方 雯，李 澤，劉曉華，柳昭明，敦 藝，馮 紅△

一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠PHB1表達(dá)及線粒體功能的影響*

方 雯1，2，李 澤3，劉曉華2，柳昭明1，敦 藝1，馮 紅1△

（1.天津體育學(xué)院，天津300381；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津300050；3.北京朝陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合急診搶救中心，北京100020）

目的：觀察一次性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腦、心、骨骼肌組織和線粒體中PHB1含量的變化及對(duì)大鼠線粒體功能的影響，探尋PHB1與線粒體功能和能量代謝的關(guān)系。方法：健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為2組（n＝20）：對(duì)照組和一次性力竭運(yùn)動(dòng)組，大鼠進(jìn)行一次性急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建立力竭運(yùn)動(dòng)模型。收集各組大鼠的心、腦和骨骼肌組織樣品并提取線粒體，檢測(cè)其呼吸功能和ROS的變化。用Western blot方法檢測(cè)組織和線粒體中PHB1蛋白表達(dá)水平；用分光光度計(jì)檢測(cè)各器官中ATP含量以及線粒體中復(fù)合體V活性（ATP合酶活性）。結(jié)果：①一次性力竭運(yùn)動(dòng)后腦、心肌、骨骼肌中ATP含量顯著性降低；②一次性力竭運(yùn)動(dòng)后腦、心肌、骨骼肌線粒體中復(fù)合體V活性、RCR、ROS顯著性降低，ST4均顯著性升高，ST3無(wú)顯著性差異。③一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌線粒體中PHB1的表達(dá)顯著性減少。④通過(guò)相關(guān)性分析得出：一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌中ATP含量與心、腦、骨骼肌中復(fù)合體V活性呈正相關(guān)；心、腦、骨骼肌中ATP含量和心、腦骨骼肌中PHB1的表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論：一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，降低線粒體氧化磷酸化功能，使大鼠腦、骨骼肌線粒體內(nèi)ROS生成增加，PHB1的表達(dá)、ATP含量和復(fù)合體V活性均下降。一次性力竭運(yùn)動(dòng)使得大鼠線粒體內(nèi)PHB1表達(dá)降低，線粒體功能減弱，機(jī)體能量代謝降低。

一次性力竭運(yùn)動(dòng)；線粒體；線粒體呼吸功能；PHB1：能量代謝；大鼠

抗增殖蛋白（prihibitin，PHB）是一種在進(jìn)化上高度保守的蛋白，其在細(xì)菌、植物、酵母、原蟲(chóng)及哺乳類等多種生物細(xì)胞中廣泛存在。PHB家族包括PHB1、PHB2、PHB3和 PHB4四種亞型［1］。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)PHB與ROS產(chǎn)生過(guò)多引起的生物進(jìn)程（如衰老、Ⅱ型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病及心臟病等的改變）密切相關(guān)，在線粒體呼吸傳遞鏈的亞單位裝配中PHB復(fù)合物充當(dāng)分子伴侶的作用，參與細(xì)胞能量代謝，發(fā)揮抗衰老的作用［2］。PHB1在調(diào)控細(xì)胞的能量代謝方面也有著重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)其是通過(guò)調(diào)控線粒體的功能進(jìn)而影響細(xì)胞氧耗和氧化磷酸化水平，同時(shí)PHB1還參與脂肪代謝和葡萄糖有氧代謝的調(diào)節(jié)。在脂肪細(xì)胞中，定位于脂膜上PHB1是作為一種脂筏蛋白而存在的。其通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞間隙與線粒體聯(lián)系，能夠抑制丙酮酸羧化酶的活性從而間接調(diào)節(jié)葡萄糖糖代謝和脂肪酸氧化［3］。大量研究表明，進(jìn)行急性疲勞性運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體在能量代謝和線粒體功能方面均會(huì)有著不同程度的適應(yīng)性改變。然而目前關(guān)于機(jī)體在一次性力竭運(yùn)動(dòng)后PHB1的表達(dá)對(duì)線粒體功能的影響尚未清楚。本研究通過(guò)觀察一次性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠腦、心、骨骼肌中ATP含量、線粒體功能及PHB1表達(dá)的變化，探討在急性運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下PHB1表達(dá)與能量代謝和線粒體功能之間的關(guān)系。進(jìn)一步研究PHB1對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化呼吸鏈?zhǔn)欠裼姓{(diào)控作用，PHB1和細(xì)胞內(nèi)ATP合成酶是否有相互作用影響機(jī)體的線粒體功能及能量代謝。以探尋PHB1是否是調(diào)控線粒體能量代謝的相關(guān)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，180～220 g。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，稱重后隨機(jī)分為 2組（n＝20）：（1）對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)，不加干預(yù)。（2）一次性力竭運(yùn)動(dòng)組：常規(guī)飼養(yǎng)，8周后大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)。

1.2 一次性力竭運(yùn)動(dòng)整體動(dòng)物模型的建立

一次性力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行一次性急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度 20 m／min，持續(xù)時(shí)間 30 min，共訓(xùn)練3 d。一次性力竭運(yùn)動(dòng)：以20 m／min適應(yīng)30 min，然后以遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)至力竭。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷分為三級(jí)：第1級(jí)：速度為10 m／min，運(yùn)動(dòng) 15 min；第 2級(jí)：速度為 15 m／min，運(yùn)動(dòng) 15 min；第 3級(jí)：速度為 20 m／min，運(yùn)動(dòng)至力竭。判斷力竭狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)為［4］：大鼠跑姿由蹬地式轉(zhuǎn)變?yōu)榉厥?，滯留在跑道末端不再繼續(xù)跑動(dòng)，且電刺激也不能驅(qū)使大鼠再繼續(xù)跑動(dòng)。

1.3 主要試劑與儀器

無(wú)水甲醇和無(wú)水乙醇均購(gòu)自天津市江天化工技術(shù)有限公司；顯影粉、定影粉、蔗糖、RIRA裂解液均購(gòu)自天津市鼎國(guó)技術(shù)有限公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、考馬斯亮藍(lán)G250、水合氯醛、D-甘露醇、進(jìn)口脫脂奶粉、ADP均購(gòu)自天津市生工生物工程技術(shù)有限公 司。High-resolution respirometry（Oxygraph-2k），MIKRO 120離心機(jī)（Hettich ZENTRIFUGEN），MIKRO 200R離心機(jī)（Hettich ZENTRIFUGEN），可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Thermo NANODROP 2000c），PH計(jì)（Grant-bio POS-300），搖床（Grant-bio POS-300）磁力攪拌器（Stable Temp Cole-Parmer）

1.4 大鼠心、腦、骨骼肌線粒體的制備

一次性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠斷頭處死，立即剪開(kāi)胸腔暴露心臟，直接剪取心臟、全腦、骨骼肌，切除多余部分，置于預(yù)冷的線粒體分離介質(zhì)中，洗去血液，再用濾紙吸干充分剪碎后，置于預(yù)冷的玻璃勻漿器中手動(dòng)勻漿（不能左右旋轉(zhuǎn)）。采用差速離心法分離線粒體，棄上清，沉淀用線粒體提取介質(zhì)重懸，所得的沉淀即為粗制線粒體。以上操作均在0～4℃進(jìn)行。

1.5 心、腦、骨骼肌線粒體呼吸功能的測(cè)定

采用Oxygraph-2k高分辨率的線粒體呼吸系統(tǒng)測(cè)定大鼠各組織線粒體的氧耗速率，計(jì)算呼吸控制率比（respiratory control rates，RCR），用態(tài) 3呼吸速率（respiration rate state 3，ST3）和態(tài)4呼吸速率（respiration rate state 4，ST4）的比值，評(píng)定線粒體呼吸功能。先預(yù)熱儀器，使其達(dá)恒溫25℃，約1 h左右，進(jìn)行空氣校準(zhǔn)，加入2.1 ml的腦（或者心肌、骨骼肌）線粒體呼吸介質(zhì)（RCR介質(zhì)），插入鈦金屬塞，使其保留與墊片厚度一樣的高度，保證呼吸所需的一定空氣，將濃度定好的待測(cè)腦、心肌、骨骼肌線粒體300μg加入其中，當(dāng)氧濃度出現(xiàn)新的穩(wěn)定點(diǎn)并基本保持不變時(shí)，加入蘋果酸和谷氨酸混合物（即M+G）氧濃度又達(dá)到一個(gè)新平衡點(diǎn)，態(tài)2呼吸，待穩(wěn)定5～10 min后加入ADP，出現(xiàn)高平臺(tái)態(tài)3呼吸，然后極劇下降出現(xiàn)態(tài)4呼吸，5 min左右后停止檢測(cè)，計(jì)算RCR＝ST3／ST4值。

1.6 心、腦、骨骼肌中ATP含量的測(cè)定

組織樣本：稱重后，剪碎，按重量體積比（W／V）1∶9加入沸雙蒸水，在沸水中勻漿，制成10%的勻漿液，再置于沸水浴中煮10 min，取出混勻抽提1 min，4 000 r／min離心 10 min，取上清液待測(cè)。方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。利用分光光度計(jì)檢測(cè)各器官的吸光度值，從而計(jì)算出ATP含量。

1.7 心、腦、骨骼肌線粒體ROS生成測(cè)定

采用BPCL（微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x）與BPCL-G（生物與化學(xué)光子計(jì)數(shù)器）測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定從SD大鼠提取的腦、心、骨骼肌線粒體ROS的產(chǎn)生，判斷線粒體的損傷情況。方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.8 心、腦、骨骼肌線粒體復(fù)合體V活性（ATP合成酶活性）檢測(cè)

將腦、心、骨骼肌線粒體提取好后，置于37℃／-70℃反復(fù)凍融3次，使線粒體膜破裂，進(jìn)行線粒體呼吸鏈復(fù)合體V酶活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)溫度定為30℃，波長(zhǎng)為340 nm，間隔30 s，讀數(shù)11次，共5 min，并置零。測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。利用分光光度計(jì)檢測(cè)各器官的吸光度值，從而計(jì)算出線粒體中復(fù)合體V活性（ATP合酶活性）。

1.9 Western blot法檢測(cè)心、腦、骨骼肌線粒體中PHB1表達(dá)和蛋白質(zhì)相對(duì)定量分析

分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為12%。麗春紅預(yù)染后，用TBST配置5%脫脂牛奶對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉2 h。將封閉后的PVDF膜置于用TBST稀釋的一抗稀釋液中于搖床上孵育，搖床轉(zhuǎn)速為60 r／min，4℃過(guò)夜。一抗孵育后TBST洗膜共3次，每次10 min。加入相對(duì)應(yīng)的二抗孵育1 h 30 min，室溫，搖床轉(zhuǎn)速為60 r／min。二抗孵育后TBST洗膜共3次，每次10 min。發(fā)光底物孵育3～5 min。X射線膠片曝光顯影。掃描定影后自然風(fēng)干的X線膠片，用Quantity ONE（BIO-RAD）軟件對(duì)目的蛋白和內(nèi)參蛋白（β-tubulin／COXIV）條帶進(jìn)行光密度分析。用目的蛋白灰度值／內(nèi)參蛋白灰度值表示目的蛋白相對(duì)含量。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS軟件（SPSS19.0 for Windows）處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用單因素方差分析法和獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)組間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心、腦、骨骼肌組織中ATP含量的影響

與對(duì)照組相比，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌組織中的ATP含量均顯著降低（p＜0.05，表1）。

Tab.1 The effects of acute exhaustive exercise on ATP contents in brain，myocardium and skeletal muscle of rats（ˉx±s，n＝20）

2.2 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心、腦、骨骼肌線粒體復(fù)合體V活性的影響

與對(duì)照組相比，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌、腦和心肌線粒體復(fù)合體V活性均顯著降低（p＜0.01，表2）。

Tab.2 The effects of acute exhaustive exercise on the activities of mitochondrial complex V in the myocardium，brain and skeletal muscle of rats（ˉx±s，n＝20）

2.3 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心、腦、骨骼肌線粒體呼吸控制比（RCR）、ST3、ST4的影響

與對(duì)照組相比，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌線粒體中呼吸控制比（RCR）和ST3值下降（p＜0.01，p＜0.05）；而 ST4值無(wú)顯著變化（P＞0.05，表3-5）。

Tab.3 Effects of acute exhaustive exercise on mitochondrial respiratory control rates（RCR）in heart，brain and skeletal muscle of rats（ˉx±s，n＝20）

Tab.4 Effects of acute exhaustive exercise on ST3 in heart，brain and skeletal muscle of rats（ˉx±s，n＝20）

Tab.5 Effects of acute exhaustive exercise on ST4 in heart，brain and skeletal muscle of rats（ˉx±s，n＝20）

2.4 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心、腦、骨骼肌線粒體ROS生成的影響

一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，腦、心肌、骨骼肌線粒體中活性氧生成增多（p＜0.05，p＜0.01，表 6）。

2.5 一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠腦、心肌、骨骼肌線粒體中PHB1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后腦和骨骼肌線粒體中PHB1表達(dá)減少（p＜0.05，表 7）。但心肌線粒體中PHB1表達(dá)（P＞0.05）無(wú)明顯變化。

Tab.6 Effect of acute exhaustive exercise on ROSgeneration in rat brain，myocardium and skeletal muscle（ˉx±s，n＝20）

Tab.7 Effects of acute exhaustive exercise on the expressions of PHB1 in mitochondria of the myocardium，brain and skeletal muscle of rats（ˉx±s，n＝20）

2.6 一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心肌、腦、骨骼肌線粒體中PHB1表達(dá)與ATP含量變化、線粒體復(fù)合體V活性及ROS產(chǎn)生的相關(guān)性分析

2.6.1 一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦骨骼肌、線粒體中PHB1表達(dá)與ATP含量變化相關(guān)性分析 表8顯示，在一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌線粒體PHB1的表達(dá)分別與腦、骨骼肌中ATP含量呈正相關(guān)。

Tab.8 Correlative analysis of PHB1 expressions and ATPcontents in skeletal muscle，myocardium，brain tissue and mitochondria after acute exhaustive exercise

2.6.2 一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌線粒體中PHB1表達(dá)與復(fù)合體V活性變化的相關(guān)性分析 表9顯示，在一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心肌、腦、骨骼肌線粒體中PHB1的表達(dá)分別與心、腦、骨骼肌線粒體復(fù)合體V活性呈正相關(guān)。

2.6.3 一次性力竭運(yùn)動(dòng)后骨骼肌、心肌、腦組織和線粒體中PHB1表達(dá)與ROS生成的相關(guān)性分析 表10顯示，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌線粒體中PHB1的表達(dá)與腦、骨骼肌線粒體中ROS生成呈正相關(guān)。

Tab.9 Correlative analysis of PHB1 expressions and complex V activities in skeletal muscle，myocardium，brain tissue and mitochondria after acute exhaustive exercise

Tab.10 Correlative analysis of PHB1 expressions and ROS production in skeletal muscle，myocardium，brain tissue and mitochondria after acute exhaustive exercise

3 討論

線粒體的主要生物學(xué)功能是合成ATP，為機(jī)體提供能量。細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量大約有95%來(lái)自線粒體。線粒體功能障礙，將直接影響耗能高的組織，如心肌、骨骼肌、腦等的正常功能。此外線粒體在維持線粒體氧化磷酸化反應(yīng)、調(diào)節(jié)膜電位、控制細(xì)胞凋亡、維持機(jī)體呼吸功能、維持細(xì)胞pH值平衡等方面亦起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)從一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，大鼠心、腦、骨骼肌內(nèi)ATP含量、線粒體復(fù)合體V活性、線粒體呼吸功能及活性氧生成等方面的變化，研究一次性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠線粒體功能的影響。

ATP是生命活動(dòng)中能量代謝的直接能量來(lái)源，ATP含量維持在一定水平是生命體進(jìn)行生命活動(dòng)的重要前提。而關(guān)于運(yùn)動(dòng)時(shí)ATP含量的變化，大多數(shù)研究?jī)H限于骨骼肌，且結(jié)果不盡相同，在腦、心肌中ATP含量研究也較少。1985年Cook R［5］研究發(fā)現(xiàn)肌肉長(zhǎng)時(shí)間收縮能夠抑制ATP的水解，證明ATP對(duì)運(yùn)動(dòng)能力有著影響。1994年田野［6］等人研究發(fā)現(xiàn)急性力竭運(yùn)動(dòng)后即刻骨骼肌ATP含量明顯下降，運(yùn)動(dòng)后24 h有所恢復(fù)，但仍低于運(yùn)動(dòng)前的水平。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)ATP含量顯著降低。由于一次性力竭運(yùn)動(dòng)屬于大強(qiáng)度且長(zhǎng)時(shí)間的急性運(yùn)動(dòng)，需要大量消耗ATP，當(dāng)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ATP大量減少后，后期機(jī)體供能主要靠糖酵解，但糖酵解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，使得體內(nèi)pH值下降，線粒體氧化磷酸化反應(yīng)受阻，ATP合成受阻，ATP含量下降。

線粒體復(fù)合體V，即ATP合成酶是合成ATP的關(guān)鍵酶，也稱為 F1F0-ATP合成酶，在細(xì)胞內(nèi)催化能源物質(zhì)ATP的合成。在呼吸或光合作用過(guò)程中通過(guò)電子傳遞鏈釋放的能量先轉(zhuǎn)換為跨膜質(zhì)子（H+）梯度差，之后質(zhì)子流順質(zhì)子梯差通過(guò)ATP合酶可以使ADP、Pi合成ATP。ATP合酶主要由兩部分組成：水溶性的F1復(fù)合體與疏水跨膜部分F0，兩者都是轉(zhuǎn)動(dòng)馬達(dá)［7］。

線粒體中復(fù)合體V在細(xì)胞能量代謝中具有重要的作用，是參與細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵酶。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠線粒體內(nèi)復(fù)合體V活性顯著降低。一次性力竭運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷為中等強(qiáng)度，主要以有氧代謝形式為機(jī)體供能，線粒體內(nèi)氧化磷酸化反應(yīng)加強(qiáng)，線粒體電子傳遞過(guò)程中產(chǎn)生的自由基增多使線粒體受損，線粒體呼吸傳遞鏈?zhǔn)茏瑁瑥?fù)合體V活性降低。

線粒體作為細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的主要場(chǎng)所，調(diào)控運(yùn)動(dòng)中的能量代謝，其結(jié)構(gòu)和功能的正常是合成ATP的保障。1982年Davies［8］等人研究發(fā)現(xiàn)，在跑臺(tái)上大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭后其骨骼肌和肝臟勻漿以蘋果酸谷氨酸為底物和以琥珀酸為底物的RCR顯著降低。認(rèn)為其與自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)線粒體膜造成損傷使質(zhì)子滲漏增加有關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)后檢測(cè)線粒體呼吸功能下降，RCR值顯著降低，ST4值升高ST3無(wú)明顯變化而機(jī)體內(nèi)ROS生成顯著升高。

大量研究表明，線粒體呼吸傳遞鏈?zhǔn)羌?xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要位置，又易被過(guò)多自由基造成損傷，使呼吸鏈電子傳遞受阻，ATP合成減少，細(xì)胞的功能受到影響。氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致線粒體損傷，將導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合體失活，降低線粒體內(nèi)H+-ATPase合成活力，ATP合成減少，線粒體能量代謝受到抑制［10］。一次性力竭運(yùn)動(dòng)的長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)使線粒體有氧代謝增強(qiáng)，引起機(jī)體缺氧、能量被大量消耗，使機(jī)體內(nèi)發(fā)生一系列反應(yīng)，ROS的產(chǎn)生增多［11，12］。我們認(rèn)為可能是由于運(yùn)動(dòng)性疲勞狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)性內(nèi)源自由基及其引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化可能通過(guò)一系列作用途徑，使得氧化磷酸化脫偶聯(lián)，質(zhì)子漏增加，線粒體氧化磷酸化反應(yīng)減慢，線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，ATP合成減少，復(fù)合體V活性減弱，ROS生成增多，線粒體呼吸功能減弱，線粒體功能減弱。

PHB1是一個(gè)進(jìn)化高度保守的蛋白質(zhì)，在小鼠和大鼠中此蛋白的氨基酸序列完全相同，與人PHB1氨基酸序列也只相差一個(gè)氨基酸［13］。研究發(fā)現(xiàn)PHB1參與多種細(xì)胞活動(dòng) （細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、衰老、腫瘤抑制以及線粒體呼吸鏈復(fù)合體的裝配等）。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)人們一直認(rèn)為prohibitin主要位于核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)向調(diào)控功能［14］。有研究報(bào)道，線粒體PHB1可與線粒體DNA編碼的細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅱ（Cox2P）和亞基Ⅲ（Cox3P）直接作用，類似分子伴侶，增強(qiáng) Cox2P和Cox3P的穩(wěn)定性［15］；還有人在酵母中觀察到，phb1基因突變與線粒體形態(tài)維持相關(guān)基因（Mmm1p）或線粒體DNA保護(hù)相關(guān)基因（Mdm10p和Mdm12p）的突變同時(shí)存在時(shí)可導(dǎo)致合成致死性（synthetic lethality）［16］。諸多研究顯示，線粒體 PHB1與線粒體結(jié)構(gòu)與功能的維持密切相關(guān)。

2008年Schleicher M［17］等對(duì)血管系統(tǒng)中的PHB1功能進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)將PHB1的基因沉默后，會(huì)使線粒體氧化呼吸鏈中復(fù)合體I受到抑制，從而引起線粒體中ROS含量的增加，證明PHB是通過(guò)PI3K-Akt途徑調(diào)節(jié)Rac1激活，這一信號(hào)通路最終誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。Liu［18］等研究發(fā)現(xiàn)，PHB1在心肌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)可防止線粒體因過(guò)氧化氫誘導(dǎo)所致細(xì)胞損傷和死亡，并可維持線粒體膜的通透性。研究顯示，線粒體內(nèi)PHB1缺失可加快膜蛋白水解及損害線粒體呼吸鏈功能。由此可見(jiàn)，當(dāng)呼吸鏈功能發(fā)生障礙時(shí)，ROS產(chǎn)物增加導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，使線粒體形態(tài)及膜電位發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至疾病發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)PHB1的表達(dá)顯著降低，而心肌線粒體中PHB1的表達(dá)無(wú)顯著變化。經(jīng)過(guò)相關(guān)性分析得出一次性力竭運(yùn)動(dòng)后心、腦、骨骼肌線粒體PHB1的表達(dá)與ATP含量及復(fù)合體V活性呈正相關(guān)，而心、腦、骨骼肌線粒體PHB1的表達(dá)與腦、骨骼肌中ROS的生成呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明線粒體內(nèi)PHB1表達(dá)與ATP生成、線粒體內(nèi)復(fù)合體V活性及ROS的生成有密切關(guān)系。我們認(rèn)為PHB1降低程度與線粒體完整性和功能性破壞的程度密切相關(guān)。雖然我們目前并不清楚PHB1和線粒體的具體關(guān)系，以及PHB1在線粒體能量代謝中的主要作用，但線粒體能量代謝主要是依靠線粒體呼吸鏈中的氧化磷酸化反應(yīng)，而PHB1能與復(fù)合體V活性呈正相關(guān)，為我們進(jìn)一步研究PHB1能否與F0F1-ATP酶相互作用調(diào)控機(jī)體線粒體功能提供理論依據(jù)。探尋PHB1是否是調(diào)控線粒體能量代謝的相關(guān)靶點(diǎn)以及PHB1能夠調(diào)控線粒體功能的分子機(jī)制。

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Effects of exhaustive exercise on the expression of PHB1 and the function of mitochondria in rats

FANGWen1，2，LI Ze3，LIU Xiao-hua2，LIU Zhao-ming1，DUN Yi1，F(xiàn)ENG Hong1△
（1.Tianjin University of Sport，Tianjin Key Laboratory of Physiology，Tianjin 3000381；2.Institute of Health and Environmental Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300050；3.Beijing Chaoyang Emergency Rescue Center Combined with Traditional Chinese Medicine and Western Medicine，Beijing 100020，China）

Objective：To observe the changes of Prohibitin1（PHB1）contents in rat brain，heart，skeletal muscle tissue and mitochondria with acute exhaustive exercise and the effects of acute exhaustive exercise on mitochondrial function in rats，to explore the relationship among PHB1 and mitochondrial function and energy metabolism.Methods：Acute exhaustive exercise model：The rats carried acute exhaustive exercise after 8 weeks of feeding.The heart，brain and skeletal muscle samples were collected and the mitochondria were collected to detect the changes of respiratory function and reactive oxygen species（ROS）.The expression of PHB1 protein in tissues and mitochondria was detected by Western blot.The ATPcontent in the organs and the activity of complexes（ATP synthase activity）in mitochondria were measured by spectrophotometer.Results：① The ATPcontents of brain，myocardium and skeletal muscle were decreased significantly after acute exhaustive exercise.②The activities of complex V，respiratory control rates（RCR）and ROSin mitochondria of brain，myocardium and skeletal muscle were decreased significantly after acute exhaustive exercise，respiration rate state 4（ST4）was increased significantly，at the same time，respiration rate state3（ST3）had no significant difference.③ The expression of PHB1 in mitochondria of skeletal muscle was decreased significantly after acute exhaustive exercise，while there was no significant change in PHB1 in myocardial tissue and mitochondria.④ The correlation analysis showed that the ATP contents in the brain，myocardium and skeletal muscle were positively correlated with the activity of complex V and the expression of PHB1 after acute exhaustive exercise.Conclusion：After acute exhaustive exercise，the mitochondrial oxidative phosphorylation was reduced，the ROSproduction was increased，the expression of PHB1 was decreased，the ATPcontent and the activity of complex V were decreased in the brain and skeletal muscle of rats.Acute exhaustive exercise reduced the expression of PHB1 in mitochondria，decreased mitochondrial function，and reduced energy metabolism.

acute exhaustive exercise； tissue； mitochondria； mitochondrial respiratory function； PHB1：energy metabolism；rats

R339.4

A

1000-6834（2017）06-544-06

10.12047／j.cjap.5566.2017.129

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31470061）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14JCZDJC32700）

2017-02-15

2017-10-18

△【通訊作者】Tel：18622351885；E-mail：hong feng2009＠126.com