俞發(fā)榮，楊 博，李作平，連秀珍，謝明仁，李登樓，張詩爽

瑪咖提取物對運(yùn)動耐力和脊神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響*

俞發(fā)榮1，楊 博1，李作平2△，連秀珍1，謝明仁1，李登樓1，張詩爽1

（1.甘肅政法學(xué)院甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室，2.體育教學(xué)部，蘭州730070）

目的：探索瑪咖提取物對運(yùn)動耐力和脊神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響。方法：50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組。對照組：不進(jìn)行游泳，灌胃等量蒸餾水；單純游泳組：游泳，灌胃等量蒸餾水，瑪咖提取物組（設(shè)4.0，5.3，8.0 g／kg 3個劑量組）：游泳，給予相應(yīng)劑量的瑪咖提取物。游泳大鼠在游泳池內(nèi)循環(huán)水流自由游泳，連續(xù)游泳并給藥15 d，第16天游泳耐力測試后無痛處死大鼠，用投射電子顯微鏡觀察脊髓神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)，放免法測定肌肉肌糖元、檢測肌肉中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和游離鈣水平。結(jié)果：與單純游泳組比，沉下前游泳時間和游泳總時間分別延長了（%）19.83、60.28、77.55和 55.34、73.91、94.47，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；沉下次數(shù)分別減少了（%）34.35、51.18、57.96，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）；MDA和游離鈣含量分別降低了（%）20.10、31.49、38.72，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）和 6.42、17.58、26.35；SOD、GSH-Px和肌糖原含量分別升高了（%）5.12、22.74、52.53、44.22、77.79、98.45，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）和 35.08、47.83、81.88，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）；脊神經(jīng)元線粒體的體密度（Vd）、面密度（Sd）和數(shù)密度（Nd）分別減小了（%）7.79、18.18、31.17，16.95、27.34、43.31和 13.51、23.19、43.15。結(jié)論：瑪咖提取物具有保護(hù)脊髓神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)、抗氧化、增加肌糖原和提高運(yùn)動能力等作用。

瑪咖提取物；運(yùn)動耐力；線粒體；Wistar大鼠

瑪咖（Maca），十字花科（Brassicaceae）獨(dú)行菜屬（Lepidium）植物，是一種藥食兩用植物資源，營養(yǎng)成份豐富，有“南美人參”之譽(yù)。在中、南美洲國家、如厄瓜多爾、秘魯、墨西哥等國瑪咖作為民間藥物用于增強(qiáng)精力、提高生育力、緩解更年期綜合癥、抑郁癥、哮喘癥和促進(jìn)傷口愈合等。在美國、歐洲、日本、臺灣、澳大利亞等國際科學(xué)研究者也加快了對瑪咖化學(xué)成分、藥效藥理研究的步伐，每年都在不斷揭開產(chǎn)生瑪咖神奇功效的神秘面紗，這就給瑪咖具有獨(dú)特藥效的醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。為了探索瑪咖抗疲勞、增加運(yùn)動能力的機(jī)制，本文以Wistar大鼠為實驗對象，給予瑪咖提取物結(jié)合游泳，觀察瑪咖提取物對大鼠游泳時間、抗氧化作用、脊神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響，為研究運(yùn)動疲勞機(jī)制和瑪咖的開發(fā)利用積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

瑪咖提取物：稱取云南玉龍雪山產(chǎn)的瑪咖塊根500 g，加水 1500 ml，得煎液 900 ml，再隔水加熱濃縮為 200 ml（含生藥 2.5 g／ml），實驗時用蒸餾水稀釋成所需濃度。

實驗動物及實驗環(huán)境：SPF級 Wistar大鼠（雄性），體重180 g～190 g，購于甘肅省中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（甘）2011-0001。全部實驗均在甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室SPF級動物實驗室完成，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2015-0006。

試劑：MDA、SOD、GSH-Px、Free Ca2+試劑盒購于南京建成生物工程研究所（批號20150306），肌糖原檢測試劑盒購于江蘇晶美生物科技有限公司（20150507）。

儀器：酶聯(lián)免疫檢測儀，購于上海雷勃分析儀器有限公司（MULTISKAN MK3）；ZHJH-C1112B型雙人單面百級超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司。TEM-1200EX／s型投射電子顯微鏡，日本，JEOL公司。

1.2 動物分組

50只Wistar大鼠（雄性）采用抓鬮法隨機(jī)分組。對照組（C）：10只，正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行游泳，灌胃（ig）等量蒸餾水；單純游泳組（s）：10只，游泳，ig等量蒸餾水；瑪咖提取物組：30只［按瑪咖最大耐受量（320 g／kg體重）的 1／40、1／60、1／80給藥量分為低劑量組（ML）10只、中劑量組（MM）10只、高劑量組（MH）10只］：游泳，分別 ig瑪咖提取物 4.0、5.3、8.0 g／kg體重。每天1次，連續(xù)15 d。

1.3 游泳訓(xùn)練實驗

游泳組動物每天游泳1次，游泳水速0.8 m／s，水溫22～24℃。首次游泳30 min，每天遞增5 min，連續(xù)游泳15 d。

1.4 游泳耐力測試

實驗第16天，進(jìn)行游泳耐力測試。為了縮短測試時間，每只大鼠尾部負(fù)重10 g砝碼進(jìn)行游泳，以動物沉入水下停留10 s為止。

1.5 肌肉 MDA、SOD、GSH-Px測定

實驗第16天，乙醚吸入無痛死亡，剝?nèi)∽笥液笾伤念^肌，置于冰冷生理鹽水中洗凈血液，用濾紙吸干，置于EP管內(nèi)，放于-80℃低溫冰箱內(nèi)冷藏，備用。稱取肌肉120 mg，放入盛有冰冷生理鹽水的燒杯內(nèi)，用眼科剪碎肌肉組織，倒入玻璃勻漿管中，充分研碎，使組織勻漿化，將勻漿放入低溫低速離心機(jī)2 000 r／min，離心15 min。將離心好的勻漿取上清液于Eppendorf管中，以丙二醛（MDA）含量作為LPO水平指標(biāo)。分別按 MDA、SOD、GSH-Px試劑盒操作說明測定其含量。

1.6 肌糖原測定

取肌肉120 mg，剪碎肌肉組織，加緩沖液（210 mmol／L蔗糖，2 mmol／L EGTA，40 mmol／L NaCl，30 mmol／L hpes，pH 7.4，蛋白酶抑制劑）3 ml，置試管內(nèi)冰水浴中，用玻璃勻漿器制成勻漿，3 000 r／min離心5 min，取上清液1 ml加入試管中，放于-80℃低溫冰箱內(nèi)冷藏，備用。按肌糖原試劑盒操作說明測定其含量。

1.7 脊神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)測定

剝?nèi)〈笫蠹顾柩虼蠖畏湃牒?%多聚甲醛-1.25%戊二醛 0.1 mol／L磷酸緩沖液（pH 7.4）固定液固定24 h，切片，經(jīng)鋨化，梯度酒精脫水，Epon812平板包埋，超薄切片，經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，TEM-1200EX／s型透射電鏡觀察照相。采用Weibel點(diǎn)計數(shù)法，計算脊髓運(yùn)動神經(jīng)元線粒體的體密度（volume density，Vd）：

注：體密度（Vd），是單位細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體所占的體積；pxi為第i張照片中待測線粒體內(nèi)的測試點(diǎn)數(shù)；pri為i張照片中參照系的測試點(diǎn)數(shù)。

數(shù)密度（numeral density，Nd）：

注：數(shù)密度（Nd），是單位胞質(zhì)體積中線粒體的數(shù)目；K為大小分布系數(shù)；NA是線粒體截面數(shù)目和細(xì)胞質(zhì)截面面積的比值。

面密度（superficial density，Sd）：

注：面密度（Sd），是單位胞質(zhì)體積中線粒體外膜面積的數(shù)量；Ix是線粒體外膜截線與測試線的交點(diǎn)數(shù)Pr是參照系平面內(nèi)的測試點(diǎn)數(shù)Z是測試格中一個測試點(diǎn)所代表的測試線長。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理?，斂崛∥飳τ斡敬笫笊碇笜?biāo)的影響用單因素方差分析（one way，ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 瑪咖提取物對大鼠游泳時間的影響

游泳耐力實驗結(jié)果表明，分別ig瑪咖提取物4.0、5.3、8.0 g／kg體重，沉下前游泳時間比單純游泳組分別延長了 19.83%、60.28%、77.55%，游泳總時間分別延長了 55.34%、73.91%、94.47%，隨給藥劑量的增加而延長；沉下次數(shù)比單純游泳組分別減少了34.35%、51.18%、57.96%，隨給藥劑量的增加而減少；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01，表1）。

Tab.1 Effects of the maca extract on swimming time of rats（ˉx±s，n＝10）

2.2 瑪咖提取物對游泳大鼠肌肉 MDA、SOD、GSH-Px、游離鈣和肌糖原水平的影響

分別 ig瑪咖提取物 4.0、5.3、8.0 g／kg體重，游泳耐力檢測，大鼠肌肉MDA含量比單純游泳組分別降低了 20.10%、31.49%、38.72%，游離鈣分別降低了6.42%、17.58%、26.35%；隨給藥劑量的增加而降低；大鼠肌肉 SOD含量分別升高了 5.12%，22.74%、52.53%；GSH-px分別升高了 44.22%，77.79%、98.45%，肌糖原分別升高了 35.08%、47.83%、81.88%，隨給藥劑量的增加而升高；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01，表2）。

Tab.2 Effects of maca extract on the levels of muscle MDA，SOD，GSH-Px，Ca2+and muscle glycogen in swimming rat（ˉx±s，n＝10）

2.3 瑪咖提取物對大鼠脊神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

分別 ig瑪咖提取物 4.0、5.3、8.0 g／kg體重，游泳耐力檢測，大鼠脊神經(jīng)元線粒體的體密度（Vd）比單純游泳組分別減小了 7.79%、18.18%、31.17%，面密度（Sd）分別減小了 16.95%、27.34%、43.31%，數(shù)密度（Nd）分別減小了 13.51%、23.19%、43.15%，隨給藥劑量的增加而減??；游泳組大鼠脊神經(jīng)元線粒體的各項參數(shù)均大于對照組；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 ＜0.01，表 3）。

3 討論

適量的體育運(yùn)動對人們的身心健康是有益的［1］，耐力訓(xùn)練能使機(jī)體抗氧化酶和線粒體產(chǎn)生適應(yīng)性變化［2］，降低心肌凋亡水平［3］，增強(qiáng)主動脈血管抗炎能力，從而發(fā)揮抗疲勞的作用［4］，緩減衰老骨骼肌的氧化應(yīng)激［5］。過度運(yùn)動將引起心臟生物電改變［6］，誘發(fā)心肌損傷［7］，引起肌肉運(yùn)動能力下降，導(dǎo)致運(yùn)動性疲勞。近年來，研究人員從不同的角度對運(yùn)動性疲勞進(jìn)行了大量的實驗研究，提出運(yùn)動應(yīng)激性代謝產(chǎn)物是運(yùn)動性疲勞發(fā)生的根本原因之一［8］。如脂質(zhì)過氧化（LPO）水平增高使代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）［9］和 Ca2+［10］的堆積，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性下降，能源物質(zhì)減少［11］，神經(jīng)系統(tǒng)［12］、心血管系統(tǒng)［13］功能的改變，導(dǎo)致運(yùn)動肌肉收縮和舒張功能障礙、運(yùn)動能力下降，即發(fā)生疲勞。為了尋求抗疲勞藥物，將參杞制劑［14］或杜仲多糖［15］給予游泳小鼠，均能明顯提高肝糖原、肝臟SOD和GSH-Px含量，延長小鼠力竭游泳時間，并具有較強(qiáng)的抗疲勞與抗氧化作用。張靜等［16］將瑪咖粉給予訓(xùn)練小鼠，顯著緩解了疲勞，延長了小鼠爬桿的時間（p＜0.01）和力竭游泳時間（p＜0.01）［17］。本文實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動，使骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化（LPO）水平增高，LPO不僅調(diào)節(jié)Ca2+-ATP酶產(chǎn)生影響，造成細(xì)胞漿中Ca2+的堆積，影響骨骼肌纖維的興奮收縮偶聯(lián)；骨骼肌MDA含量升高，使SOD、GSH-Px活性降低，脊神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化甚至損傷，影響線粒體呼吸鏈ATP的釋放，導(dǎo)致骨骼肌肉的工作能力下降而產(chǎn)生疲勞。給予瑪咖提取物游泳組大鼠骨骼肌MDA和游離鈣明顯降低，骨骼肌糖原含量、SOD和GSH-Px活性明顯升高，大鼠脊神經(jīng)元線粒體參數(shù)明顯改善，運(yùn)動耐力顯著增強(qiáng)。實驗結(jié)果提示，瑪咖提取物能降低骨骼肌MDA的生成，提高骨骼肌SOD、GSH-Px活性，保護(hù)脊神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)和增強(qiáng)運(yùn)動能力的作用。實驗結(jié)果為進(jìn)一步研究探索運(yùn)動疲勞機(jī)制提供了參考依據(jù)。

Tab.3 Effects of maca extract on mitochondrial ultrastructure of rat spinal nerve cells（ˉx±s，n＝10）

［1］ 郭 峰.長期練習(xí)太極拳對老年人自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2015，31（2）：158-163.

［2］ 劉紹東，張彥秋，曹 江.有氧耐力訓(xùn)練對大鼠骨骼肌線粒體功能及PI3K-Akt蛋白的表達(dá)影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（1）：55-58.

［3］ 趙永才.運(yùn)動訓(xùn)練對小鼠心肌線粒體miR-499-CaNDrp-1凋亡通路的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2015，31（3）：259-263.

［4］ 劉善云，王 敏，張洪俠，等.耐力訓(xùn)練對ApoE致AS小鼠IL-18和IL-10表達(dá)的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（3）：225-228.

［5］ 付紹婷，邱守濤，李 茜，等.不同強(qiáng)度耐力訓(xùn)練對衰老小鼠骨骼肌線粒體抗氧化及生物發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2014，33（11）：1069-1074.

［6］ 徐 鵬，康 亭，劉海燕，等.力竭運(yùn)動后不同時相大鼠心電圖、心功能變化及Nrf2的作用［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（2）：146-151.

［7］ 鄭嫵媚，初海平，王 燕，等.力竭運(yùn)動后不同時相大鼠心肌 p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表達(dá)的動態(tài)變化［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（1）：88-91.

［8］ Aydin C，Ince E，Koparan S.Protective effects of long term dietary restriction on swimming exercise-induced oxidative stress in the liver，heart and kidney of rat［J］.Cell Biochem Funct，2007，25（2）：129-137.

［9］ Xu J，Zhao QS，Qu YY，et al.Antioxidant activity and antiexercise-fatigue effect of highly denatured soybean meal hydrolysate prepared using neutrase［J］.J Food Sci Technol，2015，52（4）：1982-1992.

［10］Vargas NT，Marino F.A neuroinflammatory model for acute fatigue during exercise［J］.Sports Med，2014，44（11）：1479-1487.

［11］Yeh TS，Chuang HL，Huang WC，et al.Astragalus membranaceus improves exercise performance and ameliorates exercise-induced fatigue in trained mice［J］.Molecules，2014，19（3）：2793-2807.

［12］李 策，李瑩瑩，張 備，等.強(qiáng)制性運(yùn)動訓(xùn)練對腦缺血大鼠海馬新生神經(jīng)細(xì)胞存活的影響［J］.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2015，34（9）：875-880.

［13］常 蕓，楊紅霞，王 菲.力竭運(yùn)動對大鼠心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)ICAM-1的影響［J］.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2015，34（4）：334-340.

［14］裴素萍，崔 征，彭 程，等.參杞制劑對小鼠抗疲勞和抗氧化作用研究［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2014，30（2）：132-135.

［15］王一民，郭 飛，熊 勃，等.杜仲多糖改善運(yùn)動疲勞的研究［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（2）：151-153.

［16］張 靜，李 慧，周 雯，等.瑪咖粉對小鼠的抗疲勞作用及其機(jī)制研究［J］.衛(wèi)生研究，2013，42（6）：1046-1049.

［17］陳 成，邱明鴻，馬云淑，等.瑪咖提取物對小鼠運(yùn)動性疲勞的作用研究［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2014，35（9）：63-66.

Effects of the maca extract on the ultrastructures of mitochondria in the spinal nerve cell and exercise endurance

YU Fa-rong1，YANGBo1，LI Zuo-ping2△，LIAN Xiu-zhen1，XIE Ming-ren1，LI Deng-lou1，ZHANG Shi-shuang1
（1.Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application，2.Department of Physical Education，Gansu Institute of Political Science and Law，Lanzhou 730070，China）

Objective：To investigate the effects of maca extract on the ultrastructures of mitochondria in the spinal nerve cell and exercise endurance.Methods：The Wistar rats were randomly divided into 5 groups，including the control group（no swimming），the swimming group（free swimming），and 3 treatment groups treated with the maca extract at the doses of 4.0，5.3 and 8.0 g／kg body weight.The animals in swimming and treatment groups were then for free swimming in the circulating water flow daily for 15 days.On the 16thday after swimming endurance，the spinal and muscular tissues were collected from all groups.The mitochondrial ultrastructures of the neurons of the spinal cells wereobserved with the projection electron microscope，and the levels of the glycogen，malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），and Ca2+in muscle tissues were determined by the RIA method.Results：When rats were treated with maca extract（at 4.0，5.3，8.0 g／kg body weight），the total swimming time and the swimming duration before sinking were increased by 19.83%，60.28%，77.55%，and 55.34%，73.91%，94.47%，respectively，compared with the simple swimming group（p＜0.01），while the sinking times were decreased by 34.35%，51.18%and 57.96%，compared with those of the swimming group.Also，the levels of SOD，GSH-Px，and muscle glycogen in three treatment groups were enhanced by 5.12%，22.74%，52.53%，44.22%，77.79%，98.45%（p＜0.01），and 35.08%，47.83%，81.88% （p＜0.01）respectively over the swimming rats without treatment，but the MDA content and the Ca2+levels were reduced by 20.10%，31.49%38.72%，and 6.42%，17.58%，26.35%，compared with the simple swimming group（p＜0.01）.In addition，compared to the swimming group，the mitochondrial densities of volume（Vd），surface（Sd）and numbers（Nd）of spinal nerve cells in rats treated with maca extract（4.0，5.3，8.0 g／kg body weight）were reduced by 7.79%，18.18%，31.17%，16.95%，27.34%，43.31%and 13.51%，23.19%，43.15%，respectively.Conclusion：Our results demonstrated the protective effects of maca extract on the mitochondria of spinal cell and suggested that maca extract could improve the muscle antioxidant activity by increasing the levels of SOD，GSH-Px，and muscle glycogen.

maca extract； movement endurance； mitochondria； Wistar rats

Q95.33

A

1000-6834（2017）06-535-05

10.12047／j.cjap.5481.2017.127

甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項目（145RJIA333）；蘭州市科技計劃項目（2014-1-182；2015-3-80）；甘肅省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊項目（2016C-09）；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2016-RC-85）；西北民族地區(qū)偵查理論與實務(wù)研究中心項目；甘肅政法學(xué)院重大項目（2016XZD15）；甘肅政法學(xué)院 “文翰學(xué)者”項目

2016-07-28

2017-05-15

△【通訊作者】Tel：18189651683；E-mail：tim9898＠163.com