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(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東廣州510610)

蠶蛹蛋白肽酶水解條件優(yōu)化

黃美佳1,2,程劍鋒2,戴燕2,楊帆1,2,徐玉娟3,鄒宇曉3,李欣1,2,*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東廣州510610)

為了降低蠶蛹過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn),提高蠶蛹優(yōu)質(zhì)蛋白利用價(jià)值并制備免疫活性肽,對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行了酶解優(yōu)化。本文選用菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶這5種酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白進(jìn)行酶解。通過(guò)對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖和水解度的檢測(cè),選取最佳蛋白酶。在此基礎(chǔ)上對(duì)最佳蛋白酶的四個(gè)單因素(酶和底物量,初始pH,水解溫度和底物濃度)進(jìn)行優(yōu)化,從而確定最佳的酶解條件。結(jié)果表明，5種蛋白酶中堿性蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的酶解效果最好。對(duì)堿性蛋白酶進(jìn)一步優(yōu)化,通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)和回歸分析獲得堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最佳條件為加酶量=6.0%,溫度=55 ℃,酶解時(shí)間=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1,測(cè)得的水解度為19.96%±1.02%,免疫活性O(shè)D490 nm為0.2512±0.0125。

蠶蛹蛋白,肽,酶解,優(yōu)化

蠶蛹是一種化學(xué)成分含量較為復(fù)雜的蠶蛾的蛹,因其所富含人體必需的8種氨基酸且比例均衡[1],符合由世界衛(wèi)生組織提出的氨基酸最佳組合模式[2],是一種優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白來(lái)源,在中國(guó)、韓國(guó)、日本、泰國(guó)和印度等亞洲地區(qū)成為了一種較受歡迎的食物[3-4]。此外,它還含有大量油脂[5]、多糖、溶菌酶和激素等生物活性類物質(zhì)[6]以及鐵、鋅、銅、錳、硒等微量元素[7-8]。蠶蛹具有比較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,因此可以將它作為一種生產(chǎn)具備生物活性功能產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料[9]。

蛋白酶水解蛋白質(zhì)是指在一定的條件下斷裂蛋白肽鍵,將大分子蛋白水解成小分子肽段的過(guò)程,它可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性位點(diǎn)切割,最終使蛋白質(zhì)肽鏈長(zhǎng)度縮短、極性基團(tuán)數(shù)目增加、疏水基團(tuán)暴露和平均分子質(zhì)量降低[10],形成較多的生物活性肽。它是一種具有特殊生理功能的氨基酸肽段,一般由幾個(gè)到數(shù)十個(gè)氨基酸組成[11]。脫脂蠶蛹蛋白富含18種氨基酸以及多種生物活性類物質(zhì)[12],為了提高蠶蛹蛋白的利用價(jià)值,降低蠶蛹過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)且獲得活性肽,本文通過(guò)酶解優(yōu)化制備具有特殊生理功能的生物活性肽,也為脫脂蠶蛹的免疫活性肽制備提供理論基礎(chǔ)。酶解可將蛋白分解成肽段,既能降低過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn),又能獲得活性肽。王艷[13]等人研究表明不同蛋白酶水解后,蛋白的致敏性降低。Maria[14]等人研究發(fā)現(xiàn)胃腸蛋白酶酶解后,蛋白的潛在致敏性降低。優(yōu)質(zhì)的蠶蛹蛋白會(huì)引起部分人群過(guò)敏,使蠶蛹在食品領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制,本實(shí)驗(yàn)將蠶蛹蛋白進(jìn)行酶解優(yōu)化,擴(kuò)大其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用也為降低潛在致敏性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶蛹 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究院;菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶(酶活均為20萬(wàn)U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;低分子量Marker 美國(guó)Thermo公司;鄰苯二甲醛 Sigma公司;DTT、考馬斯亮藍(lán)G250 上海生工;胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基 北京索萊寶公司;NaOH、HCl等常規(guī)化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;HJ-A6恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州邁科諾儀器有限公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本三洋公司;Mode 1860酶標(biāo)儀、PowerPac 3000電泳儀、Quantity One凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最優(yōu)蛋白酶的篩選 將蠶蛹清洗除油制備脫脂蠶蛹蛋白粉[15],蠶蛹清洗脫脂得到的蠶蛹蛋白粉,用考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白濃度為6.9 mg/mL。稱取一定量脫脂蠶蛹蛋白粉,用PBS(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液)稀釋后攪拌均勻,用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調(diào)節(jié)體系酸度至各蛋白酶最適pH范圍,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設(shè)定溫度。迅速加入己準(zhǔn)備好的蛋白酶(菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶)溶液進(jìn)行酶解,酶解過(guò)程中不斷滴加HC1或NaOH溶液以保持體系恒定的pH,在水浴中反應(yīng)15、30、60、90、120、150、180、240 min后取出,沸水浴滅酶10 min后得到蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物[16],冷卻后將酶解液的pH調(diào)至7.0,然后以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液冷藏備用[17]。表1是說(shuō)明書(shū)推薦的各蛋白酶在蒸餾水中酶解的最適條件以及酶活。

表1 各蛋白酶酶解最適條件Table 1 The optimum conditions of protease hydrolysis

1.2.2 水解度的測(cè)定 酶解過(guò)程中水解度的測(cè)定采用鄰苯二甲醛(OPA)法并加以改進(jìn)[13,18]。具體方法為:以精氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取400 μL樣品溶液加入到盛有3 mL OPA的離心管中,混勻5 s,避光反應(yīng)2 min,同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn),未水解樣代替,340 nm下測(cè)定吸光值,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水解度如下:

h=(ht-hc)×DF

DH(%)=h/htot×100

式中,ht-樣品的吸光度從標(biāo)曲上查得的濃度;hc-對(duì)照品(未水解樣品)的吸光度從標(biāo)曲上查得的濃度;htot-全部酶解液的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度;DH-樣品的水解度;DF-樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.3 酶解多肽對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖檢測(cè) 2只5周齡健康的18～20 g BAL B/C小白鼠,頸椎脫臼處死,置于消毒酒精中,10 min后在超靜臺(tái)中解剖分離出小鼠脾臟。然后碾碎并過(guò)100目尼龍細(xì)胞篩,加入10 mL不完全培養(yǎng)基RPMI-1640,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,1000 r/min離心5 min后棄上清,重復(fù)2次。加入3～4 mL紅細(xì)胞裂解液,5 min后加入不完全培養(yǎng)基RPMI-1640重懸脾細(xì)胞,1000 r/min離心5 min棄上清,重復(fù)1次,加入含0.1 mg/mL胎牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI-1640約2 mL。往0.15 mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液中加入等體積的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。稀釋細(xì)胞濃度為1～2×106cell/mL后,加入到96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中。蠶蛹酶解液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,以400 μg/mL濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中刺激脾細(xì)胞。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(滅活的酶溶液)和空白對(duì)照組(生理鹽水)。培養(yǎng)72 h后每孔加入0.01 mL MTT溶液(0.5%,w/v),繼續(xù)在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,1000 r/min離心10 min后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入0.1 mL DMSO后置于搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。由酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的OD值。另設(shè)一組陰性對(duì)照組和調(diào)零孔(不加細(xì)胞)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 最優(yōu)酶解條件的優(yōu)化

1.2.4.1 初始pH對(duì)蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g 蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL緩沖液,混合攪拌均勻,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調(diào)節(jié)體系pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設(shè)定溫度,50 ℃下分別加入E0/S0為5.0%的酶進(jìn)行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物,冷卻后將酶解液的pH調(diào)至7.0,然后以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液冷藏備用。測(cè)定各酶解液的水解度和對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖。

1.2.4.2 加酶量對(duì)蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g 蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL緩沖液,混合攪拌均勻,使用 1 mol/L 的NaOH(或1 mol/L HCl)調(diào)節(jié)體系酸度至各蛋白酶最適pH,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設(shè)定溫度。50 ℃下分別加入E0/S0為1.5%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%的酶進(jìn)行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物,冷卻后將酶解液的pH調(diào)至7.0,然后以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液冷藏備用。測(cè)定各酶解液的水解度和對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖。

1.2.4.3 料水比對(duì)蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,分別與緩沖液以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例,混合攪拌均勻,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調(diào)節(jié)體系酸度至各蛋白酶最適pH,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設(shè)定溫度。在50 ℃下加入E0/S0為5.0%的酶進(jìn)行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物,冷卻后將酶解液的pH調(diào)至7.0,然后以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液冷藏備用。測(cè)定各酶解液的水解度和對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖。

圖2 風(fēng)味蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.2 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of flavourzyme to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

1.2.4.4 水解溫度對(duì)蠶蛹蛋白酶解制備活性多肽的影響 取2.5 g蠶蛹蛋白于250 mL三角瓶中,加入50 mL緩沖液,混合攪拌均勻,使用1 mol/L的NaOH(或1 mol/L HCl)調(diào)節(jié)體系酸度至各蛋白酶最適pH,并于恒溫水浴器上攪拌加熱恒溫至設(shè)定溫度。分別在45、50、55、60、65 ℃下加入E0/S0為5.0%的酶進(jìn)行酶解,1.5 h后取出,滅酶后得到蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物,冷卻后將酶解液的pH調(diào)至7.0,然后以8000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,取上清液冷藏備用。測(cè)定各酶解液的水解度和對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖。

1.2.5 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)pH、酶解時(shí)間(h)和水/底物三個(gè)因素設(shè)計(jì)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn),因素和水平表如表2所示。

表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)的因素和水平表Table 2 Factors and levels table of the Box-Behnken center combination experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)都以平均值的形式表示,每個(gè)測(cè)試都重復(fù)三次,結(jié)果采用SPSS statistical軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)蛋白酶的篩選

圖1為本實(shí)驗(yàn)所選用的5種蛋白酶酶液和脫脂蠶蛹蛋白酶解前液以及PBS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫活性在OD490處的吸光值。從圖1可知,5種蛋白酶液、脫脂蠶蛹蛋白酶解前液以及PBS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫活性均不高,統(tǒng)計(jì)分析表明,酶解前液與堿性蛋白酶、中性蛋白酶及菠蘿蛋白酶相比存在顯著性差異(p<0.05),這為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)空白參考。近年來(lái),李高揚(yáng)[19]等人選用5種不同的酶酶解蠶蛹蛋白,以DPPH清除能力為指標(biāo)對(duì)酶解過(guò)程進(jìn)行分析。楊梅琳[20]選用6種蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白酶解,酶解后的多肽通過(guò)對(duì)其水解度和清除自由基的能力的測(cè)定來(lái)選擇最優(yōu)酶。而本文通過(guò)測(cè)定水解度和免疫活性來(lái)確定最優(yōu)條件。

圖1 不同蛋白酶液、脫脂蠶蛹蛋白酶解前液以及PBS的免疫活性Fig.1 The immunological activity of different protease solutions,pre-enzymatic hydrolysis of defatted silkworm pupa and PBS

圖3 菠蘿蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.3 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of bromelain to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖4 堿性蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.4 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of alkaline protease to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖5 木瓜蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.5 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of papain to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖6 中性蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.6 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of neutral protease to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein and SDS-PAGE patterns

圖2～圖6分別為風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白在15、30、60、90、120、150、180、240 min時(shí)的水解度和免疫活性及SDS-PAGE圖譜(圖2中風(fēng)味蛋白酶做了0 min時(shí)的SDS-PAGE圖譜,其他酶的0 min與其相同)。從圖中可以看出,風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度明顯高于菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶,其中以堿性蛋白酶對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度略高于風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶。而對(duì)于酶解脫脂蠶蛹蛋白肽的免疫活性,堿性蛋白酶和中性蛋白酶明顯高于其他三種蛋白酶,其中堿性蛋白酶最大值略高于中性蛋白酶,綜合考慮水解度和酶解肽的免疫活性,本實(shí)驗(yàn)選用堿性蛋白酶作為酶解脫脂蠶蛹蛋白的優(yōu)勢(shì)酶。并由圖4可知,當(dāng)酶解時(shí)間選用90 min時(shí),酶解脫脂蠶蛹蛋白肽的免疫活性最強(qiáng),因此,在后續(xù)的對(duì)酶解條件的初步優(yōu)化過(guò)程中,我們將選用該酶解時(shí)間進(jìn)行對(duì)其它實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。采用SPSS statistical軟件分析得到:風(fēng)味蛋白酶在酶解90 min時(shí)水解度與其他各時(shí)間都存在顯著性差異(p<0.05),免疫活性在60、90 min與150、180、240 min存在顯著性差異(p<0.05);菠蘿蛋白酶在酶解60、90 min與150、180、240 min的水解度存在顯著性差異(p<0.05),180 min時(shí)免疫活性與其他存在顯著性差異(p<0.05);堿性蛋白酶各時(shí)間的水解度均存在顯著性差異,90 min與其他各時(shí)間的免疫活性存在顯著性差異(p<0.05);木瓜蛋白酶60、90 min與150、180、240 min的水解度存在顯著性差異,免疫活性60 min與15、240 min存在顯著性差異(p<0.05);中性蛋白酶在90 min的水解度與其他存在顯著性差異,15 min免疫活性與其他存在顯著性差異(p<0.05)。

2.2 堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白粉的初步優(yōu)化

通過(guò)以上對(duì)幾種蛋白酶的酶解分析,選用堿性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),且圖4確定堿性蛋白酶最佳酶解時(shí)間為90 min。劉旭輝[21]也用堿性蛋白酶通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出蠶蛹蛋白肽酶解最優(yōu)工藝條件。圖7～圖10分別為pH、加酶量、料水比和溫度對(duì)脫脂蠶蛹蛋白在90 min時(shí)堿性蛋白酶的水解度和免疫活性及SDS-PAGE圖譜。脫脂蠶蛹蛋白在pH7.0～9.0范圍內(nèi)的水解度以及水解肽的免疫活性變化如圖7所示,由圖7可知,水解度以及水解肽的免疫活性都呈先上升后下降的趨勢(shì),且在pH8.0處達(dá)到最大值。水解度在pH7.0、7.5與pH8.0時(shí)存在顯著性差異(p<0.05),免疫活性無(wú)顯著性差異。

脫脂蠶蛹蛋白在加酶量1.5%～7.5%范圍內(nèi)的水解度以及水解肽的免疫活性變化如圖8所示,由圖8可知,水解度以及水解肽的免疫活均以先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì),經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出,堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最優(yōu)加酶量為6.0%。水解度和免疫活性均無(wú)顯著性差異。

脫脂蠶蛹蛋白在料水比1∶10～1∶30范圍內(nèi)的水解度以及水解肽的免疫活性變化如圖9所示,由圖9可知,水解肽的免疫活性變化趨勢(shì)不明顯,略有先上升后下降的趨勢(shì),且在料水比1∶20處略高于1∶15和1∶25,然而對(duì)于水解度則呈現(xiàn)明顯的先上升后下降趨勢(shì),在1∶20處達(dá)到最大值。水解度在1∶20、1∶15、1∶25與1∶30存在顯著性差異(p<0.05);免疫活性不存在顯著性差異。由結(jié)果推斷當(dāng)料水比過(guò)高時(shí),蛋白濃度太高酶解表位可能疊在一起,影響其作用效果:當(dāng)料水比過(guò)低時(shí),酶濃度就會(huì)相應(yīng)降低,影響其水解度。

最后一組(圖10)為脫脂蠶蛹蛋白在溫度45～65 ℃范圍內(nèi)的水解度以及水解肽的免疫活性變化趨勢(shì),由圖10可知,水解度以及水解肽的免疫活性對(duì)這區(qū)間溫度的變化并不十分明顯,總體有上升后下降的趨勢(shì),經(jīng)過(guò)此單因素實(shí)驗(yàn)得出,堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最優(yōu)溫度為55 ℃。水解度在55 ℃與65 ℃存在顯著性差異(p<0.05),免疫活性均無(wú)顯著性差異。

圖7 不同 pH對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.7 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at different pH conditions and SDS-PAGE patterns

圖8 加酶量對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.8 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at different enzymatic contents and SDS-PAGE patterns

圖9 料水比對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.9 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at the different proportion of substrate and water conditions and SDS-PAGE patterns

圖10 溫度對(duì)脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性的影響以及SDS-PAGE圖譜Fig.10 Effects of the degree of hydrolysis and immune activity of the defatted silkworm pupa protein at the different temperature conditions and SDS-PAGE patterns

2.3 堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白條件的進(jìn)一步優(yōu)化

因選用酶解溫度在55 ℃上下以及加酶量在6.0%上下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大,所以選用酶解時(shí)間、酶解pH和料水比三個(gè)因素作為優(yōu)化的因素,以脫脂蠶蛹蛋白的水解度和免疫活性(OD490)作為結(jié)果值。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)[22-23]結(jié)果如表3所示,利用軟件Design-Expert 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,得到水解度R1和免疫活性R2對(duì)酶解時(shí)間(A)、酶解pH(B)和水/底物(C)三個(gè)因素的回歸方程:

R1=17.70+3.55A-0.71B-1.15C+0.42AB+0.16AC+0.59BC-0.061A2-1.12B2-2.03C2

R2=0.26+0.00714A+0.0000388B+0.000208C+0.00358AB+0.00463AC+0.00214BC-0.011A2-0.013B2-0.00798C2

表3 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

由回歸分析結(jié)果(表4、表5)可知,水解度和免疫活性兩個(gè)回歸模型的p值均小于0.01,說(shuō)明該模型具有高度顯著水平(p<0.01),水解度的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9175,免疫活性的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9076,這說(shuō)明該兩個(gè)回歸方程的可信度高,水解度的失擬項(xiàng)p=0.3257>0.05以及免疫活性的失擬項(xiàng)p=0.3218>0.05,均為不顯著,說(shuō)明該回歸方程的擬合度高。由模型的顯著性檢驗(yàn)可知,對(duì)于水解度模型,酶解時(shí)間的一次項(xiàng)以及水與底物比的二次項(xiàng)為極顯著(p<0.01),水/底物的一次項(xiàng)以及pH的二次項(xiàng)為顯著(p<0.05);對(duì)于免疫活性模型,酶解時(shí)間的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)以及pH和水/底物的二次項(xiàng)為極顯著(p<0.01)。由回歸方程R1和R2可知,三個(gè)因素A、B、C的一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小均為A>C>B,這說(shuō)明酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度以及免疫活性的影響最大,其次為水/底物,pH影響最小。

表4 水解度回歸分析Table 4 Regression analysis results of degree of hydrolysis

表5 免疫活性回歸分析Table 5 Regression analysis results of immune activity

根據(jù)圖11和圖12可知,酶解時(shí)間對(duì)于水解度的影響逐漸增加,而對(duì)酶解液的免疫活性則是先升高,而后下降,而對(duì)于pH和料水比,不管是對(duì)于水解度還是免疫活性,都呈拋物線形式,先升高后回落。

由軟件Design-Expert 8.0對(duì)兩回歸曲線的精確計(jì)算,得到堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最佳工藝參數(shù)為:酶解時(shí)間=1.96 h,pH=8.03,料水比=1∶20.16,且在此最佳條件下,預(yù)測(cè)酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度為20.87%,免疫活性O(shè)D490為0.2598。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性并方便實(shí)驗(yàn)條件,在酶解溫度=55 ℃,加酶量=6.0%,酶解時(shí)間=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1的條件下對(duì)脫脂蠶蛹蛋白進(jìn)行了三次酶解實(shí)驗(yàn),測(cè)得的平均水解度為19.96%±1.02%;平均免疫活性O(shè)D490為0.2512±0.0125,與模型預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在0.09%以下。因此,該響應(yīng)面對(duì)酶解條件的優(yōu)化準(zhǔn)確可靠。

圖11 三因素對(duì)酶解脫脂蠶蛹蛋白的水解度三維響應(yīng)面圖Fig.11 Three-dimensional response surface of three factors to the degree of hydrolysis of the defatted silkworm pupa protein注:A:固定水/底物為20∶1;B:固定pH為8.0;C:固定酶解時(shí)間為1.5 h。

圖12 三因素對(duì)酶解脫脂蠶蛹蛋白的免疫活性三維響應(yīng)面圖Fig.12 Three-dimensional response surface of three factors to the immune activity of the defatted silkworm pupa protein注:A:固定水/底物為20∶1;B:固定pH為8.0;C:固定酶解時(shí)間為1.5 h。

3 結(jié)論

選用了5種不同的酶來(lái)酶解脫脂蠶蛹蛋白,綜合考慮水解度和酶解肽的免疫活性,選用堿性蛋白酶作為酶解脫脂蠶蛹蛋白的優(yōu)勢(shì)酶。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)和回歸分析,得出堿性蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最佳工藝參數(shù)為:加酶量6.0%,溫度55 ℃,酶解時(shí)間=2.00 h,pH=8.0,水∶底物=20∶1,在此條件下平均水解度為19.96%±1.02%;平均免疫活性O(shè)D490為0.2512±0.0125。酶解可將蠶蛹蛋白分解成小肽段,可能大量破壞其結(jié)合表位,既能降低過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn),又能獲得活性肽。因此,實(shí)驗(yàn)對(duì)蠶蛹蛋白的酶解條件對(duì)潛在致敏性的研究有重要意義,同時(shí)給低致敏蠶蛹食品提供一定的理論依據(jù),為后續(xù)脫脂蠶蛹的免疫活性肽制備提供理論基礎(chǔ)。

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權(quán)威·核心·領(lǐng)先·實(shí)用·全面

Optimizationofthepeptidefromsilkwormpupaproteinbyenzymatichydrolysis

HUANGMei-jia1,2,CHENGJian-feng2,DAIYan2,YANGFan1,2,XUYu-juan3,ZOUYu-xiao3,LIXin1,2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Department of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China; 3.Sericultural and Agri-Food Research Institute GAAS,Guangzhou 510610,China)

In order to reduce the risk of silkworm allergic reaction,to improve the use of high-quality protein and the preparation of immunoactive peptide,the enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein was optimized. For the preparation of immunoactive peptide,the five kinds of enzymes(bromelain,alkaline protease,neutral protease,flavourzyme,papain)were selected to hydrolyze the defatted silkworm pupa protein. By the detection of spleen cell proliferation and the degree of hydrolysis,the optimal enzyme were determined. On the basis of that,the optimal condition was identified with four singe-factors of hydrolysis(E0/S0,pH,temperature and substrate concentration). The results showed that alkaline protease was the optimal enzyme and the optimum conditions of defatted silkworm pupa protein by alkaline protease enzyme was as that of the amount of enzyme=6.0%,temperature=55 ℃,enzymolysis time=2.00 h,pH=8.0,water∶substrate=20∶1.The degree of hydrolysis was 19.96%±1.02% and immunoreactive OD490 nmwas 0.2512±0.0125.

silkworm pupa protein;peptide;enzymatic hydrolysis;optimization

2017-04-11

黃美佳(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:1049850344@qq.com。

*通訊作者:李欣(1980-)，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:zhizilixin@ncu.edu.cn。

2013年廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研專項(xiàng)資金(2013B090600060)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA102205)； 國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31260204，31301522)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0092-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.019