王新慧 李 偉 張燕蕓 呂麗靜 曲曉蘭

(泰山醫(yī)學院藥學院,山東 泰安 271016)

Box-Behnken效應面法優(yōu)化泰山紫草中總萘醌提取工藝

王新慧 李 偉 張燕蕓 呂麗靜 曲曉蘭

(泰山醫(yī)學院藥學院,山東 泰安 271016)

目的 優(yōu)選泰山紫草總萘醌的提取工藝。方法 在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken效應面法，以總萘醌的提取率為指標，考察乙醇體積分數、提取時間、料液比等的影響，利用紫外分光光度計測定總萘醌的含量。結果 確定泰山紫草中總萘醌的最佳工藝為：乙醇體積分數80%，提取時間30 min，料液比1∶18，提取2次，總萘醌的提取率為3.384%。結論 Box-Behnken效應面法用于泰山紫草中總萘醌提取工藝條件的優(yōu)選是可行的，模型預測效果較好。

泰山紫草；總萘醌；Box-Behnken效應面法；提取工藝

泰山紫草為泰山“四大名藥”之一，為紫草科植物紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc.)的干燥根，具有活血、涼血、清熱解毒、消炎殺菌等功效[1]。紫草藥理作用廣泛, 具有抗炎抗菌、抗腫瘤、抗艾滋病、抗炎、保護肝臟、抗氧化、降血糖、改善微循環(huán)系統(tǒng)功能等作用[2]。萘醌類化合物是泰山紫草主要有效成分之一, 易溶于氯仿、石油醚,可溶于乙醇,微溶于水，對熱不穩(wěn)定[3]。綜合考慮各方面因素,本實驗采用超聲法提取泰山紫草中總萘醌類成分，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken效應面法，優(yōu)化泰山紫草總萘醌的提取工藝，為泰山紫草中總萘醌的提取工藝提供技術參數。

1 儀器與試劑

KQ-5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2550型紫外—可見分光光度計(日本島津)；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；FC-104電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司)。泰山紫草(購自于泰山四大名藥開發(fā)有限公司),經泰山醫(yī)學院藥學院蘇延友教授鑒定為為紫草科植物紫草的干燥根。左旋紫草素對照品(批號110769-200405，中國藥品生物制品檢定所),水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1供試液的制備

2.1.1對照品溶液的制備 精確稱取左旋紫草素對照品0.0025 g,置于容量瓶中,用無水乙醇溶解,定容至50 ml,得到濃度為0.05 mg·ml-1的對照品儲備液，備用。

2.1.2泰山紫草總萘醌的提取 稱取干燥后的泰山紫草粗粉(10目)樣品粉末10.00 g，置圓底燒瓶中，在一定的乙醇體積分數、提取時間、料液比條件下，超聲法提取總萘醌，提取液冷卻濃縮，離心，取上清液置于量瓶中，乙醇定容至50 ml，作為待測液。

2.2總萘醌的測定

2.2.1標準曲線的制備 精密量取左旋紫草素對照品液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml分別置于的容量瓶中,用無水乙醇定容至10 ml,搖勻。在516 nm處測定吸光度,并以吸光度為縱坐標(Y),左紫草素對照品濃度為橫坐標(X),做回歸曲線,得回歸方程Y=24.946X-0.0059,r=0.9994,結果表明，左旋紫草素的質量濃度在5～25 mg·ml-1的范圍內與吸光度呈現出良好的線性關系。

2.2.2泰山紫草中總萘醌的含量測定 精密量取上述樣品供試液2 ml，按“2.2.1”項下的操作方法，再計算出樣品中總萘醌的量。

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗 精密量取左旋紫草素對照品液2 ml，置于10 ml的容量瓶中，加乙醇定容至刻度，搖勻，按“2.2.1”項下的方法測定待測溶液在516 nm處的吸光度，RSD=2.32%(n=6)，結果表明實驗儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液2.0 ml，按“2.2.1”項下方法操作，于0 h,0.5 h,1.0 h,2.0 h,4.0 h,6.0 h，8.0 h測定吸光度，計算 RSD=1.71%，結果表明供試液在8 h內穩(wěn)定。

2.3.3重復性試驗 取同一泰山紫草提取液6份，每份2 ml，按“2.2.1”項下方法操作，測定溶液在516 nm處的吸光度，計算RSD=2.89%，表明該方法的重復性良好。

2.3.4加樣回收率試驗 取已知含量的泰山紫草提取液6份，每份加入左旋紫草素對照品液1 ml，按照“2.2.1”項下方法操作，測定溶液在516 nm處的吸光度，測得平均回收率為98.92%，計算RSD=1.53%。

2.4單因素試驗

2.4.1提取時間對泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉5份，每份5.0 g，分別加入10倍量的80%乙醇溶液，分別超聲輔助提取5 min、10 min、15 min、30 min和45 min，按“2.2.1”項下操作，于516 nm處測定提取液吸光度，并計算出總萘醌的含量，結果見圖1。如圖所示隨著提取時間的延長，總萘醌提取量隨之增加，當提取時間為30 min時達到最大值，之后，總萘醌的提取量趨于穩(wěn)定，故選取提取時間為30 min。

表1 因素與水平表

表2 設計方案及結果

表3 方差分析結果

圖1 提取時間與提取率的關系

2.4.2乙醇體積分數對泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉6份，每份5.0 g，分別加入10倍量的50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液超聲提取15 min，按“2.2.1”項下操作，于516 nm處測定提取液吸光度，并計算出總萘醌的含量，結果見圖2。隨著乙醇體積分數的升高泰山紫草總萘醌的提取率也增大,當乙醇得體積分數為80%時，總萘醌的提取率為最大值，隨著乙醇體積分數的增高，總萘醌的提取率開始下降。因此, 確定提取時選擇乙醇體積分數在80%左右。

圖2 乙醇體積分數與提取率的關系

2.4.3料液比對泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉5份，每份5.0 g，分別用5、10、15、20、30倍體積的80%乙醇溶液，分別超聲提取15 min，按“2.2.1”項下操作，于516 nm處測定提取液吸光度，并計算出總萘醌的含量，結果見圖3。隨著料液比體積的增加，總萘醌提取率也隨之增加，當溶劑達到一定量之后，再增加溶劑的量，對總萘醌提取率影響不大，由于加大溶劑的量，會提高提取的成本，故料液比選擇15倍體積。

圖3 料液比與提取率的關系

2.4.4提取次數對泰山紫草總萘醌提取率的影響 稱取泰山紫草粗粉3份，每份5.0 g，分別用15倍體積的80%乙醇溶液，分別超聲輔助提取20 min，分別提取1,2,3次，按“2.2.1”項下操作，于516 nm處測定提取液吸光度，并計算出總萘醌的含量。隨著提取次數的增加，總萘醌提取率也隨之增加，提取次數為2次和3次的總萘醌提取率非常相近，說明總萘醌提取率已經接近最高，考慮到隨著提取次數的增加，溶劑的使用量也增加,溶劑回收成本增高,且隨著提取次數增加,雜質成分也隨之增多,會影響泰山紫草總萘醌的提取效果，綜合考慮,確定提取2次較為合理。

2.5工藝優(yōu)化試驗

2.5.1實驗設計與結果 在前期單因素試驗的基礎上，根據效應面實驗設計原理，以泰山紫草總萘醌提取率為響應值，選擇乙醇體積分數、提取時間和液料比為考察因素，每個因素設三個水平，試驗水平因素安排見表1，設計方案及結果見表2。

2.5.2模型擬合[4]以泰山紫草總萘醌提取率為響應值，采用Design Expert軟件對試驗結果進行回歸分析，得到乙醇體積分數、提取時間和液料比對總萘醌提取率影響的二項式方程，擬合后，得到回歸模型方程為：Y=3.2720+0.2038 A+0.2163 B+0.2450 C+0.1100 AB-0.0325 AC+2.500 BC-0.3435 A2-0.2835 B2-0.1260 C2。

對該模型進行回歸方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，該模型P<0.0001，表明實驗所得的回歸模型方程極顯著。在本實驗設定的區(qū)域范圍內，乙醇體積分數、提取時間和料液比的P值均<0.001，對總萘醌得率的影響極顯著。乙醇體積分數二次項和提取時間二次項和的P值均<0.0001，料液比二次項P值<0.01，整體模型P值<0.0001達到極顯著水平，失擬項不顯著，說明該模型擬合性較好。

2.5.3效應面優(yōu)化和預測 根據回歸模型方程，將乙醇體積分數、料液比和提取時間對泰山紫草總萘醌提取率的影響繪制成響應面圖4。

圖4 乙醇體積分數、料液比和提取時間對總萘醌提取率的響應面圖

由圖4可知，對乙醇體積分數對總萘醌提取率的影響最為顯著，其次是提取時間，料液比對總萘醌提取率的影響最小。根據模型分析結果及相應的響應面圖和等高線圖，確定總萘醌提取的最佳工藝條件：乙醇體積分數為82.76%，料液比為1∶17.73(g·ml-1)，提取時間為 32.25 min，提取2次。根據實驗操作的可行性，將提取工藝修正為：乙醇體積分數為80%，料液比為1∶18(g·ml-1)，提取時間為30 min，超聲提取2次。 在此條件下，測得總萘醌提取率為3.384%(n=5，RSD=1.09%)，與理論預測值3.371%接近，說明該模型能較真實地反映各因素對總萘醌提取率的影響，模型方程可靠，具有實用價值。

3 討 論

本實驗通過單因素分別考察了提取時間、乙醇體積分數、料液比和提取次數對總萘醌提取率的影響，確定了影響得率的主要因素。由于星點設計-響應面優(yōu)化法是采用非線性數學模型擬合，并在中心點進行重復性試驗，可以提高實驗精確度，更好地體現各因素、指標與效應值的關系等特點[5]，故本實驗采用Box-Behnken效應面法設計響應面實驗，建立了模型，并通過方差分析，得出各個因素之間的交互作用都較強，影響泰山紫草總萘醌得率的因素依次為主次關系依次為乙醇體積分數，提取時間，料液比。實驗確定了提取總萘醌的最佳工藝條件，即乙醇體積分數為80%，料液比為1∶18(g·ml-1)，提取時間為30 min，提取2次。該模型準確有效。

[1] 王光輝,王琦,時元林.泰山四大名藥[J].山東中醫(yī)雜志, 2006, 25(3):203-204.

[2] 賀銳銳，劉永剛，魏敏吉，等.紫草組分的抗腫瘤活性及其凋亡機制研究[J].中國臨床藥理學雜志,2012,28(1)：43-45.

[3] 戴冰,冷旺,鄒雙華,等.新疆軟紫草系統(tǒng)溶劑法提取工藝研究[J].中成藥,2008,30(10):1461-1464.

[4] 蘭艷素，李長江，宋坤鵬，等．星點設計-效應面法優(yōu)化百蕊草總黃酮提取工藝[J].中成藥，2014,36(12):2629-2632.

[5] 劉艷杰,項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用[J].中國現代應用藥學雜志,2007,24(6):455-457.

Optimization of extraction technology for total naphthoquinones from lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc. by Box-Behnken design

WANGXin-huiLIWeiZHANGYan-yunLIULi-jingQUXiao-lan

(Pharmacy College,Taishan Medical University,Taian 271016,China)

Objective: To optimize the extraction technology for total naphthoquinones from Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc by Box-Behnken design.Methods:Based on the results of single-factor experiment, Box-Behnken experimental design combined with response surface methodology was employed, investigatine the ethanol concentration, solid-liquid ratio,and extraction time affecting the extraction process,the extraction rate of total naphthoquinones indicators. The total naphthoquinone content by UV spectrophotometer.Results: The optimization processing parameters was as follows: ultrasonic extracted 30min with 18 times the amount of 80% ethanol and extract twice, respectively. The extraction rate of total naphthoquinones was 3.384%. Conclusion:Box-Behnken experimental designis feasible, and highly predictive.

Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc;total naphthoquinones;Box-Behnkend-design; extraction process

山東省教育廳科技計劃項目(編號：J16LM10)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(編號：2013255)；泰山地產中藥研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心基金(編號：zd099)。

王新慧，女，2013級中藥學專業(yè)在校本科生。

曲曉蘭，女，碩士，副教授，主要從事中藥藥效物質基礎研究。

R931.6

A

1004-7115(2017)12-1324-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.002

2017-08-05)