jīng)MTT法測定細胞生長曲線，生物傳感器測定葡萄糖和乳酸代謝，纖溶平板測定去氨普酶(DSPA，Desmodus rotundus salivary plasminogen activator)蛋白表達量。結(jié)果表明，低溫培養(yǎng)降低微囊化rCHO的增殖速率和細胞密度，但提高了重組蛋白的生產(chǎn)?？梢姕囟蕊@著影響微囊化rCHO的生長代謝和重組蛋白表達，33℃下可以將DSPA蛋白生產(chǎn)量最大提高41%。

微膠囊；溫度；重組蛋白表達；細胞培養(yǎng)

去氨普酶(DSPA，Desmodus rotundus salivary plasminogen activator) 是一種從南美吸血蝙蝠唾液中提取的纖溶酶原激活劑，也是第3代溶栓藥物[1]。與第1代和第2代溶栓藥物，如tPA、uPA等相比，DSPA具有高度的溶栓能力，而且纖維蛋白特異性更高，不易引起出血性并發(fā)癥[2-3]，目前已進入Ⅱ期臨床試驗。DSPA可通過重組技術(shù)在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中進行生產(chǎn)[4]，通過哺乳動物細胞生產(chǎn)蛋白藥物也是生物制藥的發(fā)展趨勢[5]。哺乳動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)越來越多地采用無血清培養(yǎng)基，可以避免血清源性污染和有利于下游產(chǎn)品的純化，但是同時也易造成細胞的凋亡，降低了細胞的蛋白表達能力。我國每年發(fā)生缺血性腦卒中的人口約有200萬，臨床治療劑量巨大，如何高效地表達蛋白成為重要的研發(fā)環(huán)節(jié)。

從當前發(fā)展趨勢來看，使用攪拌式生物反應(yīng)器進行懸浮細胞的無血清培養(yǎng)是目前世界范圍內(nèi)各大生物公司產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向。動物細胞無血清、懸浮培養(yǎng)在提高細胞密度、單位產(chǎn)量、簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、保證產(chǎn)品質(zhì)量等方面都起到非常重要的作用，是高效生產(chǎn)最有效的途徑。目前動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)已經(jīng)是世界各大生物公司競相開發(fā)的前沿課題，美國FDA也要求各生物公司建立的規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)平臺。同時由于大型生物反應(yīng)器容量的過剩，國際上對動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究方向集中在培養(yǎng)工藝的優(yōu)化。

我國的生物技術(shù)藥物發(fā)展起步較晚，與國外相比，在哺乳動物細胞培養(yǎng)的上游技術(shù)方面，我國的基因重組技術(shù)水平低，構(gòu)建的細胞系表達能力遠低于國外。以tPA為例，我國的CHO表達能力僅是美國的1/10～1/5，提高細胞系的表達能力需要大量的資金和技術(shù)投入，短時間內(nèi)極難完成。同時，我國的反應(yīng)器容量小，如果盲目套用國外成熟的哺乳動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)，就要相應(yīng)擴大生產(chǎn)規(guī)模，從而將成本增加至5～10倍，這顯然是極不現(xiàn)實的。因此，根據(jù)我國的現(xiàn)狀優(yōu)化動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)是發(fā)展重組蛋白藥物的必然要求。

重組蛋白的生產(chǎn)可以通過兩個方面提高：細胞密度和細胞的蛋白表達能力。微囊化培養(yǎng)細胞技術(shù)是Lim和Sun提出的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)[6]，利用聚賴氨酸-海藻酸鈉-聚賴氨酸(APA)微囊將細胞包裹在半透膜中。微囊膜可防止細胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷，同時半透膜允許小分子影響物質(zhì)自由通過被細胞利用。微囊為細胞提供了一個相對封閉的微環(huán)境，使細胞在囊內(nèi)呈三維立體方式生長，有利于細胞間信息傳遞，提高重組細胞的產(chǎn)物表達能力[7]。在我們的前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與懸浮培養(yǎng)相比，微囊化培養(yǎng)可以將CHO的DSPA生產(chǎn)能力從32.5 μg/mL提高到95.5 μg/mL[8]。

細胞培養(yǎng)的環(huán)境溫度是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的重要優(yōu)化指標。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度的適當降低會使部分種類的細胞的生長代謝和蛋白表達發(fā)生變化。例如，培養(yǎng)溫度降低時，雜交瘤細胞的生長代謝變緩，存活率提高，抗體的生產(chǎn)能力保持穩(wěn)定[9-11]；重組BHK細胞的生長和代謝減緩，不影響重組抗凝血酶III的生產(chǎn)[12]；人胚胎肺細胞生產(chǎn)TPA的能力提高[13]。

優(yōu)化重組CHO細胞的培養(yǎng)工藝對細胞的生長代謝及蛋白表達都是十分重要的。為了提高蛋白的容積產(chǎn)率，既要獲得較高的細胞密度，又要提高細胞的蛋白表達能力。本實驗中我們采用微囊化技術(shù)對表達DSPA蛋白的重組CHO細胞進行培養(yǎng)，并在細胞生長進入對數(shù)期時用不同溫度對微囊化細胞進行處理，考察低溫條件對細胞密度和蛋白表達的影響，以期對微囊化細胞培養(yǎng)工藝的優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株及試劑：重組中國倉鼠卵巢細胞(recombinant China Hamster Ovary， rCHO)由山東齊魯制藥有限公司惠贈；培養(yǎng)基為CD OptiCHO(美國，Gibco公司)；谷氨酰胺(美國，Sigma公司)。聚賴氨酸(美國，Sigma公司)；海藻酸鈉(青島晶巖生物技術(shù)有限公司)；凝血酶原(美國，Sigma公司)；纖維蛋白原(美國，Sigma公司)；纖溶酶原(美國，Sigma公司)；MTT(美國，Sigma公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器： MS-353酶聯(lián)免疫檢測儀(Labsystems Co. Ltd,芬蘭)；Heraeus BB 16UV CO2恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force Development Co. Ltd,中國)；大功率高壓脈沖微膠囊制備儀(本實驗室研制)；微囊靜電液滴發(fā)生器(本實驗室研制)。

1. 2 實驗方法和步驟

1.2.1 rCHO細胞的培養(yǎng)和計數(shù) 細胞生長到對數(shù)期后用臺盼蘭染色計算活細胞數(shù)量，接種到100 mL細胞培養(yǎng)瓶中，所用培養(yǎng)液為CD OptiCHO培養(yǎng)液(4 mmol/L谷氨酰胺)，接種密度為2×105/mL。每3天取上清于-20℃冰箱內(nèi)保存，并用臺盼蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)量。

1.2.2 微囊化rCHO細胞的制備[7]細胞生長到對數(shù)期后用臺盼蘭染色計算活細胞數(shù)量，懸于1.5%(W/V)海藻酸鈉溶液中，細胞密度為2×106/mL。使用微囊靜電液滴發(fā)生器將細胞-海藻酸鈉混懸液滴入1.1%(W/V)的CaCl2溶液中鈣化20 min形成海藻酸鈣膠珠，然后依次用多聚賴氨酸成膜，用55 mmol/L檸檬酸鈉溶液液化，獲得包裹rCHO細胞的微膠囊。

1.2.3 微囊化rCHO細胞的培養(yǎng) 將制備好的微囊化rCHO細胞與培養(yǎng)基按體積比1∶10加入100 mL培養(yǎng)瓶中，分別在30℃、33℃和37℃，體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為CD OptiCHO培養(yǎng)液(4 mmol/L谷氨酰胺)。每3天取上清于-20℃冰箱內(nèi)保存，對細胞培養(yǎng)體系進行全換液。

1.2.4 微囊內(nèi)活細胞密度測定 微囊內(nèi)活細胞密度測量采用MTT法,MTT被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。將適量微囊加入24孔板，按10%體積加入MTT溶液，于37℃，5% CO2及飽和濕度條件下孵育24 h，使用DMSO溶解藍色結(jié)晶后在酶標儀570/630 nm雙波長下測定吸光度。根據(jù)吸光度OD值與微囊內(nèi)活細胞做標準曲線,根據(jù)標準曲線計算細胞密度。

1.2.5 葡萄糖和乳酸代謝的測定 培養(yǎng)液中的葡萄糖和乳酸濃度采用SBA-40C型生物傳感分析儀測定。

1.2.6 DSPA蛋白的測定 由Granelli等于1978年建立的檢測PA物質(zhì)的體外纖溶活性，模擬PA溶栓反應(yīng)，溶圈直徑與PA含量的對數(shù)線性相關(guān)，通過標準品形成溶圈梯度標準曲線估測PA含量，是定性和半定量檢測PA的首選方法。根據(jù)文獻報道制作纖維蛋白平板[14]，以生理鹽水為溶劑配制0.5%瓊脂糖凝膠，加入纖維蛋白原(0.529 U/mL)，凝血酶原(0.056 U/mL)，纖溶酶原(少量)，倒入水平放置的24孔板蓋內(nèi)凝固后打孔使用。向每孔內(nèi)加入梯度濃度的DSPA標準品，測量溶圈直徑，制作濃度直徑標準曲線。向每孔內(nèi)加入待測樣品，測量溶圈直徑，回歸標準曲線可得到待測樣品的DSPA濃度。

其中μp為DSPA比生產(chǎn)速率，μg/106cells/d；X為細胞密度，106/mL；△P為DSPA產(chǎn)量mg/L；t為培養(yǎng)時間，d；n代表時間點。

其中YX/G為細胞對營養(yǎng)物的得率系數(shù)，106/mg;△X為細胞增殖數(shù)量，106/mL；△G為葡萄糖消耗，mg/L。

其中YP/G為DSPA對營養(yǎng)物的得率系數(shù)，mg/mg; △P為DSPA產(chǎn)量，mg/L；△G為葡萄糖消耗量，mg/L。

其中YL/G為乳酸對營養(yǎng)物的得率系數(shù)，mg/mg; △L為乳酸生成量，mg/L；△G為葡萄糖消耗量，mg/L。

2 結(jié)果

2.1 微囊化培養(yǎng)對重組CHO細胞生長和DSPA表達的影響

圖 1 不同培養(yǎng)方式下rCHO細胞的生長和DSPA生產(chǎn)曲線

為了考察微囊化培養(yǎng)對rCHO生長和蛋白表達的影響，本文考察了在不同培養(yǎng)條件下細胞的MTT活性，根據(jù)臺盼蘭計數(shù)及微囊化計數(shù)標準曲線，得到不同培養(yǎng)條件下微囊化rCHO細胞的生長曲線和DSPA表達曲線(圖1-A和1-B)。從圖1A中可以看出，不同培養(yǎng)條件下rCHO的生長趨勢是一致的，在培養(yǎng)初期生長緩慢，培養(yǎng)一周左右后進入對數(shù)生長期。而微囊化細胞的對數(shù)增長期可以維持12 d，并且獲得高密度的細胞數(shù)量，最大細胞密度為(3.86±0.09)×106/mL，是裸細胞最大密度的223%。在整個培養(yǎng)過程中，微囊化rCHO的DSPA蛋白產(chǎn)量一直高于裸細胞培養(yǎng)，在第15天兩種培養(yǎng)方式都獲得了最高產(chǎn)量，微囊化培養(yǎng)的最高產(chǎn)量為(41.48±1.01)mg/L,比裸細胞的最高產(chǎn)量提高了72%(圖1-B)。比生成速率(μp)的物理意義是單位時間內(nèi)單位數(shù)量的rCHO的DSPA產(chǎn)量，表征了單細胞的重組蛋白生產(chǎn)能力。從圖1-C可以看出，微囊化培養(yǎng)促進了rCHO細胞的DSPA生產(chǎn)能力，最大生產(chǎn)能力為(7.68±0.19)μg/106cells/d，比裸細胞培養(yǎng)提高了59%。微囊化培養(yǎng)不但提高了rCHO的細胞密度，而且促進了細胞的蛋白生產(chǎn)能力，從而增加了培養(yǎng)體系的DSPA產(chǎn)量。

2.2 溫度對微囊化rCHO細胞生長的影響

圖 2 溫度對微囊化rCHO細胞生長的影響

在微囊化細胞進入對數(shù)生長期時采用不同的培養(yǎng)溫度，結(jié)果顯示在繼續(xù)培養(yǎng)過程中，在低溫條件(30℃)下，細胞數(shù)量減少，比生長速率為負。在較低溫度(33℃)下，rCHO細胞的生長速度減慢，最大密度為(3.06±0.07)×106/mL，是37℃培養(yǎng)溫度下最大細胞密度的79%，二者的比生長速率無顯著性差異。但同時低溫也延長了細胞維持最大密度的時間，并且在37℃下細胞密度下降的培養(yǎng)后期，仍然保持了較高的細胞密度(圖2)。盡可能延長高密度細胞的生長時間，是獲得蛋白高產(chǎn)量的途徑之一。

2.3 溫度對微囊化rCHO細胞蛋白表達的影響

為了考察微囊化rCHO細胞在不同溫度下的蛋白表達，使用纖溶平板法測定培養(yǎng)體系中DSPA的濃度即容積產(chǎn)率，結(jié)果如圖3。低溫條件(30℃)下，微囊化rCHO的蛋白表達能力持續(xù)下降。從圖3-A中可知，33℃下微囊化rCHO細胞的DSPA生產(chǎn)量與37℃相比，細胞的數(shù)量減少，但是蛋白表達量反而增加。最大值分別可達(48.43±0.88)mg/L和(41.48±1.01)mg/L，低溫培養(yǎng)的DSPA最大表達量是37℃的117%。對于DSPA比生產(chǎn)速率的比較(圖3-B)表明，33℃下，微囊化rCHO細胞的DSPA生產(chǎn)能力比37℃下最大提高了41%，并且在進入對數(shù)生長期后的一周內(nèi)保持較高的蛋白表達活性。

圖 4 溫度對微囊化rCHO細胞代謝的影響Fig 4 The effect of temperature on the metabolism of microencapsulated rCHO cells

2.4 溫度對微囊化rCHO細胞代謝的影響

微囊化rCHO細胞的葡萄糖及乳酸代謝由生物傳感器測得，結(jié)果見圖4。在培養(yǎng)溫度由37℃降至33℃時，微囊化rCHO細胞的葡萄糖消耗和乳酸生成隨著溫度降低而減少，說明隨著培養(yǎng)溫度的降低，葡萄糖代謝速率降低。結(jié)合圖2進行分析，在溫度從37℃降低到33℃的前3天培養(yǎng)時間，微囊化rCHO細胞幾乎沒有增殖，對葡萄糖的攝取出現(xiàn)明顯減少，但乳酸生成量增加，說明在低溫培養(yǎng)初期，微囊化rCHO的葡萄糖代謝更多地進入糖酵解途徑。分析原因在于，培養(yǎng)溫度的驟然下降，線粒體對有氧代謝功能減弱，而經(jīng)過短暫適應(yīng)過程后，微膠囊微環(huán)境幫助囊內(nèi)拮抗環(huán)境變化，使細胞對葡萄糖的利用恢復到初始水平，但整體仍低于較高溫度下。同時，隨著溫度的降低，細胞對葡萄糖的得率升高，乳酸對葡萄糖的得率降低，產(chǎn)物對葡萄糖的得率顯著增加，結(jié)果見圖5。說明隨著溫度降低，葡萄糖用于無氧呼吸的比例降低，用于細胞增殖和DSPA蛋白生產(chǎn)的葡萄糖比例增加。在溫度對雜交瘤細胞影響的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律[15]。結(jié)合圖2～5，可以發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下(30℃)，微囊化CHO細胞數(shù)量，代謝及蛋白生產(chǎn)能力均下降，不適合進行培養(yǎng)。

3 討論

目前的研究表明：微囊化培養(yǎng)和低溫培養(yǎng)都有利于重組細胞的蛋白表達。為了獲得最大的重組蛋白產(chǎn)量，一方面要盡可能提高細胞密度，另一方面要保持細胞的蛋白表達能力。

圖 5 溫度對微囊化rCHO細胞的細胞得率、產(chǎn)物得率和乳酸得率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，微囊化rCHO細胞可以提高DSPA蛋白的產(chǎn)量，原因在于微囊化培養(yǎng)為細胞提供了三維生長環(huán)境，不僅提高了細胞密度，而且促進了單位細胞生產(chǎn)DSPA蛋白的能力，所以微囊化培養(yǎng)提高了生產(chǎn)體系的DSPA產(chǎn)量。但微囊化細胞的增殖和蛋白表達存在負相關(guān)，當細胞增殖過快時，營養(yǎng)物質(zhì)過多用于細胞自身蛋白的合成，重組蛋白的表達受到影響，并非細胞密度越大，所能獲得的重組蛋白的產(chǎn)量越高[16]。

適當降低溫度減緩了細胞生長，使最大細胞密度降低，延長了細胞生長的延滯期，細胞增殖較快時，更多細胞進入細胞周期的G1期，而處于表達重組蛋白的G0期的細胞數(shù)量少直接導致重組蛋白產(chǎn)量低[17-18]。低溫培養(yǎng)增加了雜交瘤細胞的G1期比例[19]，提高了單克隆抗體的生產(chǎn)[15]。Kaufmann在CHO細胞的低溫培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，溫度降低誘導了RNA結(jié)合蛋白CIRP的過量表達，從而抑制細胞生長停留在細胞周期的G1期[20]，溫度降低也會延遲細胞的凋亡[21]。低溫培養(yǎng)降低了細胞對葡萄糖的代謝能力和乳酸對葡萄糖的得率，提高了細胞和DSPA蛋白對葡萄糖的得率，說明低溫條件下葡萄糖更多的用于細胞增殖和DSPA蛋白的合成，因而重組蛋白的表達活性較高。

本文著重研究了不同溫度對微囊化rCHO細胞的生長代謝及蛋白表達能力的影響。結(jié)果表明，隨著溫度適當降低，微囊化rCHO的細胞密度降低，但是蛋白表達能力并不隨著溫度降低而提高，從而提高蛋白生產(chǎn)量。該結(jié)果對微囊化培養(yǎng)rCHO細胞生產(chǎn)重組蛋白的工藝優(yōu)化提供了一定的依據(jù)。

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EffectsoftemperatureonmicroencapsulatedrecombinantCHOcellsproliferationandDSPAproduction

WANG Yu1, 2, HE Sheng-nan1, 2, CAI Zhi-ming2, MOU Li-sha1, 2

(1. Medicine School， Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275; 2. Shenzhen Second People′s Hospital, Shenzhen 518035, China)

To investigate the effects of temperature on microencapsulated recombinant CHO (rCHO) cells proliferation, metabolism and recombinant protein expression, microencapsulated rCHO cells were cultured under different temperature. MTT method was used to measure the cell density, biosensor was used to measure the metabolism of glucose and lactate, and fibrin plate assay was used to measure the expression of DSPA protein. Lower temperature inhibited the cell growth rate and cell density, but improved the DSPA production capacity of microencapsulated rCHO. The DSPA production increased by 41% at 33℃ compared with 37℃.

microencapsulated; temperature; recombinant protein expression; cell culture

2016-11-30；

2016-12-13

國家自然科學基金(21602138)；深圳市三名工程；深圳市科創(chuàng)委學科布局項目(JCYJ20160229204849975)；高水平醫(yī)學學科建設(shè)專項基金(2016031638)；深圳市科創(chuàng)委企業(yè)工程中心項目(GCZX2015043017281705)

王 雨，博士，助理研究員，研究方向為生物醫(yī)學工程，E-mail:sszzxeno@126.com

牟麗莎，博士，副研究員，研究方向為生物醫(yī)學工程， E-mail:molly__molly@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.013

Q813; Q819

A

2095-1736(2017)06-0013-06