王紅磊，肖 奕，武 力，馬大昌

miR-449a對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖及遷移能力的影響*

王紅磊，肖 奕，武 力△，馬大昌

（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院乳腺科，甘肅蘭州730000）

目的：通過敲低微小RNA（microRNA，miRNA）-449a的方法研究miR-449a對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖和遷移能力的影響。方法：采用miRNA芯片在乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A篩選具有表達(dá)差異的miRNA；化學(xué)合成法制備miR-449a的抑制劑（inhibitor），轉(zhuǎn)染后經(jīng)real-time PCR驗(yàn)證表達(dá)的變化；細(xì)胞增殖CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲的改變；蛋白免疫印跡法（Western blot）實(shí)驗(yàn)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的β-catenin和E-cadherin蛋白進(jìn)行檢測(cè)；通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-449a潛在靶基因?yàn)镹otch 1，熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Notch 1是miR-449a的靶基因。結(jié)果：分別收集MCF-7和MCF-10A細(xì)胞，芯片結(jié)果顯示miR-449a在MCF-7細(xì)胞的表達(dá)水平顯著高于MCF-10A；本研究將細(xì)胞分為未處理組（Mock組），陰性對(duì)照組（negative control組，NC組）和處理組，通過收集不同組MCF-7細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，CCK-8結(jié)果顯示miR-449a下調(diào)后MCF-7細(xì)胞增殖能力顯著降低；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-449a表達(dá)降低導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低；transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞侵襲受到抑制；Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-449a敲低后β-catenin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)增加；熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-449a能夠顯著降低Notch 1-3’-UTR質(zhì)粒的熒光素活性（p＜0.01）。結(jié)論：在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中敲低miR-449a能夠顯著抑制癌細(xì)胞增殖和遷移，而這一變化可能通過降低Notch 1蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

miR-449a；人乳腺癌MCF-7細(xì)胞；Notch1；增殖；遷移

乳腺癌是當(dāng)前女性群體中最常見的癌癥，并且在發(fā)展中國(guó)家乳腺癌在由癌癥引起女性死亡的疾病中居于第二位［1］。即使目前治療方法不斷進(jìn)步，但是乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍然處于上升態(tài)勢(shì)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尋找乳腺癌的治療分子靶點(diǎn)已成為當(dāng)前熱點(diǎn)。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一種長(zhǎng)度在17～22nt的非編碼單鏈RNA，主要從轉(zhuǎn)錄后的水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA的表達(dá)異常常見于人類惡性腫瘤，如肝癌［2］、結(jié)直腸癌［3］和乳腺癌［4］等。有研究發(fā)現(xiàn) miR-449a與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如肺癌［5］、肝癌［6］等。以往的研究發(fā)現(xiàn)，miR-449a在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的表達(dá)也是升高的［7］，并且能夠通過靶向調(diào)節(jié)CRIP2蛋白的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用。缺口同源基因1（Notch homolog 1，Notch 1）在乳腺癌中高表達(dá)，并且與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相管，Notch 1的高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)乳腺癌的惡性改變［8］。本實(shí)驗(yàn)在分子層面探究了miR-449a與乳腺癌的關(guān)系，尋求分子水平調(diào)控乳腺癌發(fā)展的新的生物標(biāo)志物，為臨床乳腺癌的診斷和治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞株MCF-7、MCF-10A均由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 主要試劑

ChiP（Chromatin Immunoprecipiation）檢測(cè)試劑盒、Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自 Invitrogen公司，方法參見產(chǎn)品說明書；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；Transwell小室及Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；miR-449a引物由北京華大基因公司合成，miR-449a inhibitor購(gòu)自蘇州吉瑪生物科技公司，Notch 1過表達(dá)質(zhì)粒由蘇州吉瑪公司合成；SYBR Green PCR Master Mix試劑購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白提取試劑和、SDS-PAGE凝膠配制試劑和DAB顯影液均購(gòu)自碧云天公司；β-catenin及E-cadherin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，二抗均購(gòu)自中杉金橋生物公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1 000 U／ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置在37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，定期（一般2～3 d）更換培養(yǎng)液，當(dāng)鏡下觀察細(xì)胞的融合度大于80%后用胰蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)皿消化，然后進(jìn)行傳代操作。

1.4 轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞

在miR-449a inhibitor轉(zhuǎn)染前一天把生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 MCF-7細(xì)胞鋪24孔板，將每孔細(xì)胞密度在50%時(shí)按照Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，并且將細(xì)胞分為未處理組（Mock組），陰性對(duì)照組（negative control組，NC組）和 miR-449a inhibitor組，NC轉(zhuǎn)染 miR-449a inhibitor negative control（由試劑公司提供），轉(zhuǎn)染后可采用real-time PCR檢測(cè)抑制效果。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后6 h更換新的培養(yǎng)基，使細(xì)胞保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。Notch 1過表達(dá)質(zhì)粒或者對(duì)照用空質(zhì)粒，各100 pmol／L轉(zhuǎn)染24 h后，提取總RNA或者蛋白，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

1.5 real-time PCR檢測(cè)miR-449a表達(dá)

用Trizol對(duì)各組細(xì)胞的總RNA進(jìn)行提取，然后經(jīng)一步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，步驟：42℃反應(yīng)30 min，85℃反應(yīng)5 s，4℃反應(yīng)30 min。采用real-time PCR檢測(cè)miR-449a的水平，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，然后依次 95℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共擴(kuò)增循環(huán)35次，最后72℃延伸6 min。所涉及引物序列見表1。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將100μl不同組的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入96孔版中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁?？刂萍?xì)胞鋪板的密度約為2×103cells／welll，并且嚴(yán)格控制細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)孔做4個(gè)重復(fù)。每孔加入10μl的CCK-8試劑，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，取出后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞鋪入六孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)即可進(jìn)行劃痕操作。用已經(jīng)滅菌的黃色槍頭垂直并且均勻的在六孔板的皿底（細(xì)胞表面）畫三條直線，將培養(yǎng)基移除，用 PBS輕洗一遍，加入新的無血清培養(yǎng)基。拍照并且記錄位置，此處為0 h的劃痕。24 h后再次拍照，拍照前更換無血清培養(yǎng)基，觀察劃痕愈合情況，采用Image J軟件對(duì)愈合率進(jìn)行計(jì)算。

Tab.1 Primer sequences of the genes for real-time PCR

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將Matrigel用無血清的DMEM培養(yǎng)按照1∶3的比例稀釋，24 h后方可使用。使用時(shí)每個(gè)預(yù)冷后的小室內(nèi)加入40μl，把轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞調(diào)至1×105cells／ml，使用100μl無血清 DMEM培養(yǎng)基懸起細(xì)胞后加入小室的上層，小室的下層加入600μl的含5%胎牛血清的培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染用的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用70%的甲醇固定每個(gè)小室，用棉簽輕輕擦去小室上層貼膜細(xì)胞，用4%結(jié)晶紫染色，把小室的底層膜取下于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并記錄細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.9 Western blot

將不同組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染操作24 h后去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的PBS洗滌后再加入10μl的細(xì)胞裂解液RIPA，靜止10 min后提取蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳操作。蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜后使用牛奶封閉，加入一抗，靜止4℃過夜，用洗去一抗后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗孵育，1 h后可用DAB顯影并拍照。

1.1 0 熒光素酶試驗(yàn)

設(shè)計(jì)并合成 Notch 1-3’-UTR的序列及突變序列，把Notch 1質(zhì)粒作為載體，分別構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的分別包含野生型Notch 1-3’-UTR和Notch 1-3’-UTR突變序列的質(zhì)粒，將MCF-7細(xì)胞按每孔1×105cells接種至24孔板，24 h后Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染200 ng包含 Notch 1-3’-UTR野生型或 NOTCH1-3’-UTR突變序列的熒光素酶質(zhì)粒和80 ng海腎熒光質(zhì)粒以及60 pmol／L miR-449a inhibitor或?qū)φ眨?8 h后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，內(nèi)參為海腎熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.1 1 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-449a在MCF-7與MCF-10A細(xì)胞中表達(dá)水平的比較

通過miRNA芯片分析實(shí)驗(yàn)，與人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A對(duì)比發(fā)現(xiàn)，有6個(gè)miRNA在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)：miR-449a、miR-371、miR-34a、miR-500、miR-338、miR-483，4個(gè) miRNA出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)：miR-101、miR-145、miR-18a、miR-134，差異均具有顯著意義（p＜0.05，圖 1）。real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示 MCF-7細(xì)胞內(nèi) miR-449a水平顯著高于MCF-10A細(xì)胞內(nèi)差異具有顯著意義（p＜0.05，表2）。

Fig.1 MicroRNA chips show the significant upregulation of miR-449a in MCF-7 cells compared with MCF-10A（p＜0.05）

Tab.2 The expression of miR-449a detected by real-time PCR（ˉx±s，n＝3）

2.2 miR—449a表達(dá)水平對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)將miR-449a inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，采用real-time PCR檢測(cè)Mock組、陰性對(duì)照組（Negative control，NC）和 miR-449a inhibitor組的 miR-449a表達(dá)水平，結(jié)果顯示 inhibitor組（0.39±0.04）對(duì)比NC組（0.97±0.03），miR-449a表達(dá)水平顯著降低（p＜0.05），而 Mock組（1.01±0.02）的 miR-449a水平與NC組并無顯著差異（圖2）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-449a inhibitor組細(xì)胞的增殖能力顯著低于NC組（p＜0.05），而 NC組的 miR-449a水平與 Mock組的細(xì)胞增殖無顯著差異。具體結(jié)果見圖3，表明miR-449a可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖。

Fig.2 Expression of miR-449a in MCF-7 transfected with inhibitor（ˉx±s，n＝3）NC：Negative control*p＜0.05 vs NCgroup

Fig.3 Change of the proliferation on MCF-7 cells affected by miR-449a inhibitor（ˉx±s，n＝4）NC：Negative control*p＜0.05 vs NCgroup

2.3 轉(zhuǎn)染miR-449a inhibitor對(duì)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-449a inhibitor后，細(xì)胞劃痕的愈合率（35.6±6.1）顯著低于 NC組（77.4±5.4，p＜0.05），Mock組（73.5±4.1）與 NC組之間并沒有顯著差異（圖 4）；transwell小室結(jié)果表明miR-449a的表達(dá)受到抑制后，inhibitor組 MCF-7細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)（21.0±4.6）顯著少于 NC組（46.0±6.3，p＜0.05）。而 Mock組（43.0±4.9）與 NC組之間無顯著差異。具體結(jié)果見圖5，表明乳腺細(xì)胞高表達(dá)miR-449a可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的轉(zhuǎn)移與侵襲。

2.4 Western blot檢測(cè)miR-449a表達(dá)受抑制后蛋白變化

在轉(zhuǎn)染miR-449a inhibitor抑制細(xì)胞的增殖和遷移后，通過Western blot試驗(yàn)檢測(cè)β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與NC組相比miR-449a inhibitor組的β-catenin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高（圖6），表明實(shí)現(xiàn)miR-449a表達(dá)降低抑制MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移的可能途徑之一，是調(diào)節(jié)β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)。

Fig.4 Change of the migration on MCF-7 cells affected by miR-449a inhibitor（ˉx±s，n＝3）NC：Negative control*p＜0.05 vs NCgroup

Fig.5 Change of the invasion on MCF-7 cells affected by miR-449a inhibitor（ˉx±s，n＝3）NC：Negative control*p＜0.05 vs NC group

2.5 抑制miR-449a表達(dá)后對(duì)Notch 1的表達(dá)影響

分別構(gòu)建Notch 1-3’-UTR和其突變序列的熒光素酶質(zhì)粒（圖7A），與miR-449a inhibitor或者對(duì)照空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各組內(nèi)的細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-449a inhibitor+WT-SOX4-3’-UTR組熒光素酶活性顯著低于空質(zhì)粒 +WT-SOX4-3’-UTR組（p＜0.01，圖 7B）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-449a inhibitor組MCF-7細(xì)胞中Notch1的表達(dá)明顯降低（p＜0.01，圖7C）。

Fig.6 Expressions ofβ-catenin and E-cadherin detected by Western blot（ˉx±s，n＝3）NC：Negative control*p＜0.05

Fig.7 Knockdown of miR-449a inhibited SOX4 expression by targeting 3’-UTR（ˉx±s，n＝3）A：The predictable binding site between miR-449a and Notch 1，date was shown；B：Inhibition of miR-449a inhibited the luciferase activity in the Notch 1 with WT binding sites 3’UTR，whereas，luciferase activity was not decreased in the MUT binding sites 3’UTR of Notch 1 mRNA；C，D：Western blot analyzes were used to detect the expression levels of Notch 1 after miR-449a inhibitor or negative control was transfected in MCF-7 cells；WT：Wild type；MUT：Mutant；LUC：Luciferase；NC：Negative control*p＜0.05 vs NC

3 討論

由于乳腺癌的高死亡率和高轉(zhuǎn)移率，對(duì)于尋找能夠用于乳腺癌早期的診斷和治療的分子靶標(biāo)變得越來越迫切。大量的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過影響腫瘤細(xì)胞的癌基因和抑癌基因而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展發(fā)生調(diào)控作用［9，10］。因此，miRNA被人們認(rèn)為是新的具有潛在診斷和治療癌癥的目標(biāo)分子［11］。已有的研究發(fā)現(xiàn)miRNA常與人類多種腫瘤染色體的不穩(wěn)定性和擴(kuò)增有關(guān)。至今許多miRNA都已經(jīng)被證實(shí)與乳腺的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，例如miR-32能夠通過靶向調(diào)節(jié)研究 F框／WD-40域蛋白7（FBXW7），從而促進(jìn)乳腺癌的增殖和遷移并且抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡［12］。miR-590-5p能夠靶向作用于 SOX2基因，使乳腺癌細(xì)胞的多能性受到抑制，并且癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也受到抑制，表明miR-590-5p可能是治療乳腺癌的一個(gè)途徑［13］。另外，miR-21通過與DNA的甲基化互相調(diào)節(jié)，影響不同類型的乳腺癌的發(fā)展［14］。這些研究均表明，針對(duì)乳腺癌相關(guān)miRNA的研究將是乳腺癌的診斷和治療的一個(gè)重要方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，多種 miRNA在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)出現(xiàn)異常，其中miR-449a在人的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中的表達(dá)顯著高于人的正常乳腺細(xì)胞MCF-10A。之前的研究也發(fā)現(xiàn)miR-449a在肺癌［5，15］、肝癌［16］和結(jié)直腸癌［17］中的表達(dá)水平增加，參與這些癌癥不同的發(fā)展階段。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明抑制miR-449a的表達(dá)的同時(shí)細(xì)胞的增殖能力也受到抑制，提示 miR-449a的表達(dá)異常參與MCF-7細(xì)胞的增殖過程中，miR-449a的表達(dá)異常可能與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。已有的研究發(fā)現(xiàn)，miR-449a與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān)，如miR-449a能夠通過抑制人絲裂原激活蛋白激酶1（MAP2K1）而使肺癌細(xì)胞的侵襲受阻。為了進(jìn)一步研究miR-449a在乳腺癌細(xì)胞中的功能，本研究在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染其抑制劑后，又采用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-449a被下調(diào)后，MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力均下降，這一結(jié)果說明miR-449a可能具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的功能。在細(xì)胞表型改變的基礎(chǔ)上，又檢測(cè)β-catenin和 E-cadherin在 MCF-7細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均受到miR-449a細(xì)胞的影響而出現(xiàn)表達(dá)變化，說明miR-449a在蛋白水平也對(duì)細(xì)胞的增殖和遷移發(fā)揮調(diào)控功能。這些結(jié)果都說明miR-449a在乳腺癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中扮演重要角色。

Notch 1基因使一種較為保守的單次跨膜蛋白，參與細(xì)胞的發(fā)育、分化和調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，通過激活Notch1信號(hào)通路，可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激有關(guān)的生理活動(dòng)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用［18］。Notch 1在不同的腫瘤中具有不同的作用，在同一種腫瘤中的不同階段其還可以發(fā)揮不同的調(diào)控作用［19］。以往的研究證明Notch 1作為癌基因在其信號(hào)通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而在肺癌中Notch 1又具有抑癌基因的作用［20］。本實(shí)驗(yàn)通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch 1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)受到miR-449a的調(diào)節(jié)，從而參與乳腺癌細(xì)胞的發(fā)展過程。

以往的部分研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤臨床病例特征密切相關(guān)［21］。本實(shí)驗(yàn)通過乳腺癌細(xì)胞基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-449a的高表達(dá)，并且被敲低后抑制乳腺細(xì)胞的增殖和遷移，說明miR-449a具有潛在的作為輔助診斷和治療乳腺癌的分子靶點(diǎn)。通過設(shè)計(jì)miRNA的分子抑制劑，可以特異性的抑制某些對(duì)腫瘤具有調(diào)節(jié)作用的基因表達(dá)，這對(duì)腫瘤的臨床治療具有重要意義和應(yīng)用前景。

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Effects of miR-449a on proliferation and migration of human breast cancer cell line MCF-7

WANG Hong-lei，XIAOYi，WU Li△，MA Da-chang
（Galactophore Department，the First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

Objective：To study the effects of knockdown of miR-449a on the proliferation and migration of human breast cancer cell line Michigan Cancer Foundation-7（MCF-7）.Methods：Using miRNA chip screening of the differential expressions of miRNA in human breast cancer cell MCF-7 and normal breast cells MCF-10A.The inhibitor of miR-449a was synthesized by chemical and detected by real-time PCR after transfection aimed to verify the expression.Cell Counting Kit-8（CCK-8）assay was used to detect the ability of cell proliferation after transfection with miR-449a inhibitor.Scratch assay was used to detect cell migration of MCF-7，and cell invasion ability was showed by transwell assay；The MCF-7 cell proliferation and migration related proteins，β-catenin and E-cadherin，were detected by Western blot.The potential target gene of miR-449a was predicted by bioinformatics software，and Notch homolog1（Notch 1）was proved to be the target gene of miR-449a by luciferase assay.Results：MCF-7 and MCF-10a cells were collected separately，and miRNA chip results showed that the level of miR-449a in MCF-7 cells was significantly higher than that of MCF-10A.In this study，the cells were divided into mock group，negative control group（NCgroup）and treatment group，the MCF-7 cells were collected before and after treatment and CCK-8 results showed that knockdown of miR-449a decreased MCF-7 cell proliferation ability significantly.Scratch assay results showed that downregulated miR-449a was related to the decreased metastasis of MCF-7 cells.Transwell results showed that knockdown of miR-449a inhibited the invasion of MCF-7 cells.Western blot showed the expression ofβ-catenin was decreased and the expression of E-cadherin was increased after knockdown of miR-449a.Luciferase assay showed that miR-449a could significantly decrease the luciferase activity of Notch homolog 1-untranslated region（Notch 1-3’-UTR）plasmid（p＜0.01）.Conclusion：Inhibition of miR-449a in breast cancer cell line MCF-7 can significantly inhibit the proliferation and migration of cancer cells，which may be achieved by decreasing the expression of Notch 1 protein.

miR-449a； human breast cancer cell line MCF-7； proliferation； migration

R737.9

A

1000-6834（2017）06-508-06

10.12047／j.cjap.5573.2017.121

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011Y0163）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012V0633）

2017-02-27

2017-10-18

△【通訊作者】Tel：15117273573；E-mail：wuligslz＠163.com